Linfodenectomía mesentérica murina por alteración selectiva de la comunicación linfática con el intestino específico de la región

Resumen

Este protocolo describe un procedimiento de supervivencia para una linfadenectomía mesentérica murina segura y bien tolerada en cada una de las cuatro estaciones a lo largo de la cadena de ganglios linfáticos mesentéricos. Este procedimiento es adaptable para permitir la interrupción selectiva de la comunicación linfática con el colon distal, el colon proximal y/o el intestino delgado.

Resumen

La inmunovigilancia frente a la tolerancia al antígeno es un equilibrio delicado dentro del microambiente intestinal, durante el cual se conoce bien el papel crítico de la cebado de células T circulantes dentro de los ganglios linfáticos locales. Tras la cebado de células T, la literatura reciente ha comenzado a demostrar un papel único y no redundante de las células T no circulantes que residen en el ganglio linfático drenante de un órgano. Esto puede ser especialmente cierto en el intestino, donde se sabe que el drenaje linfático es muy específico. Sin embargo, para comprender realmente el impacto único de estas células locales frente a la redundancia funcional sistémica, la comunidad científica necesita un procedimiento bien descrito para aislar y perturbar selectivamente estos nodos. Aquí se describe un procedimiento de supervivencia para una linfadenectomía mesentérica murina segura y bien tolerada en cada una de las cuatro estaciones a lo largo de la cadena de ganglios linfáticos mesentéricos. Este procedimiento es adaptable para permitir la interrupción selectiva de la comunicación linfática con el colon distal, el colon proximal y/o el intestino delgado. Se incluyen instrucciones detalladas, ayudas visuales, consejos útiles para mejorar el éxito y soluciones para la supervivencia subóptima. Los ganglios linfáticos resecados están inmediatamente listos para un procesamiento posterior si se desea. Esta técnica es más adecuada para estudios que requieren la interrupción selectiva del drenaje linfático desde el colon distal, el colon proximal y/o el intestino delgado.

Introducción

Las células T son uno de los principales tipos de células efectoras en la inmunidad adaptativa, con roles descritos en diversas categorías de enfermedades, incluyendo infecciones, autoinmunidad y ^{malignidad 1,2,3}. Un paso crítico para la funcionalidad de las células T es el cebado trifásico por las células presentadoras de antígenos dentro de órganos linfáticos secundarios, como los ganglios linfáticos^{locales 4}. En la medicina moderna, una base fundamental de una correcta resección oncológica en múltiples sistemas orgánicos incluye cierto grado de muestreo local o resección de ganglios linfáticos en^bloque 5,6,7,8. Por ejemplo, en el cáncer de colon, las directrices consensuadas recomiendan extirpar y examinar 12 ganglios linfáticos en la resección con intención curativa debido a una clara correlación con una mejora en la supervivencia a largo^{plazo 6,7}. Sin embargo, ¿se pueden resecar realmente los ganglios linfáticos locales con total impunidad? Estudios recientes en ratones han demostrado que el ganglio linfático drenador del tumor contiene un reservorio de precursores antitumorales de células T, que pueden protegerse de la diferenciación terminal y el agotamiento de células T que ocurren en el microambiente^{tumoral 9,10,11}. Esto sugeriría que eliminar a una población tan crítica podría reducir las capacidades de inmunovigilancia en curso.

Se sabe que el patrón de drenaje linfático intestinal en ratones es bastante especializado a lo largo de la cadena mesentérica de los ganglios linfáticos; por ejemplo, el colon proximal es drenado casi exclusivamente por la primera estación ganglio linfático, el intestino delgado por la segunda/tercera estación, y el colon distal predominantemente por^{la estación} 12 del cuarto ganglio linfático (Figura 1, Figura Suplementaria 1). Así, la comunicación directa entre los segmentos intestinales y los linfáticos puede verse interrumpida con una ablación dirigida de estos ganglios. Para bloquear el tráfico entre ganglios linfáticos y tejidos, se utilizan comúnmente agonistas de los receptores S1P, como FTY720, y bloqueo de integrina; sin embargo, estos fármacos inhiben en gran medida el tráfico y, por tanto, no pueden utilizarse para investigar la contribución de ganglios linfáticos^{específicos 13,14}. Sin embargo, la capacidad de la comunidad científica en general para estudiar el efecto local de las interacciones inmunitarias en los ganglios linfáticos intestinales está limitada por la ausencia de una resección quirúrgica bien descrita para cada estación. Teniendo en cuenta esta carencia, se desarrolló un procedimiento de supervivencia para la linfadenectomía mesentérica murina en cada estación gangliona, que se describe aquí. El objetivo general de este procedimiento es lograr la excisión segura y fiable de la(s) estación(s) de ganglios linfáticos mesentéricos en ratones con alta supervivencia y tolerancia postoperatoria.

Este procedimiento ha sido probado y se realiza fácilmente en ratones juveniles y adultos de múltiples cepas (es decir, Balb/c, C57BL/6J, 129S4), pero está limitado por la necesidad de ganglios linfáticos accesibles y fácilmente identificables. Por lo tanto, puede no ser adecuado para combinarse con modelos murinos o genotipos con ganglios linfáticos más pequeños o imperceptibles de lo habitual (por ejemplo, ratones deficientes en linfotoxinas alfa)¹⁵. Además, los ratones mayores (>15 semanas) tienden a tener una adiposidad visceral más intensa, lo que dificulta la identificación y aislamiento de ganglios linfáticos, y aunque esto no es una contraindicación, puede limitar el éxito o el procedimiento. Aparte de estas limitaciones, la linfadenectomía mesentérica ofrece una perturbación altamente controlada y selectiva de los ganglios linfáticos. Este procedimiento sería el más adecuado para resolver preguntas sobre el efecto local de los ganglios linfáticos y sus células inmunitarias residentes asociadas e interacciones sobre segmentos del intestino (por ejemplo, colon proximal, colon distal, intestino delgado).

Figura 1: Hitos anatómicos de las estaciones en la cadena de ganglios linfáticos mesentéricos. (A) Representación no etiquetada y (B) etiquetada de cuatro principales estaciones de ganglios linfáticos mesentéricos in situ. El drenaje proximal del colon se realiza predominantemente a través de la estación 1, el intestino delgado es predominantemente la estación 2/3 y el colon distal es predominantemente la estación 4. (DC = colon distal, ICV = vasos ileocólicos, PC = colon proximal, CEC = ceco, IV/JV = vasos ileales/jeyuales, SI = intestino delgado). Barras de escala: 1,5 cm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Protocolo

Todos los procedimientos se realizan en cumplimiento con los protocolos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Yale. Para desarrollar este procedimiento, se utilizaron cepas C57BL/6 de 8-12 semanas, ratones de tipo salvaje y controles simulados emparejados con edad/sexo/genotipo. Se incluyeron tanto ratones machos como hembras. El peso corporal oscilaba entre 18 y 25 g. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de instrumentos, animales y el quirófano

1. Esteriliza todos los instrumentos quirúrgicos. Asegúrese de que la superficie de operación y el cono nasal anestésico estén limpios con etanol al 70%.
2. Instala la máquina de vaporizador de anestésico inhalado con un cono nasal y succión para eliminar el exceso de anestésico. Instala una superficie de funcionamiento con una almohadilla de circulación de agua tibia para mantener la temperatura corporal y los suministros del animal en un lugar cómodo y estéril.
   NOTA: Este procedimiento no requiere microscopio de operación; Sin embargo, considera incluir este instrumento para mejorar la visualización.
3. Inducir anestesia administrando isoflurano inhalado al 2%-3% con un caudal de oxígeno de 2 L/min a través del cono nasal desde una máquina de vaporizador anestésico inhalado (siguiendo protocolos institucionalmente aprobados).
   1. Asegura el plano adecuado de anestesia confirmando una frecuencia respiratoria de aproximadamente 30-40 respiraciones/min y la falta de respuesta ante el pinchazo en la parte trasera. Revisa periódicamente el plano adecuado de anestesia y ajusta el caudal de isoflurano en consecuencia.
      NOTA: Alternativamente, un anestésico inyectable también es apropiado.
4. Sigue las directrices del instituto para analgesia adecuada y anestesia local. Por ejemplo, administrar un analgésico de acción prolongada como 3,25 mg/kg de buprenorfina XR por vía subcutánea y administrar hasta 0,04 mL/5g de peso corporal de solución de lidocaína de 1 mg/mL por vía subcutánea en la incisión prevista.
5. Prepara al animal para el procedimiento colocando boca arriba, aplicando lubricante ocular, arrancando o cortando el pelo abdominal y esterilizando el abdomen con solución de povidona/yodo, seguida de un 70% de etanol (Figura 2A).
6. Utiliza guantes estériles y aplica cortinas estériles sobre el animal con una ventana al campo operatorio. Mantén la esterilidad durante todo el procedimiento.

Figura2: Imágenes representativas de los principales pasos procedimentales en la linfadenectomía mesentérica. (A) Ventana abdominal arrancada y esterilizada. (B) Incisión de 0,5 cm a través de la piel y la línea alba. (C) Exposición de la cadena de ganglios linfáticos mesentéricos orientando el íleo derecho, el colon proximal izquierdo y el ceco inferior. El primer ganglio linfático mesentérico se encuentra a lo largo de la arteria ileocólica (flecha blanca). (D) Ganglio linfático mesentérico extirpado (flecha desvaída). Barras de escamas: 0,5 cm. (E) Ganglio linfático mesentérico ex vivo (flecha blanca; 2,5 mm x 3 mm). Garrapatas = 1 mm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

2. Preparación para la linfadenectomía mesentérica

1. Haz una incisión media de 0,5-1 cm a través de la piel. Disecciona la piel de forma directa desde la pared abdominal e identifica la línea alba. Realizar una incisión de 0,5-1 cm a través de la línea alba para acceder a la cavidad peritoneal (Figura 4B).
   NOTA: Para mejorar el acceso a los ganglios de la estación 2/3/4, considere extender la incisión cefálica, pero no para superar el proceso xifoides cartilaginoso.
2. Inyecta 1 mL de solución salina estéril a temperatura corporal en la cavidad peritoneal mediante una aguja de punta roma y humedece las cortinas estériles en preparación para la colocación intestinal. Utiliza hisopos estériles y húmedos con punta de algodón para identificar y eviscerar el ceco a través de la incisión.
   1. Evita usar instrumentos afilados para manipular el intestino, ya que esto puede provocar lesiones. Rehumedece periódicamente las cortinas y el intestino para evitar daños por resequedad.
      NOTA: El ceco murino generalmente reside en el cuadrante inferior izquierdo del abdomen, pero puede alojarse en cualquier cuadrante.
3. Aclare la(s) estación(s) de ganglios linfáticos mesentéricos(es) objetivo para la resección y sigue las instrucciones específicas a continuación (es decir, 3.1-3.4). Véase la Figura 1A,B para puntos de referencia anatómicos e identificación.

3. Disección y escisión de estaciones de ganglios linfáticos mesentéricos

1. Primera estación ganglio linfático (drenaje proximal del colon; Figura suplementaria 1A,B').
   1. Orientar el intestino exteriorizado sobre cortinas húmedas con el ceco inferior, colon proximal superior y el íleon terminal hacia la derecha del cirujano (lado izquierdo del animal; Figura 1A, Figura 2C).
   2. Identifica la cadena de ganglios linfáticos mesentéricos, que recorre longitudinalmente el colon. Utilizando pinzas de punta fina en ángulo, disecciona de forma directa la primera estación ganglionar linfática alejándose de los vasos ileocólicos colocando pinzas cerradas en el espacio entre estas estructuras y permitiendo que las pinzas se abran suavemente.
      1. Retira las pinzas y repite esta maniobra 2-3 veces o hasta que se haya creado un plano suficiente para una escisión segura. Evitar daños en los principales vasos sanguíneos del colon (Figura 3A,B).
         NOTA: Si se detecta un sangrado significativo, abortar el procedimiento y eutanasiar al animal de forma humanitaria (siguiendo los protocolos institucionalmente aprobados).
   3. OPCIONAL: Para disminuir el riesgo teórico de colaterales en ganglios cercanos, realiza una ligadura opcional con suturas interrumpidas simples a lo largo de la cadena ganglionar (una de 1 mm distal y otra de 1 mm proximal a la primera estación de ganglios) utilizando sutura de nylon monofilamento negro 9-0 y pinzas de punta fina para accionar la aguja (Figura 3C,D).
   4. Retrae suavemente la cauda ligada de la estación linfática y, usando tijeras de punta fina, extirpa la estación ganglio linfático objetivo desde cefálade hasta caudad (Figura 3E).
      NOTA: A menudo, los ratones tienen un pequeño pero visible vaso alimenticio que sale de la arteria ileocólica hacia la parte posterior del ganglio linfático. El sangrado de este vaso puede controlarse con una presión suave con un hisopo con punta de algodón hasta lograr la hemostasis.

Figura3: Imágenes fijas y comentarios anotados de la linfadenectomía mesentérica (primera estación). (A) La orientación adecuada del intestino expone la primera estación de ganglios linfáticos mesentéricos (flecha blanca). (B) Se crea un plano entre la arteria ileocólica (flecha azul) y el ganglio. (C) La ligadura por sutura de los vasos alimentarios que entran en el ápice del ganglio linfático (flecha azul) se realiza excluyendo los vasos ileocólicos al salir del espacio entre estas estructuras (flecha blanca). (D) Se realiza una ligadura de sutura en la base del ganglio linfático, nuevamente observando y evitando las ramas distales de la arteria ileocólica. (E) El ganglio se extirpa a lo largo del plano tisular previamente creado, manteniéndose alto hacia el ganglio linfático y dejando ligaduras de sutura (flechas negras). (F) Se confirma la hemostasis, se observan ramas distales de la arteria ileocólica para asegurar un flujo sanguíneo adecuado, y se observa que el espacio vacío (flecha desvaída) donde vivía previamente el ganglio está libre de ganglio residual. Barras de escala: 0,5 cm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

2. Segunda estación ganglio linfático (drenaje del intestino delgado distal)
   1. Eviscera suavemente también el intestino delgado. Orientar el intestino exteriorizado sobre cortinas húmedas con el ceco inferior, colon proximal superior, y el intestino delgado hacia la derecha del cirujano (lado izquierdo del animal; Figura 1A).
   2. Identifica la cadena de ganglios linfáticos mesentéricos, que recorre longitudinalmente el colon. La segunda estación comienza en la confluencia de vasos ileales/jeyuales (Figura 1B).
      1. Utilizando pinzas de punta fina en ángulo, disecciona de forma directa la segunda estación ganglio linfático alejada de los vasos colónicos colocando pinzas cerradas en el espacio entre estas estructuras y permitiendo que las pinzas se abran suavemente.
      2. Retira las pinzas y repite esta maniobra 2-3 veces o hasta que se haya creado un plano suficiente para una escisión segura. Evita daños en los principales vasos sanguíneos del colon. Además, presta especial atención a los vasos ileales y jeyunales, que serían perjudiciales si se lesionan.
         NOTA: Si se detecta sangrado significativo, abortar el procedimiento y sacrificar al animal de forma humana.
   3. OPCIONAL: Para disminuir el riesgo teórico de colaterales en ganglios cercanos, realizar una ligadura opcional con suturas interrumpidas simples a lo largo de la cadena ganglionaria (una distal de 1 mm y otra de 1 mm proximal a la segunda estación ganglionalaria) utilizando sutura de nylon monofilamento negro 9-0 y pinzas de punta fina para accionar la aguja (Figura suplementaria 2A).
   4. Retrae suavemente la estación linfática ligada caudad y, usando tijeras de punta fina, extirpe la estación ganglio linfático objetivo de cefálade a caudad (Figura suplementaria 2B).
      NOTA: A menudo, los ratones tienen un pequeño pero visible vaso alimenticio que sale de la arteria ileocólica hacia la parte posterior del ganglio linfático. El sangrado de este vaso puede controlarse con una presión suave con un hisopo con punta de algodón hasta lograr la hemostasis.
3. Segunda y tercera estación ganglionar (drenaje prox-distal del intestino delgado; Figura suplementaria 1C,D'
   1. Eviscerar suavemente todo el intestino delgado hasta el punto de anclaje posterior (ligamento de Treitz). Orientar el intestino exteriorizado sobre cortinas húmedas con el ceco inferior, colon proximal superior, y el intestino delgado hacia la derecha del cirujano (lado izquierdo del animal; Figura 1A).
   2. Identifica la cadena de ganglios linfáticos mesentéricos, que recorre longitudinalmente el colon. La segunda estación comienza en la confluencia de vasos ileales/jeyuales (Figura 1B).
      1. Utilizando pinzas de punta fina en ángulo, disecciona de forma directa el segundo y tercer ganglio linfático alejándolos de los vasos colónicos colocando pinzas cerradas en el espacio entre estas estructuras y permitiendo que las pinzas se abran suavemente.
      2. Retira las pinzas y repite esta maniobra 2-3 veces o hasta que se haya creado un plano suficiente para una escisión segura. Evita daños en los principales vasos sanguíneos del colon. Además, presta especial atención a los vasos ileales y jeyunales, que serían perjudiciales si se lesionan.
         NOTA: Si se detecta sangrado significativo, abortar el procedimiento y sacrificar al animal de forma humana.
   3. OPCIONAL: Para disminuir el riesgo teórico de colaterales en ganglios cercanos, realiza una ligadura opcional con suturas interrumpidas simples a lo largo de la cadena ganglionaria (normalmente una distal de 1 mm, dos laterales de 1 mm y una de 1 mm proximal a la segunda/tercera estación ganglionalaria) utilizando sutura de nylon monofilamento negro 9-0 y pinzas de punta fina para accionar la aguja (Figura suplementaria 3B, C).
      1. Observa los tractos linfáticos aferentes, que se encuentran justo superficiales respecto a los haces vasculares ileal/jeyual (Figura suplementaria 3B). Ten cuidado de asegurar que las ligaduras de sutura sean profundas hasta las linfáticas y superficiales o las estructuras vasculares principales, ya que el daño a los haces vasculares ileales/jeyuales sería perjudicial.
   4. Retrae suavemente las estaciones linfáticas ligadas de la cefalada y, usando tijeras de punta fina o extrafina, extirpa las estaciones de ganglios linfáticos objetivo desde la cauda hasta la cefalada.
      NOTA: Antes de continuar, asegúrese de que el intestino delgado permanezca rosado y bien perfundido. La ligadura incidental de los vasos ileales/jeyuales resultará en el intestino delgado isquémico.
4. Cuarto ganglio linfático (drenaje distal; Figura suplementaria 1E,F')
   1. Eviscerar suavemente todo el intestino delgado hasta el punto de anclaje posterior (ligamento de Treitz). Orientar el intestino exteriorizado sobre cortinas húmedas con el ceco inferior, colon proximal superior, y el intestino delgado hacia la derecha del cirujano (lado izquierdo del animal; Figura 1A).
   2. Identifica la cadena de ganglios linfáticos mesentéricos, que recorre longitudinalmente el colon. La cuarta estación se encuentra justo medial al colon distal y lateral a la tercera estación (Figura 1B, Figura 4A).
      1. Utilizando pinzas de punta fina en ángulo o tijeras de punta extrafina, disecciona de forma directa la estación del cuarto ganglio linfático lejos de los vasos colónicos y del adiposo circundante, colocando pinzas o tijeras cerradas en el espacio entre estas estructuras y permitiendo que las pinzas se abran suavemente.
      2. Retira las pinzas o tijeras y repite esta maniobra 2-3 veces o hasta que se haya creado un plano suficiente para una escisión segura. Evita daños en los principales vasos sanguíneos del colon.
         NOTA: Si se detecta sangrado significativo, abortar el procedimiento y sacrificar al animal de forma humana.
   3. OPCIONAL: Para disminuir el riesgo teórico de colaterales en ganglios cercanos, realiza una ligadura opcional con suturas interrumpidas individuales en cada ganglio linfático identificable (normalmente a 1 mm del ganglio) utilizando nylon monofilamento negro 9-0 y pinzas de punta fina para accionar la aguja (Figura 4B - D).
   4. Retrae suavemente las estaciones linfáticas ligadas de la cefálade y, usando tijeras de punta extrafina, extirpe la estación ganglionada objetivo de la cauda a la cefalada (Figuras 4D, E).

Figura 4: Imágenes y comentarios anotados de la linfadenectomía mesentérica (cuarta estación). (A) La orientación intestinal adecuada expone la cuarta estación de ganglios linfáticos mesentéricos (flechas blancas) medial al colon distal y lateral a la tercera estación. (B,C) Tras la disección roma de la estación ganglional, se realiza una ligadura de sutura (flecha negra) en cada ganglio identificable, asegurando incluir todos los vasos de alimentación de los ganglios linfáticos (flechas azules). (D) El ganglio se extirpa a lo largo del plano tisular previamente creado, manteniéndose alto hacia los ganglios linfáticos y dejando ligaduras de sutura (flechas negras). (E) Tras la excisión de la estación nodal (flechas blancas), se confirma la hemostasia, se ven las ligaduras de sutura (flechas negras) y se observa que el espacio vacío (flechas desvaídas) donde vivía previamente el nodo está libre de nodo residual. Barras de escala: 0,2 cm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

4. Completación de linfadenectomía mesentérica

1. Observa las ramas distales de los vasos ileocólicos, vasos ileales y/o vasos jeyuales para asegurar que el suministro sanguíneo esté intacto. El intestino bien perfundido es brillante y rosado, con pulsaciones visibles.
   1. Utilizando hisopos con punta de algodón, devuelven el contenido abdominal a la cavidad peritoneal. Ten cuidado de eliminar cualquier fragmento de algodón, pelusa, caída o sutura de los intestinos antes de que regresen, ya que esto puede provocar inflamación quirúrgica adicional.
   2. Asegúrate de que el intestino no esté retorcido en su mesenterio confirmando que el intestino permanece brillante/rosado (perfundido) en lugar de opaco/gris/púrpura (isquémico).
2. Inyecte 1 mL de solución fisiológica estéril a temperatura corporal en el abdomen justo antes del cierre para completar la pérdida o evaporación insensible de líquidos. Cierra el abdomen en dos capas (pared abdominal y piel) con sutura de polipropileno monofilamento 6-0 de forma corrida.
3. Aplica pegamento quirúrgico estéril sobre la herida.
   NOTA: Alternativamente, se pueden usar suturas interrumpidas o clips para heridas para cerrar la piel.

5. Cuidados postoperatorios

1. Reubica al animal en una jaula limpia, que está mitad sobre y mitad fuera de una almohadilla de agua tibia con acceso a comida y agua de forma improvisada.
2. Permite que el animal se recupere de la anestesia y vigila de cerca los signos de malestar. Si los animales no se recuperan rápidamente de la anestesia con comportamientos apropiados (es decir, aumento de la frecuencia respiratoria, autoenderezamiento, caminar, acicalamiento), eutanasia humanamente al animal.
3. Cuando todos los animales se hayan recuperado de la anestesia, devuelva las jaulas al centro de cuidado animal con acceso a agua, alimento, cama y materiales de enriquecimiento ad libium.
4. Evalúa los ratones postoperatoriamente cada 12 horas durante 3 días para detectar signos de dolor o angustia (es decir, postura encorvada, disminución de actividad, menor implicación, mal cuidado). Eutanasiar humanamente a ratones que demuestren signos de malestar.
5. Si se utiliza sutura permanente (como polipropileno monofilamento 6-0), examina las incisiones en el día 10 postoperatorio y retira cualquier material restante para la sutura.

6. Manejo de ganglios linfáticos

1. Realizar inmediatamente una prueba de flotabilidad colocando el tejido extirpado en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL con solución fisiológica tamponada (PBS) de 500 μL. Confirma la excisión de ganglios linfáticos observando el hundimiento del tejido en PBS frente a la resección involuntaria del adiposo, que flotará (Figura 5A).
   NOTA: La(s) estación(s) de ganglios linfáticos extirpados están inmediatamente listas para entrar en procesamiento posterior aguas abajo.
2. Para técnicas de células vivas, coloque estación(s) de ganglios linfáticos extirpados en medios de cultivo celular (por ejemplo, DMEM, RPMI) o PBS sobre hielo. Para la histología planificada, coloca estación(es) de ganglios linfáticos extirpados en un fijador (por ejemplo, 10% formalina neutral tamponada, 4% paraformaldehído).

Resultados

Para confirmar la precisión de este procedimiento, se realizaron linfadenectomías mesentéricas en once hermanos de camada C57BL/6J de 4-6 semanas, de edad, sexo y genotipo compatibles. Los tiempos de procedimiento oscilaban entre 5 y 15 minutos por ratón. Todos los ratones toleraron bien el procedimiento, con un 100% de supervivencia perioperatoria. Las muestras extirpadas se colocaron en PBS sobre hielo. Todas las muestras se hundieron inmediatamente, confirmando un bajo contenido de ad...

Discusión

Aquí se describe un procedimiento de supervivencia para una linfadenectomía mesentérica murina segura y bien tolerada en cada una de las cuatro estaciones ganglionarias. La principal limitación de este procedimiento es la relación indirecta entre la exposición y la progresión de los ganglios linfáticos a lo largo de la cadena mesentérica. La primera estación ganglio linfático queda fácilmente y sin problemas en su totalidad. La segunda estación ganglio linfático suele ser visible, y la e...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Circuito anestésico	Cualquiera		O anestésico inyectable
Citómetro de flujo BD LSRII (o equivalente)	BD Biociencias		Equipado con el software FACS Diva (para citometría de flujo) y nbsp;
Buprenorfina XR	Cualquiera		Para la analgesia
Medios de cultivo celular	Cualquiera		(para técnicas de células vivas; es decir, DMEM o RPMI)
DAPI	Bioleyenda	422801	Concentración de trabajo: 15 ug/mL
Etanol (70% en agua)	Cualquiera		Para limpiar
CD45.2 (104) anti-ratón conjugado con FITC (104)	Bioleyenda	109806	Concentración de trabajo: 5 ug/mL
Pinzas: Pinzas de punta fina en ángulo	Roboz	RS-5058	Material: Dumoxel; Patrón #5, ángulo de 45 grados; Tamaño de punta 0,1 x 0,06mm
Pinzas: Pinzas de punta fina	Roboz	RS-4960	Material: Dumostar; Patrón #1; Tamaño de la punta: 0,20 x 0,12mm
Pinzas: Pinzas de punta fina	Roboz	RS-4966	Material: Dumostar, Punta de Biologie; Patrón #3; Tamaño de la punta: 0,08 x 0,04mm
Lidocaína	Cualquiera		Para la analgesia
Aguja metálica de gavage	Cualquiera		Aguja oral recta reutilizable calibre 20/22, acero inoxidable.
Clavadores de aguja	Roboz	RS-6410	Portaagujas Castroviejo; Recto
OPCIONAL:      Luces LED de microscopio de cuello de oca dobles/dobles	Cualquiera
OPCIONAL: tinte azul Evans	Sigma	E2129-10G	Para un trazo linfático opcional.
OPCIONAL: Microscopio de funcionamiento	Leica	MZ9.5	Microscopio de cabezal estéreo Leica Mz9.5
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Cualquiera
Solución de povidona/yodo	Cualquiera		Para la preparación/esterilización de la piel
Tijeras: tijeras de punta extra fina	Roboz	RS-5605	McPherson-Vannas; Filo de corte de 3mm; curva (para nodos de estación 3/4)
Tijeras: tijeras de punta fina	Roboz	RS-5650SC	Tijeras Castroviejo Surecut (para nodos de estación 1/2/3)
Tijeras: Tijeras medianas	Roboz	RS-5676	Noyes; filo cortante de 13 mm; recto
Pegamento quirúrgico	Cualquiera		Adhesivo de tejido 3M Vetbond
Sutura: 6-0 monofilamento azul polipropileno	Cualquiera
Sutura: sutura de nylon monofilamento negro 9-0	Cualquiera		(opcional) También se puede usar el 8-0 un poco más grande Tamaño de sutura.
Fijador tisular	Cualquiera		(para histología planificada; es decir, 10% formalina neutral amortiguada o 4% paraformaldehído)
Almohadilla térmica de circulación de agua caliente	Cualquiera