Administración endotraqueal no invasiva de lipopolisacáridos para inducir daño pulmonar agudo en roedores

Resumen

En este estudio, se ha demostrado que una técnica no invasiva de instillación endotraqueal desarrolla AL en ratas utilizando un laringoscopio básico para asegurar una entrega precisa de LPS a los pulmones. El LPS se administra mediante un tubo endotraqueal mediante un laringoscopio. La magnitud de la lesión pulmonar se evalúa en varios momentos.

Resumen

La Lesión Pulmonar Aguda (ALI) es una condición inflamatoria potencialmente mortal caracterizada por hipoxemia arterial, edema alveolar, comprometida integridad de la barrera epitelial-endotelial capilar, seguida de infiltración de células inflamatorias en el tejido pulmonar, que a menudo progresa hacia su forma más grave, el Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda (SDRA), que a menudo culmina en insuficiencia respiratoria aguda. Los modelos murinos de ALI, inducidos principalmente por lipopolisacáridos (LPS), son una herramienta clave en la investigación orientada a comprender los mecanismos de la inflamación pulmonar y sus terapias. Los modelos directos e indirectos de lesión pulmonar en roedores ofrecen ventajas y limitaciones claras, especialmente en términos de tasa de supervivencia, duración de la fase de resolución inflamatoria, riesgos de traumatismos quirúrgicos e infecciones. En el presente estudio, se ha utilizado una técnica no invasiva de instillación endotraqueal para desarrollar un modelo directo de ALI en ratas. Esta técnica garantiza la entrega enfocada de LPS o material de prueba a los pulmones a través de la vía endotraqueal con la ayuda de un laringoscopio básico. El procedimiento comienza con la anestesia de la rata y su posición en una postura semi-reclinada. Posteriormente, la solución de LPS se administra cerca de la abertura traqueal usando una jeringuilla unida a un tubo endotraqueal de rata. En el momento de finalizar el experimento, se recogen muestras de pulmón o lavado para evaluar parámetros inflamatorios y la arquitectura pulmonar. Esta técnica supera a otros modelos en términos de velocidad, especificidad y fiabilidad, proporcionando un objetivo específico con daño tisular mínimo, bajo riesgo de mortalidad y una inflamación fuera del lugar insignificante. Este método es especialmente valioso en estudios preclínicos de ALI, SDRA y condiciones relacionadas como anafilaxia o paro cardíaco. En comparación, este método se integra más con técnicas avanzadas de imagen como la microscopía intravital para monitorizar la distribución de fármacos y la progresión de la enfermedad en tiempo real.

Introducción

La lesión pulmonar aguda (LI) es una condición inflamatoria potencialmente mortal caracterizada por hipoxemia arterial, edema pulmonar, integridad comprometida de la barrera endotelial-epitelial y una infiltración masiva de células inmunitarias en los^{pulmones 1}. La fisiopatología de la AL es compleja e implica la interacción y alteración de múltiples vías superpuestas e interaccionales, como la coagulación, la lesión tisular y la inflamación pulmonar y sistémica. La supresión rápida de esta respuesta inflamatoria es crucial para restaurar la homeostasis tisular. Si no se trata, este trastorno que progresa rápidamente suele escalar al Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda (SDRA), una condición más grave definida por hipoxemia refractaria. La patogénesis de la IA se ha asociado con lesiones pulmonares y daño o muerte de células epiteliales alveolares y células endoteliales ^{microvasculares} 1,2,3,4.

La etiología responsable de la ALI/SDRA abarca una amplia gama de agentes infecciosos y no infecciosos, que surgen tanto de fuentes directas como indirectas de lesión pulmonar⁵. Las causas directas incluyen^{neumonía 6}, casi^{ahogamiento 7}, aspiración de contenido^{gástrico 8}, inhalación de toxinas como gas^{cloro 9}, infección^{bacteriana 10 e infección} viral como SARS-CoV-2 11,12,13,14. Las causas indirectas se originan en procesos sistémicos que ejercen su influencia secundaria sobre los pulmones, como^{sepsis 15}, trauma¹⁶, pancreatitis¹⁷, sobredosis de drogas y transfusiones^{de sangre 18}.

El objetivo principal de este método es establecer un modelo reproducible y no invasivo de la AL en roedores mediante la administración endotraqueal de endotoxina. La razón para desarrollar esta técnica proviene de las limitaciones de los métodos convencionales de administración. La técnica se demostró con el objetivo de lograr una administración directa precisa de los alvéolos pulmonares, minimizando la exposición sistémica y convirtiéndola en un enfoque prometedor para futuras terapias pulmonares dirigidas. La instillación intranasal plantea varios desafíos, algunos de los cuales pueden afectar significativamente los resultados del estudio, como una mala orientación a las regiones pulmonares profundas y la variabilidad respiratoria entre animales¹⁹. Otros factores, como el volumen de dosis limitado y la posible irritación nasal, son menos críticos pero pueden afectar la consistencia. En comparación, la administración endotraqueal proporciona una administración más precisa y directa a las vías respiratorias inferiores, asegurando una mejor orientación pulmonar y una mejor uniformidad de dosificación con mínima variabilidad entre animales, haciendo que esta vía sea más eficaz y fiable para la exposición pulmonar²⁰. La vía de inhalación es clínicamente relevante debido a su naturaleza no invasiva, pero también está asociada a ciertas limitaciones en la investigación preclínica, como la pérdida de fármacos en las vías respiratorias superiores y la reducción de la eficacia en el objetivo de las regiones pulmonares distales. Estas limitaciones se hacen más evidentes en modelos graves, incluyendo lesiones con doble impacto o modelos modificados genéticamente con ratones knock-in o knock-out. En cambio, la administración endotraqueal garantiza una mayor consistencia para la administración directa del fármaco en las vías respiratorias inferiores, minimizando la pérdida y permitiendo una selección eficaz en modelos preclínicos complejos^{también 21}. Otra vía de administración relevante utilizada en la investigación preclínica es la administración intratraqueal invasiva. Aunque es eficaz, está asociado al riesgo de estrés quirúrgico, infecciones, variación en la lectura y la necesidad de mantener la temperatura²². En cambio, el método endotraqueal ofrece una alternativa fiable y no invasiva, lo que lo hace ideal para estudios que implican evaluaciones repetidas durante períodos prolongados de observación.

Este método puede aplicarse en modelos animales más allá de la ALI, incluyendo asma, fibrosis pulmonar, EPOC, neumonía y enfermedades pulmonares infecciosas. También es relevante en áreas de investigación preclínica como anafilaxia, paro cardíaco y arritmias cardíacas. Cabe destacar que el método endotraqueal ya está establecido en la práctica clínica para la administración de ciertos fármacos, dependiendo de la urgencia y el escenario clínico 23,24,25.

Protocolo

Se siguieron todas las directrices institucionales y de la CPCSEA para el cuidado y uso de animales. Los animales fueron monitorizados continuamente tras el procedimiento para garantizar su bienestar y cumplir con las directrices éticas para animales del CSIR-Instituto Indio de Medicina Integrativa, Jammu, bajo la aprobación del Comité Institucional de Ética Animal (IAEC) número 468/87/8/2025. Este protocolo describe la instillación endotraqueal no invasiva de lipopolisacáridos (LPS) utilizando el método de administración visual directa, como se demostró anteriormente, con algunas mejoras metodológicas introducidas en el estudio^actual 26,27,28. La técnica está optimizada para inducir la ALI de manera controlada y consistente, asegurando resultados experimentales sólidos mientras se mantienen altos estándares de cuidado animal. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de anestesia y LPS

1. Medición del peso animal y cálculo de la dosis LPS
   1. Pesa cada animal usando una balanza calibrada para calcular la dosis precisa de LPS. Selecciona ratas Wistar que pesan entre 140 y 160 g para el estudio.
   2. Prepara la solución de LPS diluyendo el LPS liofilizado de Escherichia coli en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) para lograr la concentración deseada. Se utiliza solución de LPS recién preparada (5 μg/g de peso corporal)^29,30.
2. Inducción de anestesia y sincronización crítica
   1. Anestesiar a los animales mediante una inyección intraperitoneal de un cóctel de ketamina-xilazina recién preparado (ketamina: 75 mg/kg y xilazina: 10 mg/kg) usando 1 mL de jeringuilla. Tras la inyección, deja aproximadamente 2-5 minutos para que la anestesia haga efecto, sin molestar a los animales.
   2. Confirma la anestesia adecuada asegurando la ausencia de movimiento espontáneo y un reflejo negativo de pinzamiento en el dedo del pie. La LPS se administra mediante instillación endotraqueal 5-8 minutos después de la inducción de la anestesia. El día de la finalización del experimento, realizar procedimientos como traqueotomía y toracotomía 4-7 minutos después de la inducción de la anestesia.
      NOTA: La profundidad adecuada de la anestesia es fundamental para una instillación endotraqueal exitosa. La sobreanestesiación puede suprimir el reflejo nauseoso, mientras que la subanestesiación puede causar malestar o movimiento durante el procedimiento. Utiliza LPS recién preparado para mantener la consistencia entre experimentos. Controla de cerca a los animales durante y después del procedimiento para garantizar un bienestar adecuado.

2. Instalación endotraqueal de LPS

1. Evaluación de la suficiencia anestésica: Tras la administración del cóctel anestésico, evalúa la profundidad de la anestesia aplicando un suave estímulo de pellizco de pata. Una vez confirmada la anestesia, proceder con el protocolo de instillación. Coloca al ratón en una posición semi-reclinada, suspendido por incisivos sobre una plataforma sólida de soporte.
2. Visualización traqueal: Abre la boca del animal anestesiado, agarra suavemente la lengua con pinzas e inserta cuidadosamente el laringoscopio, alineándolo con precisión para una visualización óptima de la abertura traqueal. Asegúrate de que la luz esté correctamente dirigida para iluminar la región laríngea, facilitando un acceso sin obstáculos.
3. Manipulación de la lengua: Emplea pinzas curvas y de extremo romo para sujetar delicadamente la lengua y retraerla suavemente en dirección ascendente y lateral.
   NOTA: Utilice lupas de mano para mejorar la claridad de la anatomía laríngea y asegurar una alineación meticulosa del aparato de instalación para una mayor precisión.
4. Administración de LPS: Extraer 100 μL de solución de LPS en la jeringuilla y unirla a un tubo endotraqueal de rata de 16 G; administrar la solución LPS cerca de la abertura traqueal. Inmediatamente después de la instillación, ocluye suavemente las fosas nasales durante 2-4 segundos usando pinzas romas para promover la aspiración de la solución de LPS hacia los pulmones a través de la tráquea. Monitorizar continuamente la entrega utilizando un laringoscopio habilitado por fuente de luz para confirmar la administración precisa y completa.
5. Monitorización postprocedimental: Reposicionar cuidadosamente la lengua a su orientación anatómica normal tras la exitosa administración del LPS. Transfiere al animal a la jaula y vigile de cerca cualquier signo de compromiso respiratorio o ahogamiento durante al menos 1 minuto.
6. Consideraciones clave
   1. Agudeza visual: Asegura una alineación óptima del laringoscopio para una entrega precisa del LPS. Utiliza herramientas de aumento para mejorar la precisión y la eficacia.
   2. Sujeta la lengua con cuidado y colócala contra la mandíbula inferior o el borde de la boca para estabilizarla.

3. Recogida de muestras

1. Realizar lavado broncoalveolar (BAL) tal y como se describió en estudios anteriores, con modificaciones^menores 31,32,33. Tras la traqueotomía, infundir suavemente 2 mL de PBS frío en los pulmones y extraer el líquido.
2. Centrifugar el fluido recogido a 5000 x g durante 5 minutos a 4 °C y utilizar el sobrenadante para la detección de marcadores inflamatorios. Recoger los pulmones para examen histopatológico o homogeneizar la actividad de mieloperoxidasa (MPO). Mantén las muestras en hielo durante el proceso de recogida para preservar su integridad.

Resultados

El modelo fue validado midiendo marcadores inflamatorios, incluyendo niveles de IL-1β, actividad de MPO, contenido total de proteínas e histopatología a las 24 horas y 120 horas tras la instillación de LPS. El estudio incluyó tres grupos experimentales: un grupo de control (no tratado) y dos grupos sometidos a la instillación de LPS, uno sacrificado a las 24 horas y el otro a las 120 horas (siguiendo protocolos institucionalmente aprobados).

E...

Discusión

El método de instalación endotraqueal proporciona un enfoque no invasivo, reproducible y dirigido para la administración pulmonar, evitando efectivamente la necesidad de intervención quirúrgica. Este método reduce significativamente los riesgos asociados a traumatismos quirúrgicos, como daños en tejidos, al tiempo que minimiza el riesgo de infecciones postoperatorias y daños no intencionados en órganos que pueden surgir de procedimientos invasivos. Al administrar agentes directamente a l...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Prisma 8	Graphpad	https://www.graphpad.com/features
Bradford Reagent	Himedia, India	ML106-500 ML
DL-Ditiotreitol	Himedia, India y nbsp;	RM525-25G
Eosina y nbsp;	Loba Chemie, India	3660
Ácido tetraacético de etilenodiamina (EDTA)	Loba Chemie, India	6381926
Pinzas y bbsp;		-
Formol 10%	Sigma Aldrich, EE.UU. y Inebsp;	HT501320
Hematoxilina	SDFCL	74108G05
HEPES	Himedia, India	MB016
Peróxido de hidrógeno	Avra, India	7722841
Ketamina y ketamina;	Neon Laboratories Ltd, India	-
Laringoscopio	Medical Sources Co., Ltd., China & nbsp;	MS-LA500FV y nbsp;
Lipopolisacárido de Escherichia coli O55:B5	Sigma Aldrich, EE. UU.	L2880
o-Dianisidina dihidrocloruro	Sigma Aldrich, EE. UU.	D3252-5G
Suero tampón de fosfato (PBS) y nbsp;	Invitrogen, EE. UU.	3002
Ortófosfato de dihidrógeno potásico	Himedia, India	IN26185530500
Cóctel inhibidor de proteínas	Sigma Aldrich	P8340
Rat IL-1 y beta; Kit ELISA	Thermofisher, EE. UU.	BMS630
Cloruro de sodio	Himedia, India	TC046M
Fluoruro de sodio	Himedia, India	GRM7502
Ortovanadato sódico	Sigma Aldrich, EE. UU.	S6508
Pirofosfato de sodio	Merck, EE. UU.	MA3M722243
Ácido sulfúrico	Sigma Aldrich, EE. UU.	339741
Triton X-100	Thermofisher, EE. UU.	T8787
Xylazine	Indian Immunologicals Ltd, India	-