Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Ingeniería 3D Flipwell para el desarrollo de sistemas asíncronos para terapias toxicológicas e inmunomoduladoras en células bacterianas, intestinales e inmunitarias

649 visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/68701

⸱

17 de octubre de 2025

 , 
1Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, 2MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

En este artículo

Resumen

Este artículo proporciona un protocolo detallado con pasos clave para guiar la ingeniería y utilización de 3D Flipwell. Describimos y mostramos cómo ensamblar las pilas de insertos de cocultivo y utilizarlas para cocultivar capas estratificadas de bacterias intestinales, epitelios intestinales y macrófagos para modelar el entorno de la mucosa intestinal.

Resumen

Para estudiar las funciones del secretoma bacteriano en la polarización de las células inmunitarias y la homeostasis de la mucosa intestinal, desarrollamos un modelo de cocultivo tridimensional utilizando insertos disponibles comercialmente en un formato apilado espalda con espalda. Denominamos a este sistema 3D Flipwells, y cocultivamos con éxito bacterias, epitelio de colon y células inmunitarias en capas estratificadas para recapitular el microambiente de la mucosa intestinal. Este sistema de cocultivo permite la siembra de células epiteliales de colon en un lado de la membrana y monocitos no adherentes indiferenciados en el otro, lo que permite la progresión sincrónica de la polarización epitelial del colon, la formación de moco y la diferenciación y polarización de monocitos-macrófagos dentro de un solo cocultivo sin la necesidad de separar y volver a colocar macrófagos prediferenciados. Este sistema es fácil de construir y solo requiere unos pocos materiales y herramientas fácilmente disponibles. Probamos su utilidad analizando las respuestas de los componentes de cocultivo a la sepiapterina (SEP), el precursor endógeno de BH4 (tetrahidrobiopterina), un cofactor de la óxido nítrico sintasa (NOS). Demostramos que el tratamiento SEP de 3D Flipwell indujo la formación de biopelículas por bacterias intestinales, la producción de moco por el epitelio del colon y la polarización proinmunogénica de los macrófagos. Esto indicó que SEP desencadenó la activación de un mecanismo de defensa de la mucosa a través de la diafonía entre diferentes componentes celulares. Se necesitan más experimentos para investigar el papel de las comunicaciones de la mucosa que conducen a la reprogramación de las células inmunitarias y para evaluar la utilidad de este sistema de cocultivo para detectar nuevas terapias inmunomoduladoras.

Introducción

La diafonía entre las células inmunitarias y el microbioma intestinal influye en gran medida en la eficacia de los diferentes tratamientos de enfermedades. Dicha diafonía se ve notablemente modificada por estímulos externos, que incluyen, entre otros, anomalías metabólicas del huésped, cambios en la dieta, manifestación de enfermedades y tratamiento farmacológico. Estos cambios podrían conducir a un desequilibrio en la composición de la microflora, una condición denominada disbiosis 1,2,3.

Para comprender mejor las interacciones entre los microbios y las células inmunitarias del huésped en el intestino, diferentes grupos han desarrollado elaborados sistemas de cocultivo en un intento de recapitular el entorno de la mucosa intestinal. Desde el sistema gut-on-chip desarrollado por Kim et al.4 hasta un ensamblaje más complejo utilizando un sustrato absorbente especializado5, estos sistemas de cocultivo no son fáciles de construir y no pueden retener el espectro completo de componentes secretados debido a su absorción por el sustrato de cocultivo. Noel et al. desarrollaron así un sistema de cocultivo alternativo para modelar la mucosa intestinal que es relativamente más fácil de fabricar6. Este nuevo sistema utiliza un solo inserto de cultivo con células epiteliales de colon sembradas en un lado de la membrana y macrófagos prediferenciados en el otro lado6. Sin embargo, la siembra de macrófagos prediferenciados requiere su prediferenciación en otro lugar y su disociación y resiembra en un cocultivo, lo que podría afectar su integridad y viabilidad celular.

Al incorporar mejoras a estos sistemas anteriores, desarrollamos un novedoso sistema de cocultivo tridimensional (3D) de múltiples capas que denominamos sistema 3D Flipwell 7,8. Este sistema está compuesto por insertos de cultivo celular apilados espalda con espalda, lo que permite la progresión sincrónica de la polarización epitelial del colon, la formación de moco, la diferenciación de macrófagos y la polarización dentro de un solo cocultivo. Este sistema nos permite examinar los cambios en el entorno de la mucosa intestinal y las interacciones entre las bacterias intestinales, las células epiteliales y las células inmunitarias. Además, este sistema se puede utilizar para examinar los efectos de los estímulos externos, incluidos los metabolitos bacterianos, las toxinas, los nutrientes dietéticos y los productos farmacéuticos, en la mucosa intestinal y el resto del cuerpo 7,8.

Mediante la utilización del novedoso sistema de inserción de cocultivo, examinamos las respuestas de diferentes componentes celulares a la sepiapterina (SEP), el precursor endógeno de BH4 (tetrahidrobiopterina), un cofactor de la óxido nítrico sintasa (NOS). Anteriormente demostramos que SEP ejerce actividades proinmunogénicas en el microambiente del tumor de mama al reprogramar los macrófagos asociados al tumor a un tipo proinmunogénico 9,10,11,12. Demostramos que SEP induce eventos sincrónicos de formación de biopelículas por bacterias intestinales, producción de moco por el epitelio del colon y polarización proinmunogénica de macrófagos en cocultivos, lo que indica la activación de un mecanismo de defensa de la mucosa7. Estos hallazgos respaldan la utilidad de este nuevo sistema de cocultivo en el modelado del microambiente de la mucosa intestinal7.

El objetivo general de este protocolo es proporcionar instrucciones paso a paso para la construcción de este nuevo cocultivo de bacterias intestinales, epitelios intestinales, moco y células inmunitarias para modelar el entorno de la mucosa intestinal. También demostramos cómo podríamos visualizar la diafonía de células cocultivadas bajo la influencia de un estímulo externo, por ejemplo, el tratamiento SEP. Se necesita más investigación utilizando este sistema de cocultivo para determinar los componentes celulares secretados que facilitan las interacciones entre diferentes células en cocultivo, así como para probar la utilidad de este modelo de cocultivo para la detección de alto rendimiento de nuevas terapias. Además, para alcanzar la condición fisiológica del entorno de la mucosa intestinal, este sistema de cocultivo requeriría más modificaciones. Por ejemplo, para cocultivar células aeróbicas de mamíferos con bacterias anaeróbicas, estas bacterias tendrían que cultivarse por separado en medios anaeróbicos que eliminen el oxígeno o recubrirse con parafina líquida que impida la entrada de oxígeno, como se informó en otra parte. Esta utilidad avanzada y la aplicación de este sistema de cocultivo justificarían una mayor investigación.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

1. 3D Ingeniería Flipwell

  1. Todo el trabajo debe realizarse dentro de un gabinete de cultivo celular. Coloque todos los suministros dentro del gabinete.
  2. Abra la tapa de la placa de Petri y reserve. Abra la hoja del bisturí de su carcasa protectora y colóquela en el borde del fondo de la placa de Petri. Asegurar la esterilidad.
    PRECAUCIÓN: Se requiere un manejo cuidadoso de la hoja del bisturí. Use guantes resistentes a cortes y reforzados con fibra para proteger las manos si es necesario.
  3. Abra el embalaje protector estéril del inserto comercial de 12 pocillos. Asegurar la esterilidad. Tome un juego de pinzas estériles. Agarre suavemente el inserto y retírelo del empaque.
  4. Sostenga el inserto de modo que su parte inferior quede hacia arriba. Con la otra mano, tome la hoja de bisturí estéril y llévela al inserto.
  5. Con un movimiento en forma de C, perfore la membrana en el borde y deslice suavemente la hoja del bisturí alrededor de la parte inferior del inserto, manteniéndose cerca de la pared de plástico.
  6. Corta la membrana de PET y usa el segundo juego de pinzas para quitar la membrana. Deseche la membrana.
  7. Use la hoja de bisturí para raspar las virutas de membrana blanca para limpiar el borde y el borde del inserto. Vuelva a colocar con cuidado el inserto recién preparado en su paquete estéril original.
  8. A continuación, tome el tubo adhesivo de silicona y corte la punta de la boquilla con la hoja del bisturí para hacer una abertura. Esta abertura debe tener 3 mm de ancho.
  9. Prueba el tamaño de la cuenta exprimiendo el pegamento en la toalla de papel. El cordón debe tener un grosor de 2-3 mm. Ajuste la boquilla si el cordón mide menos de 2 mm y es difícil de exprimir del tubo.
    1. Otra forma de aplicar y extender el cordón de pegamento es utilizar una punta de pipeta de 200 μL con la punta cortada. Recorta 3-4 mm con unas tijeras y usa una espátula para esparcir el pegamento alrededor del borde del inserto.
  10. Despegue la cubierta protectora del segundo inserto y reserve. Tome las pinzas estériles, saque el segundo inserto de su empaque con la membrana hacia arriba.
  11. Extienda suavemente una fina gota de silicona de 2-3 mm alrededor de la parte inferior del inserto, teniendo cuidado de no tocar la membrana.
  12. Tome el segundo juego de pinzas estériles y levante con cuidado el primer inserto (sin la membrana) de su paquete protector.
  13. Junte las dos inserciones de abajo hacia abajo para que los bordes inferiores se alineen. El exceso de pegamento puede ser forzado a salir de la junta. Deja que el pegamento se seque. Se puede cortar después de que el pegamento esté completamente seco (24-72 h). Esto es opcional.
    NOTA: La pila final de insertos de cocultivo (FCI) de Flipwell solo debe tener una membrana de PET en el medio. Es mejor colocar las manijas en forma de L de los insertos comerciales de manera que estén ubicadas a 180 ° de distancia entre sí (a las 3 y 6 en punto). Siga las recomendaciones del fabricante del pegamento de silicona para el tiempo de secado, que puede ser de 24 a 72 h según la marca. Para la mayoría de los pegamentos a base de silicona, se prefiere un tiempo de secado de 72 h. El pegamento también se puede secar durante solo 24 h con esterilización UV.
  14. Cuando la pila de FCI esté pegada, colóquela dentro del paquete estéril original para que se seque o dentro de una placa de Petri profunda. Utilice la tapa de las placas de Petri especificadas para cubrir el conjunto de pila.
  15. Para esterilizar los conjuntos de pilas, abra la tapa de la placa de Petri. Use pinzas estériles para colocar la pila FCI en el borde del borde de la placa de Petri profunda especificada.
  16. Cierre la hoja de vidrio del gabinete BSC. Encienda la luz ultravioleta. Aléjese del gabinete por seguridad y esterilice cada lado de la membrana de 30 min-1 h. Apague la luz ultravioleta cuando se complete cada ciclo de esterilización.
  17. Coloque la tapa de la placa de Petri (como se especifica) sobre la placa de Petri con las pilas de insertos y reserve.

2. Prueba de fugas antes del recubrimiento de colágeno

  1. Retire la tapa de la placa de Petri. Agregue 500 μL de PBS estéril o agua desionizada estéril.
    NOTA: Para la ayuda visual, se utilizó DMEM para ayudar a visualizar la integridad de las pilas de FCI.
  2. Cubre la placa de Petri. Déjalo reposar toda la noche. Verifique la integridad de la FCI por la mañana. Deseche los FCI si se detecta una fuga. Cree nuevas pilas de inserciones según sea necesario.
  3. Aspire el líquido (PBS o agua) utilizado para la prueba. Cubra la placa de Petri con una tapa.
  4. Deje que las pilas se sequen (1-2 h) dentro del BSC. Almacene los FCI en un BSC hasta que estén listos para usar o proceda a cubrirlos con colágeno para sembrar las células adherentes.

3. Recubrimiento de colágeno de la membrana Flipwell

  1. Prepare un material de trabajo de la solución de colágeno diluyendo la solución de colágeno suministrada a 3 mg / ml a una dilución de 1:30 a 100 μg / ml. Agregue 33 μL de solución de colágeno fabricada comercialmente a 1 mL de agua desionizada estéril en un tubo de microcentrífuga. Mezclar por vórtice.
    NOTA: Para un volumen mayor, amplíe y use un tubo cónico de 15 ml según la cantidad de pilas de insertos que se recubrirán en ambos lados de la membrana. Haz esto fresco cada vez. No reutilice el material de trabajo.
  2. Abra la tapa de la placa de Petri. Deje que el Flipwell cuelgue del borde de la placa de Petri. Agregue con cuidado 200 μL de solución de colágeno a un lado de la pila de insertos.
  3. Déjalo reposar 1 h. Aspira la solución de colágeno. Agregue 200 μL de PBS estéril. Aspirar PBS.
  4. Cubra la placa de Petri con una tapa y deje que la membrana se seque durante 60 minutos dentro del gabinete. Cuando la membrana esté seca, tome las pinzas estériles y voltee el Flipwell hacia el lado opuesto y déjelo colgar del borde de la placa de Petri.
  5. Agregue 200 μL de solución de colágeno al lado sin recubrimiento (ahora superior) de la membrana. Déjalo reposar 1 h.
  6. Aspira la solución de colágeno. Agregue 200 μL de PBS estéril. Aspirar PBS. Cubra la placa de Petri con una tapa y deje que la membrana se seque durante 60 minutos dentro del gabinete. Deje que la pila de FCI se seque durante la noche o siembre el mismo día.
    NOTA: La integridad del recubrimiento de colágeno no se probó en condiciones de almacenamiento prolongado. Una vez que los Flipwells están precubiertos, deben usarse dentro de las 24 h.

4. Construcción de insertos bacterianos para cultivos bacterianos

  1. Coloque dos juegos de pinzas estériles y los insertos de 24 pocillos dentro del BSC. Abra con cuidado los insertos y déjelos dentro de su empaque estéril.
  2. Con unas pinzas estériles, levante el inserto de su paquete estéril. Con el segundo juego de pinzas/fórceps, rompa los pequeños pies de plástico en la parte inferior del inserto.
  3. Pruebe el inserto de 24 pocillos colocándolo dentro de una de las pilas FCI estériles o insertos originales de 12 pocillos.
  4. Si el inserto no se desliza hacia el pozo, use pinzas nuevamente para romper más material plástico del borde donde se unen el borde y los pies.
  5. Pruebe el ajuste nuevamente hasta que el inserto de 24 pocillos pueda deslizarse dentro del inserto de 12 pocillos. Coloque el inserto dentro de su paquete estéril o dentro de una placa de Petri estéril.
  6. Esterilizar o etanol UV el inserto (opcional). Vuelva a cubrir el paquete o cúbralo con la tapa de la placa de Petri hasta que esté listo para usar.

5. Construcción de la aguja

  1. Lleve las herramientas y todos los suministros dentro de un BSC. Sostenga una aguja con cuidado con los alicates nasales.
  2. Mida la ubicación de cada curva en la aguja con una regla. Con el segundo juego de alicates nasales, sujete la aguja en la ubicación seleccionada y doble la aguja.
  3. Crea el segundo pliegue. Para girar la aguja, sujete la aguja con unos alicates en la base y en la curva en forma de U y gírela en la dirección opuesta para crear un giro de 4-5 mm. Este paso es fundamental para insertar fácilmente la aguja dentro del Flipwell para eliminar las burbujas de aire.
  4. Coloque la aguja en una jeringa estéril de 3 o 5 mm. Esterilice la aguja y la base de la jeringa en 20 ml de etanol al 70%-95% dentro de un tubo cónico de 50 ml.
  5. Pase etanol a través de la aguja y la jeringa para asegurarse de que la aguja y la base de la jeringa estén esterilizadas.
  6. Retire la jeringa y la aguja del tubo cónico con etanol y deje secar al aire descansando sobre una placa de Petri. Purga la aguja con aire para que se seque y déjala secar durante unos minutos.

6. Siembra de las líneas celulares epiteliales del colon Caco-2: HT29-MTX-E12

  1. Comience a cultivar líneas celulares Caco-2 y HT29-MTX 2-3 semanas antes del experimento en placas separadas recubiertas de TC de 100 mm en sus respectivos medios de crecimiento.
    1. Para los medios HT-29-MTX, use 440 ml de DMEM con glucosa alta (4,5 g / L) y medios Glutamax al 1% (v: v) con 50 ml de FBS inactivado por calor al 10% (v: v), 5 ml de estreptococo de pluma al 1% (v: v) y 5 ml de concentración final de HEPES 10 mM.
    2. Para los medios Caco-2, use 440 ml de DMEM con glucosa alta (4,5 g/L) y medios Glutamax al 1% (v:v) con 50 ml de FBS inactivado por calor al 10% (v:v), 5 ml de estreptococo Pen al 1% (v:v) y 5 ml de aminoácidos no esenciales.
      NOTA: Determine la densidad de siembra para la línea celular Caco-2 utilizando pocillos de placa de 12 pocillos recubiertos de cultivo de tejidos. Calcule el número de días hasta el 100% de confluencia dependiendo de la densidad de siembra inicial. Proporcionamos una densidad de siembra como guía; sin embargo, eso variará según la formulación del medio de crecimiento, el proveedor y el FBS utilizado. Este paso es fundamental para garantizar una monocapa para el lado epitelial intestinal del Flipwell después de que se siembran las células THP-1 y se realizan tratamientos bacterianos / SEP.
  2. Para pasar las células Caco-2 y HT-29, aspire los medios de cultivo. Lavar con 10 ml de PBS.
  3. Tripsinizar las células añadiendo 2 ml de tripsina-EDTA al 0,25%. Incubar 5-10 min a 37 °C con 5% de CO2.
  4. Agregue 7 ml del medio de crecimiento adecuado para el tipo celular a las placas. Transfiera las células a tubos cónicos estériles separados de 15 ml.
  5. Pellet por centrifugación durante 5 min a 500 x g a temperatura ambiente. Aspire el sobrenadante sin alterar el sedimento celular.
  6. Vuelva a suspender el sedimento en 1 ml de medio HT-29 precalentado a base de DMEM. Cuente las células con un hemacocitómetro o un contador de células.
  7. Combine los dos tipos de células Caco-2: HT-29 con una proporción de 9: 1 en un nuevo tubo cónico de 15 ml o 50 ml, según la cantidad de células necesarias para la cantidad deseada de Flipwells.
  8. Use Flipwells prerecubiertos de colágeno para los pasos a continuación. Cuelgue las pilas FCI prerecubiertas de colágeno del borde de la placa de Petri profunda.
  9. Sembrar 500 μL de 7,5 x 104 células por cm2 (2,6 x 105 células/inserto de 12 pocillos) por el lado apical de Flipwell. Calcule los recuentos de celdas iniciales en función del número de pilas que se utilizan. Esto incluirá ambos tipos de células en una proporción de 9:1.
  10. Cubra los conjuntos con una tapa de placa de Petri. Incubar a 37 °C con un 5% de CO2 durante la noche hasta que las células se adhieran. Las células comienzan a producir moco alrededor de los 7-10 días en cultivo. Cambia los medios cada dos días para mantener las culturas.
    NOTA: El total de días en cultivo con tratamientos debe calcularse con anticipación. El cambio y la densidad de siembra inicial dependerán de esa duración.

7. Voltear el Flipwell 3D en preparación para sembrar celdas THP-1

  1. Cuando las células Caco-2: HT-29 se adhieren y comienzan a proliferar (la confluencia exacta debe estimarse en función del medio / FBS utilizado y la duración del cultivo) pero no están al 100% de confluencia, voltee el Flipwell para sembrar células THP-1 en el otro lado de la membrana.
    NOTA: Las células THP-1 deben haberse expandido en un cultivo separado en este punto, y el número exacto de células necesarias se estimará en función del número de pilas de FCI utilizadas.
  2. Abra la tapa de la placa de Petri y aspire el medio DMEM del lado apical (epitelio intestinal) de la pila FCI.
  3. Con unas pinzas estériles, coge el Flipwell con cuidado por el gancho y gíralo 180°. Con el segundo juego de pinzas estériles, agarre la pila de FCI por el otro gancho que ahora está hacia arriba.
  4. Vuelva a colocar el conjunto en la placa de Petri y cuelgue el gancho sobre el borde de la placa de Petri. Si no está listo para sembrar las células THP-1, agregue suficiente medio a la placa de Petri profunda para elevar el nivel del medio y justo hasta la parte superior de la membrana.
    NOTA: El Flipwell debe ser estable en esta posición, y la siembra con celdas THP-1 y la adición de medios deben considerarse de inmediato ahora. Estos pasos se realizan rápidamente. Las células THP-1 deben contarse y estar listas para ser colocadas. Las células THP1 se sembraron primero para pesar la pila FCI para una mayor estabilidad y peso final. A continuación, se añadió un medio DMEM a la placa de Petri profunda para llevar el nivel del medio hasta la parte inferior de la membrana. Luego, se usó la aguja hecha a medida para eliminar la burbuja de aire, lo que estabilizó aún más la pila de FCI y permitió los ajustes finales de volumen.
  5. Use la aguja para eliminar la burbuja de aire como se describe en el siguiente paso.

8. Eliminación de burbujas de aire

  1. Preesterilizar la aguja y la jeringa en etanol y secar al aire antes de su uso (ver paso 5). Sumerja el émbolo de la jeringa.
  2. Sostenga la pila FCI por el brazo con pinzas estériles. Baje con cuidado la aguja dentro y debajo del conjunto del inserto y coloque con mucho cuidado la punta blanda de la aguja de sonda hasta la burbuja de aire.
  3. Con cuidado y muy lentamente, tire del émbolo de la jeringa hacia arriba y observe cómo la burbuja de aire desaparece lentamente. Deténgase cuando la burbuja de aire tenga aproximadamente 2 mm de diámetro, lo que es suficiente para retener una buena cobertura de DMEM para las células epiteliales del colon.
  4. Retire con cuidado la aguja y la jeringa del Flipwell. Continúe con el otro conjunto de insertos en la placa de Petri profunda.

9. Siembra THP-1 y tratamiento PMA

  1. Prepare medios THP1 con 420 ml de medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640, 50 ml de FBS inactivado por calor al 10% (v:v), 5 ml de Glutamax al 1% (v:v), 5 ml de HEPES (concentración final de 10 mM), 11 ml de glucosa (concentración final de 4,5 g/l) y 5 ml de Pen-Strep (1% v:v).
    NOTA: Las células THP-1 deben cultivarse en un medio de cultivo basado en RPMI durante varios días antes de sembrar en los insertos. Realice cálculos de recuento de celdas antes de la siembra y amplíe en función del número de pilas de FCI que se utilizarán.
  2. Prepare la suspensión celular en función de un volumen de 500 μL y a 0,5 x 106 celdas por 500 μL de medios THP-1. Si es necesario utilizar PMA para la diferenciación y polarización, agréguelo al medio RPMI a 100 ng / μL.
    1. Para hacer PMA, reconstituya 5 mg de acetato de miristato de forbol (PMA) en 1 ml de DMSO para hacer una solución madre de 5 mg/ml. Mezclar por vórtice. Alícuotas en tubos de microcentrífuga a 20 μL cada uno y almacenar a -20 °C.
    2. Para usar PMA, haga un caldo de trabajo a 50 μg / mL diluyendo 1 μL de 5 mg / mL de caldo en 99 μL (1:100) de medio de crecimiento completo. Agregue 1 μL de material de trabajo a 500 μL de medio, o 20 μL de material de trabajo a 10 mL de medio.
  3. Centrifugar las células THP-1 a 94 x g durante 5 min a RT hasta el pellet. Vuelva a suspender en 5-10 ml de medios RPMI. Cuente las células THP-1 con cualquier método de conteo preferido.
  4. Centrifugar de nuevo a 94 x g durante 5 min a RT. Volver a suspender a 0,5 x 106 células por 500 μL de medio THP-1.
  5. Agregue 500 μL de suspensión de células THP-1 al lado apical de la pila de insertos de cocultivo. Ajuste los medios HT-29 para las células epiteliales del colon agregando medios a la placa de Petri de pocillos profundos.
  6. Retire la burbuja de aire con una aguja de sonda según el paso 8, si es necesario. Cultive ambos tipos de células en la incubadora de cultivos celulares a 37 ° C, 5% de CO2, 100% de humedad hasta que las células THP-1 se adhieran (durante la noche) y proliferen durante 1-2 días.
  7. Prepárese para realizar tratamientos con SEP u otros medicamentos o prepárese para insertos bacterianos (consulte el paso 4). Comience a cultivar bacterias 1 día antes del próximo cambio de pila de FCI.

10. Segundo Flipwell Flip y eliminación de burbujas de aire para insertos SEP y bacterianos

  1. Abra la tapa de la placa de Petri. Aspirar el medio RPMI desde el lado apical. Sostenga el Flipwell por el brazo con pinzas estériles y levante la pila.
  2. Gire la pila boca abajo. Con el segundo juego de pinzas, sostenga el conjunto de pila del brazo disponible.
  3. Baje la pila a una nueva placa de Petri estéril y cuélguela sobre el borde. Agregue 500 μL de medios DMEM al lado epitelial ahora epical/intestinal.
  4. Agregue suficientes medios RPMI a la placa de Petri profunda hasta que el medio esté justo en la parte superior de la membrana. El volumen de RPMI se estimó en aproximadamente 40-55 ml, pero cambiará según la cantidad de pilas de FCI utilizadas por placa de Petri profunda.
  5. Retire la burbuja de aire usando el paso 8 dejando una burbuja de 2-3 mm. Ajuste los medios RPMI si es necesario. Cubre el plato.
  6. Cultivo hasta que las células epiteliales del colon comiencen a producir moco. Cambia los medios parcialmente cada dos días.
    NOTA: Si las células epiteliales del colon se cultivaron el tiempo suficiente y ya han producido moco, pueden proceder al inserto bacteriano o a los tratamientos. No permita que el medio en el compartimento inferior se meta debajo de la parte inferior de la membrana del inserto. Agregue más medios DMEM para mantener el nivel de medios en la membrana. El método ideal para cambiar el medio es quitar la mitad del medio del compartimento basolateral y dejar un pequeño volumen de medio en el compartimento apical para evitar la infiltración de aire.
  7. Para los tratamientos SEP, agregue SEP a la concentración final de 100 μM a los pocillos en este momento si no se usa el cultivo bacteriano. Si se utilizan cultivos bacterianos e insertos, agregue SEP al cultivo bacteriano. Para el cultivo bacteriano, consulte el paso 11.
    1. Para hacer SEP, agregue 100 mg de L-Sepiapterina a 84.3 ml de DMSO y mezcle por vórtice. Alícuota en tubos de microcentrífuga de 100 μL cada uno. Almacenar a -20 °C. Utilice alícuotas SEP a 1 μl por 500 μl de medio por conjunto de inserto (concentración final de 100 μM).

11. Inicio del cultivo bacteriano (opcional)

  1. Para estudiar el efecto de los metabolitos bacterianos en las células inmunitarias, la mucosidad y el epitelio del colon, agregue un inserto bacteriano al lado apical del conjunto del inserto. Para la construcción de insertos bacterianos, siga el paso 4. Cultivamos Bacillus subtilis el día antes del uso del inserto bacteriano.
  2. Prepare y autoclave el Miller LB 2 días antes del uso del inserto bacteriano. Para hacer LB, combine 6,25 g de Miller LB con 250 ml de agua desionizada en un matraz de vidrio de 500 ml. Cubra con papel de aluminio. Autoclave, enfriar a RT. Puede almacenar LB estéril a 4 °C o RT.
  3. Comience a cultivar bacterias Bacillus subtilis a partir de existencias de glicerol el día antes del uso del inserto bacteriano.
  4. Para iniciar el cultivo bacteriano, inocular 10 mL de Miller LB con Bacillus subtilis de un caldo de glicerol congelado dentro de un tubo cónico estéril de 50 mL. No deje que el caldo de glicerol se descongele.
  5. Con una punta estéril de 200 μL, recoja una pequeña cantidad de bacterias del caldo de glicerol. Expulse la punta en 10 ml de LB en el tubo cónico estéril de 50 ml.
  6. Si usa SEP, comience el tratamiento con 20 μL de stock de SEP (la concentración final debe ser de 100 μM). Agregue directamente al cultivo bacteriano de 10 ml en el cultivo iniciador de tubo cónico de 50 ml.
  7. Cultivar Bacillus subtilis durante 8 h en una incubadora agitadora a 220 rpm y 37 °C. Agregue el segundo tratamiento de SEP al final del día: agregue 20 μL de SEP a la concentración final de 100 μM a los 10 mL de LB con bacterias.
  8. Cultivo durante la noche a 220 rpm, 37 °C. Agregue el tercer tratamiento de 20 μL de SEP a 10 mL de LB con Bacillus subtilis a la mañana siguiente y continúe agitando hasta que esté listo para hacer los insertos bacterianos.

12. Adición de inserto bacteriano al Flipwell (opcional)

  1. Realice la construcción del inserto bacteriano como se describe en el paso 4. Realice el cultivo bacteriano como se describe en el paso 11.
    NOTA: Si hay disponible un gabinete de cultivo celular separado, funcionará mejor. De lo contrario, divida el área de trabajo dentro de un gabinete de cultivo celular por la mitad. Mantener separados los cultivos bacterianos y celulares. Los cultivos celulares no deben devolverse a la incubadora de cultivos celulares. El BSC deberá esterilizarse y exponerse a los rayos UV durante 24 horas o más después de realizar este método.
  2. Use dos pares de fórceps estériles para los pasos a continuación. Todos los pasos a continuación deben realizarse en el BSC.
  3. Con fórceps, levante el inserto estéril de 24 pocillos prefabricado de su embalaje. Coloque el inserto dentro de una placa de Petri estéril y cubra la tapa.
  4. Repita para la cantidad de insertos bacterianos necesarios. Transfiera la placa de Petri con los Flipwells de la incubadora al BSC y déjela a un lado opuesto de la placa con inserciones bacterianas.
  5. Saque 300 μL del medio DMEM del lado apical (superior) del Flipwell para permitir el inserto bacteriano. Deje unos 200 μL en la parte superior de la pila FCI. Coloque la tapa de la placa de Petri sobre los conjuntos de insertos.
  6. Agregue 50-100 μL de cultivo de B. subtilis a los insertos bacterianos de 24 pocillos. Tenga cuidado de no derramar ni contaminar la pared exterior y el borde del inserto bacteriano. OD600 se puede tomar para monitorear la fase de crecimiento del cultivo.
  7. Con pinzas estériles, levante el inserto bacteriano con cultivo e insértelo con cuidado dentro de la parte superior del Flipwell. Gire el brazo y cuélguelo del borde de la pila FCI. Sostenga la pila con el segundo juego de pinzas estériles.
  8. Repita para el resto de las pilas de FCI. Cubra la placa de Petri y descanse dentro del BSC 3 h. No lo introduzca en la incubadora.
  9. Después de 3 h, use pinzas estériles para quitar el inserto bacteriano del Flipwell. Repita para el resto de los conjuntos de insertos. Deseche los insertos bacterianos.
    NOTA: Deseche las bacterias y los insertos bacterianos según las políticas de eliminación de desechos biopeligrosos de la institución y las pautas de seguridad y salud. No se examinaron los componentes bacterianos o las bacterias en sí.
  10. Para analizar los cambios en los compartimentos mucoso, epitelial e inmunocelular, proceda a lavar las membranas y prepararlas para la obtención de imágenes.
  11. Aspira el medio DMEM desde la parte superior de Flipwell. Lavar con 500 μL de PBS estéril. Con fórceps, saque la pila de FCI de la placa de Petri y transfiérala a una nueva placa de Petri.
  12. Voltee el Flipwell y cuélguelo sobre el borde de la placa de Petri. Lave la membrana con 500 μL de PBS estéril.
  13. Si se requiere almacenamiento, almacene las pilas de FCI a corto plazo (30 min-overnight) en PBS estéril dentro de un tubo cónico de 50 ml.
    NOTA: Es importante determinar qué método de imagen se utilizará a continuación y si la membrana se cortará por la mitad tanto para la microscopía electrónica como para el etiquetado de anticuerpos fluorescentes.

13. Desmontar el Flipwell para microscopía electrónica de barrido (SEM)

NOTA: Para examinar los cambios morfológicos en las células epiteliales del colon y los macrófagos después de los tratamientos con SEP/bacterias, fijamos las membranas en un tampón de fijación y luego desmontamos los Flipwells para microscopía electrónica de barrido (SEM). PFA se utilizó como fijador; sin embargo, también se puede usar glutaraldehído. Es importante consultar con el núcleo de microscopía sobre su tampón de fijación preferido, los pasos específicos de deshidratación y las concentraciones iniciales del tampón de fijación. Las membranas se pueden almacenar en el tampón de fijación si es necesario el almacenamiento. El trabajo se puede realizar fuera del BSC. Si el núcleo de imágenes va a pegar la membrana, se puede cortar por la mitad y colocar para obtener imágenes de ambos lados por separado.

  1. Con un marcador a prueba de solventes, etiquete los lados de plástico de la pila FCI con un código de símbolo para el tipo de celda utilizado. Alternativamente, etiquete la membrana directamente con un punto, una marca de verificación o una x para etiquetar el tipo de celda utilizado.
  2. Coloque el Flipwell dentro de un tubo cónico de 50 ml sin desmontarlo. Agregue un 4% de PFA suficiente para sumergir la pila. Mantener en PFA al 4% durante la noche.
    1. Para hacer PFA al 4% (sin metanol), disuelva 40 g de paraformaldehído en 800 ml de 1x PBS. Para hacer PFA al 0,4%, disuelva 4 g de paraformaldehído en 800 ml de 1x PBS o diluya PFA al 4% 1:10 con 1x PBS agregando 100 ml de PFA al 4% a 900 ml de 1x PBS.
  3. Cambie PFA por 0.4% para un almacenamiento más prolongado. Consulte el núcleo de microscopía para conocer la duración del almacenamiento y los búferes.
  4. Para desmontar el Flipwell, sujétalo con ambas manos y gira cada parte pegada de la pila. La pila se desmontará en dos partes: una parte tendrá la membrana y la otra será el inserto sin la membrana. Deseche el inserto sin la membrana.
  5. Gire el inserto con la membrana y colóquelo con la membrana hacia arriba. Puede etiquetar la membrana con un pequeño punto o x en el borde de la membrana para saber qué lado tiene qué tipo de célula.
  6. Sostenga el inserto por la pared con fórceps. Corte con cuidado la membrana con una hoja de bisturí y colóquela dentro de un tubo de 1,7 ml o una botella de vidrio pequeña con 500 μl-1 ml de solución de PFA al 0,4%-4%.
  7. Envíe al núcleo de microscopía para los pasos de deshidratación y las imágenes. Los pasos de deshidratación se describen en Beamer et al7.
  8. Deseche PFA u otros fijadores según las políticas de eliminación de desechos peligrosos prescritas por la organización y las pautas de salud y seguridad.

14. Método de gotas grandes para desmontar el Flipwell para microscopía confocal

NOTA: Se creó un nuevo método para teñir y obtener imágenes de las membranas. La pila de insertos de cocultivo se mantuvo intacta con pasos iniciales de fijación, permeabilización y bloqueo realizados dentro de un tubo cónico de 50 mL. Se utilizó el marcado inmunofluorescente y la microscopía confocal para obtener imágenes de ambos lados de la membrana. Se utilizó el nuevo método de placa de 12 pocillos para los pasos de incubación durante la noche, y se utilizó un método de gotas grandes para teñir la parte inferior del inserto desmontado. Se utilizó una pila en Z confocal para obtener imágenes de ambos lados con la membrana. Las membranas teñidas se intercalaron entre dos cubreobjetos circulares de vidrio, y el conjunto intercalado se colocó en el medio entre dos anillos metálicos de la cámara redonda fabricada comercialmente para la imagen. Se utilizó un microscopio confocal de barrido láser multifotón con software de imágenes comercial.

  1. Para lavar la membrana, coloque la pila de insertos de cocultivo directamente en un tubo cónico de 50 ml y agregue 15 ml de PBS estéril o lave cada lado por separado (descrito a continuación).
  2. Aspire el DMEM y agregue 300 μL de PBS estéril en el lado apical. Aspire PBS y retire con cuidado la pila de la placa de Petri.
  3. Voltee el Flipwell y agregue 300 μL de PBS al RPMI ahora hacia arriba de la pila FCI. Aspirar el PBS.
  4. Con un marcador resistente a solventes, etiquete el lado superior e inferior de la pila para saber qué lado tiene qué tipo de celda.
  5. Coloque el Flipwell dentro de un tubo cónico estéril de 50 ml. Agregue 15 ml de PFA estéril al 4% como tampón de fijación inicial durante 10 min. Si se necesita incubación durante la noche, cambiar por 15 ml de PFA al 0,4% en PBS, cubrir y dejar durante la noche.
  6. Para continuar con la inmunotinción, haga un espacio de banco para el método de gotas grandes.
    Corta trozos de plástico de 10 x 14 pulgadas y pégalos con cinta adhesiva al banco en las esquinas para crear una superficie lisa.
  7. Con una pipeta de 200 μl, cree una gota grande con 200 μl de PBS. Gire el conjunto de insertos para separarlo en los insertos.
  8. Con un marcador resistente a solventes, coloque un pequeño punto cerca del borde de un lado de la membrana para saber qué tipo de célula se utiliza para la tinción y la obtención de imágenes.
  9. Retire cualquier junta de silicona residual del fondo del inserto si el inserto con la membrana todavía tiene pegamento residual. Esto se hace para garantizar que el inserto permanezca en posición vertical durante los pasos a continuación.
  10. Coloque con cuidado la pila de FCI (con células THP-1) encima de la gota grande de 200 μL de PBS. Añadir 200 μL de tampón de permeabilización en la parte superior con células epiteliales de colon y mantener durante 10 min.
    1. Para preparar el tampón de permeabilización, use Triton-X100 al 0,1% v/v en PBS.
  11. Aspirar y añadir 200 μL de PBS. Repita este lavado 2 veces. Cree una nueva gota con 250 μL de tampón de bloqueo.
    1. Para hacer tampón de bloqueo, agregue 250 μL de suero de cabra normal en 5 mL de 1x PBS (suero final al 5%). Añadir 15 μL de Triton-X100 (0,3% v:v final). Mezclar bien y almacenar a 4 °C durante 1-2 días.
  12. Coloque el inserto encima del búfer de bloqueo. Bloquear durante 30 min a temperatura ambiente. Aspire PBS desde el lado apical y agregue 200 μL de tampón de bloqueo a la parte superior del inserto. Ambos lados de la membrana ahora están listos para la tinción de anticuerpos durante la noche.

15. Tinción inmunofluorescente (IF)

NOTA: La tinción se realiza durante la noche utilizando un método de placa de 12 pocillos o en un banco utilizando un método de gotas grandes.

  1. Prepare los anticuerpos necesarios para ser utilizados para teñir ambos lados de la membrana durante la noche a 4 °C o en el banco a temperatura ambiente. Diluya todos los anticuerpos 1:100 en BSA al 1% en PBS. Alternativamente, siga las recomendaciones del fabricante y optimice la tinción para determinar las concentraciones ideales y el tampón de dilución de anticuerpos.
  2. Método de gota grande
    1. Crea un rectángulo grande con una envoltura de plástico en la parte superior del banco y pega las esquinas con cinta adhesiva. Pipetear 200 μL de anticuerpo diluido sobre el plástico para crear una gota grande. Coloque la membrana de inserción sobre la gota grande.
    2. Agregue 200 μL de Ab primario a la parte superior del inserto. Incubar a temperatura ambiente durante 2 h.
  3. Método de placa de 12 pocillos
    1. Si usa un método de placa de 12 pocillos durante la noche, agregue 300 μL de anticuerpo primario en la parte superior del inserto.
    2. Agregue 300 μL de anticuerpo primario al pocillo de la placa de 12 pocillos. Coloque el inserto dentro del pocillo de la placa de 12 pocillos encima de la gota. Cubra el plato con una tapa y colóquelo a 4 °C durante la noche.
  4. Cuando se complete la tinción, lave ambos lados de la membrana con PBS. Con una pipeta y una punta de 200 μl, enjuague cuidadosamente la parte inferior del inserto 3 veces con 200 μl de PBS. Para la parte superior del inserto, lave agregando 200 μL de PBS en la parte superior, aspirando y repitiendo el lavado 3 veces.
  5. Prepare todos los anticuerpos secundarios (consulte la Tabla de materiales para conocer los anticuerpos específicos utilizados) según las recomendaciones del fabricante o la dilución 1:1000 en BSA al 1% en PBS u otro. La tinción secundaria de anticuerpos debe realizarse en la oscuridad; Use una caja de cartón o un cajón de un gabinete para crear un ambiente libre de luz.
  6. Usando un método de gota grande o un método de placa de 12 pocillos, prepare una nueva placa estéril. Incubar durante 2 h a temperatura ambiente en un ambiente oscuro. Lavar como se describe en 15.4.

16: Preparación para imágenes confocales

  1. Si la membrana aún no se ha etiquetado como se describe en el paso 14, etiquétela para conocer la ubicación del tipo de célula. Coloque una pequeña marca (punto, x, check, etc.) con un marcador resistente a solventes en cualquier lugar (se prefiere el borde).
  2. Retire con cuidado los cubreobjetos redondos del recipiente de almacenamiento y colóquelos suavemente sobre la superficie del banco.
  3. Diluir DAPI en PBS a 1:100 de dilución. Para dispensar DAPI con el dispensador de gotas, agregue de 1 a 3 gotas en el centro del cubreobjetos. De lo contrario, pipetea de 1 a 3 gotas de DAPI en el centro del cubreobjetos.
  4. Sostenga el inserto con fórceps. Corta con cuidado la membrana con una hoja de bisturí con un movimiento circular alrededor del borde / borde inferior. No deje que la membrana caiga sobre el banco. Coloque el inserto de plástico en el banco y sostenga la membrana con fórceps mientras corta las fibras finales con la hoja de bisturí.
  5. Coloque el inserto encima del DAPI. Dispense de 1 a 3 gotas de DAPI (dilución 1:100) en la parte superior de la membrana para que ambos lados de la membrana tengan DAPI.
  6. Levante el cubreobjetos de la segunda ronda con los dedos (use EPP). No use fórceps ya que el cubreobjetos es muy frágil.
  7. Alinee el segundo cubreobjetos sobre el primer cubreobjetos y bájelo con cuidado sobre la membrana.
  8. Con un marcador resistente a solventes, etiquete cuidadosamente el lado de la cubierta si es necesario para codificar el tipo / orientación de la celda (opcional). Si la membrana estaba etiquetada, omita este paso.
  9. Dependiendo del número de cubreobjetos que se van a fotografiar y del número de anillos metálicos disponibles, monte los cubreobjetos entre los anillos metálicos fabricados comercialmente para mantener unidos los cubreobjetos redondos para la obtención de imágenes o guárdelos en la oscuridad hasta la obtención de imágenes.
  10. Para obtener imágenes, monte el cubreobjetos con la membrana entre los anillos metálicos de la cámara celular y colóquelo en el soporte del microscopio confocal. Póngase en contacto con el núcleo de microscopía confocal antes de ver qué soporte puede ser necesario para obtener imágenes de los resbalones redondos de la cubierta.
  11. Cuando esté listo para la imagen, envuelva cada sándwich en papel de aluminio y llévelo a las instalaciones.
  12. Con la función Z-stack, escanee cada lado de la membrana individualmente utilizando la longitud de onda adecuada según los fluoróforos utilizados. Voltea e imagina el segundo lado. Para guardar los cubreobjetos, manténgalos en la oscuridad a 4 °C.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Para determinar la relevancia biológica de los cocultivos de Flipwell de bacterias intestinales, epitelios de colon y macrófagos, tratamos los cocultivos con sepiapterina (SEP), un modulador del metabolismo de la arginina, para promover la producción de óxido nítrico 9,10,11 en comparación con el DMSO de control. Determinamos los efectos del tratamiento con SEP en cada componente de los cocultiv...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Para recrear la arquitectura de la mucosa intestinal in vitro, hemos diseñado un sistema de cocultivo simple que comprende capas estratificadas de bacterias intestinales, células epiteliales del colon productoras de moco y macrófagos. Este sistema de cocultivo múltiple nos ha permitido estudiar los efectos de la diafonía entre el secretoma bacteriano, el epitelio intestinal y los macrófagos en la inducción de la reprogramación inmunogénica y los mecanismos de defensa de la mucos...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses. Por la presente, los autores renuncian a todas las garantías, ya sean expresas o implícitas, en la mayor medida permitida por la ley. Bajo ninguna circunstancia los autores serán responsables, ya sea bajo cualquier estatuto, contrato, agravio o cualquier otra teoría legal, por cualquier daño especial, incidental, indirecto, punitivo, múltiple o consecuente que surja o esté relacionado con el uso de herramientas en la construcción de los Flipwells, el uso de reactivos BSL, líneas celulares, cultivos bacterianos, el uso del sistema Flipwell en un ambiente anaeróbico en una cámara anaeróbica. Esta limitación de responsabilidad incluye, entre otros, cualquier forma no especificada de uso de Flipwell que no se describa explícitamente en este documento.

Agradecimientos

La autora principal expresa su sincera gratitud a la Dra. Saori Furuta por sus excelentes habilidades de tutoría, orientación y apoyo continuos a través de largas distancias y diseño de proyectos hábiles y continuos que fomentan fantásticas oportunidades de aprendizaje. Los autores también agradecen a la Dra. Vandana Sharma por su experiencia y orientación en microbiología y al Dr. Veani R. Fernando por la preparación de macrófagos THP-1.  Además, los autores agradecen a los Dres. Andrew Kleinhenz y William T. Gunning en la Instalación de Microscopía Electrónica, y a Cassandra Zamora y Kristin Kirschbaum en el Centro de Instrumentación de la Universidad de Toledo por sus sugerencias constructivas para las imágenes EM. Este trabajo fue apoyado por el fondo inicial del Campus de Ciencias de la Salud de la Universidad de Toledo, Facultad de Medicina y Ciencias de la Vida, Departamento de Biología del Cáncer a S.F; Subvención de investigación del cáncer de Ohio (Proyecto #: 5017) a S.F; Premio de la Sociedad de Investigación Médica (Fundación Toledo, #206298) a S.F; Beca de investigación de la Sociedad Americana del Cáncer (RSG-18-238-01-CSM) a S.F; y la Beca de Investigación (R01CA248304) del Instituto Nacional del Cáncer a SF.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,4% PFA (véase la receta en Reactivos y Soluciones)Descrito en el texto
Pipeta sorológica de 10 mlCorning4488
Placa TC de 12 pozos,   Compañero de repartoCorning3513
Tubos cónicos de 15 ml, SpectraTubeAlkali ScientificC2715
200 y micro; l tips USA Scientific1111-1700
Insertos de 24 pozos - Insertos de cultivo para placas de 24 pozos, PET 0.4 y micro; M BrandTech Scientific782710
Flipwells 3D prefabricados, esterilizados por UV Laboratorio de fabricación
4% PFA (véase la receta en Reactivos y Soluciones)Descrito en el texto
Fondo de Sepiapterin de 50 mM (SEP, ver receta en Reactivos y Solución)Carrera en Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
Tubos cónicos de 50 mlGreiner Bio-One227261
Pipeta serológica de 5 mlCorning4487
70-95% de etanol (alcohol etílico)Laboratorios de Descontaminación04-355-151
Papel de aluminioFisher Scientific01-213-100
Agujas de alimentación animal, calibre 20 1,5" longitud, de un solo uso Fisher Scientific01-208-87
Buffer de dilución de anticuerpos (véase la receta en Reactivos y Soluciones)Descrito en el texto
Cámara Celular Attofluor  ThermoFisher ScientificA7816
Cinta de autoclaveFisher Scientific15-901-111
Cepas de Bacillus subtilis wt (3A1T) en stock de glicerol ()Centro Genético de Stock de Bacillus (https:// bgsc. org/
Guantes BioGrip Pink Nitrilo sin polvo sin látexFabricación de alta calidadP2810
Buffer bloqueador (véase la receta en Reactivos y Soluciones - Suero de Cabra Normal al 10% en PBS)Descrito en el texto
Buffer de bloqueo (véase la receta en Reactivos y Soluciones)Descrito en el texto
Microscopio de campo claro (Nikon o equivalente) Eclipse Ts2NikonTS2
Celdas Caco-2ATCCHTB-37
Incubadora de cultivo celular, 37 y grados; C, 5% CO2 (Eppendorf CellXpert)Eppendorf6734010015
Centrifugadora (Eppendorf, centrífuga 5804/5804 R o equivalenteEppendorf22622501
Tubos centrífugas de 50 ml SpectraTubeAlkali ScientificC2750
Insertos de cultivo para placa de 12 pozos, PET, 0,4 y micro; m, estérilBrandTech Scientific, BRAND Insert 2en1, BIO-CERT782730
Medio de montaje DAPI VectaShieldLaboratorios VectorH-1000
Fondo profundo de placa de Petri, placa de Petri apilable de poliestireno de 100 x 25 mm de profundidad, estéril y nbsp;USA Scientific8609-0625
XP de ayuda de pipeta DrummondDrummond y Drummond;4-000-101
Centrífuga Eppendorf 5804 con rotor oscilante para tubos cónicos de 50 mlEppendorf22622501
Pinzas, acero inoxidable, autoclave estéril, 2 juegosVWR82027-438
Pinzas, acero inoxidable, autoclave estéril, 2 juegos, pinzas para muestrasVWR82027-438
Matraz de cristal 500 mlCorning 4980-500
Hemacitómetro (Neubauer con llaves de cobertura)Thermo Fisher Scientific50-312-90
Celdas HT-29-MTX-E12Millipore Sigma12040401
ImmunoPen (opcional)Fisher Scientific4021761EA
Guantes resistentes a base de Kevlar u otros cortes (opcional)Ferretería o Amazon
Cinta de laboratorio o cinta de envíoFisher Scientific & nbsp;159015R
Campana de flujo laminar Serie 1300 A2 BSC Clase IIThermoFisher Scientific1375
Campana de flujo laminar con luz UV SterilGARDLa Compañía BakerSG403A-HE
Marcadores a prueba de disolventesVWR52877-310 o 95042-566
Medios para células Caco-2 (DMEM a base de alta glucosa, véase la receta en Reactivos y Soluciones)descrito en   Mensaje de texto
Medios para células HT-29 (DMEM Glucosa alta, véase la receta en Reactivos y Soluciones)Descrito en el texto
Medios para células THP-1 (RPMI, véase la receta en Reactivos y Soluciones)Descrito en el texto
Tubo de microcentrífuga, 1,7 ml, estéril y nbsp;Alkali ScientificC3017-ST
Tubos microcentrífugasThermo Fisher3451
Medios Miller LB (véase la receta en Reactivos y Soluciones)Sigma-Aldrich  L3522
Alicates de punta fina, 2 juegosFerretería o Amazon
Guantes sin látex sin polvo de nitrilo Aurelia AmazingMidSci92885
Tapas de placa de Petri, estéril tipo placa de Petri de halcón de 100x15 mmCorning Inc351029
Acetato de mirestado de phorbol (PMA) (100 ng/μ l, véase la receta en Reactivos y Soluciones) y nbsp;InvivoGenTlrl-pma
Puntas de pipete (10 y micro; 1, 200 & micro; 1000 y micro; l) PurePoint o equivalenteAlkali Scientific y nbsp;ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS
Película transparenteAbacería
Solución de colagénasa de trabajo Purecol (100 & micro; g/mL)BioMatrix Avanzada5005-100ML
Tapas redondas #1 1 oz (Corning Float Glass o Fisherbrand)Corning o Fisherbrand50143822 o 12-546-2 25CIR-2
Bisturí, estériles, desechables y nbsp;Mopec o Feather #10AJ136 o 2975#10
Sepiapterina (septiembre, 100 y micro; M, consulta la receta en Reactivos y Solución)Carrera en Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
Incubadora agitada ajustada a 220 rpm 37&º; CEppendorf New Brunswick ScientificM12990080
Adhesivo de silicona Loctite Silicona transparente IDH o 3M Marine Grade Silicon Clear transparente con punta de narizLoctite o 3M1745658 o PN08019
Pipeta de canal único Eppendorf Research Plus, 200 y micro; lEppendorf
Pipetas de canal único (10 y micro; 1, 200 & micro; 1000 y micro; l)Eppendorf2231001122
Espectrofotómetro NanoDropOneCThermo Fisher Scientific13-400-519
Agua desionizada estéril    
Serina estéril tamponada con fosfato (PBS) sin calcio ni magnesioFisher Scientific  BSS-PBS-1X6
Jeringuilla de 3 ml o 5 ml con punta Luer-LokBD309585 o 309603
Celdas THP-1ATCCTIB-202
Pipetas de transferencia, estérilesFisherbrand13-711-20
Triton X-100Millipore SigmaX100
Solución azul de tripánVWR97063-702
Tripsina-EDTA 0,25%Thermo Fisher Scientific25200-056
Limpia a Kimwipes Professional con el Poliescudo Anti-Estadísticas LintGuardKimberly-Clark34120
Anticuerpos primarios: 
Antihumano CD163Abcam156769
Anti-humano CD68Novus BiologicalsNB100-683-0,1 mg
Antihumano CD80, E3Q9VTecnologías de señalización celular15416
Anti-humano CK20 Tecnologías de la vidaPA5-82875
MUC2 antihumano (996/1)ThermoFisherMA5-12345
Anticuerpos secundarios:
Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit IgG (para CD80 y CK20)ThermoFisherA11008
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (para MUC2 y CD68 o CD163)ThermoFisherA11005
Reactivos y Soluciones:   
Caco-2 Medio:
DMEM con glucosa alta (4,5g/L) y 1% (v:v) de GlutaMax Thermo Fisher Scientific35050061
FBS 10% (v:v) inactivado por calorSigmaF2242-500ML
Aminoácidos no esenciales 1% para medios Caco-2Thermo Fisher Scientific11140076
Estreptococo de pluma 1% (v:v)SigmaF2242-500ML
HT-29-MTX Media
DMEM con glucosa alta (4,5g/L) y 1% (v:v) de GlutaMax Thermo Fisher Scientific35050061
FBS 10% (v:v) inactivado por calorSigmaF2242-500ML
HEPES (concentración final de 10 mM)Thermo Fisher Scientific15630080
Estreptococo de pluma 1% (v:v)SigmaF2242-500ML
THP-1 Medio:
Suero fetal bovino inactivado por calor (FBS) (10% v:v)Sigma F2242-500ML
Glucosa (concentración final de 4,5 g/L)Thermo Fisher ScientificA249001
GlutaMax 1% (v:v)  Concentración final de 2 mMThermo Fisher Scientific35050061
HEPES (concentración final de 10 mM)Thermo Fisher Scientific15630080
Estreptococo de pluma 1% (v:v)SigmaF2242-500ML
Instituto Conmemorativo Roswell Park (RPMI)-1640 medioThermo Fisher Scientific11875119
Piruvato de sodio (concentración final de 1 mM)Thermo Fisher Scientific11360070
Purecol (dilución a 1:30 100 & micro; g/ml):
Purecol 3 mg/ml 1:30 a 100 y micro; g/ml BioMatrix Avanzada5005-100ML
Agua desionizada estéril
L-Sepiapterin (50 mM):
L-Sepapterina (SEP)Carrera en Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
5 mg/mLInvivoGenTlrl-pma
BSA 1% albúmina sérica bovina  Sigma-Aldrich5470
DMSO Sigma D2650
Miller LBSigma-Aldrich  L3522
Suero normal de la misma especie que el anticuerpo secundarioSigma NS02L-1ML
ParaformaldehidoSigma-Aldrich441244

Referencias

  1. Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications. J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).
  2. Xuan, C., et al. Microbial dysbiosis is associated with human breast cancer. PLoS One. 9 (1), e83744(2014).
  3. Yoo, J. Y., Groer, M., Dutra, S. V. O., Sarkar, A., McSkimming, D. I. Gut Microbiota and Immune System Interactions. Microorganisms. 8 (10), 1587(2020).
  4. Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (1), E7-E15 (2016).
  5. Donkers, J. M., Eslami Amirabadi, H., van de Steeg, E. Intestine-on-a-chip: Next level in vitro research model of the human intestine. Curr Opinion Toxicol. 25, 6-14 (2021).
  6. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Sci Rep. 7, 45270(2017).
  7. Beamer, M. A., et al. Novel 3D Flipwell system that models gut mucosal microenvironment for studying interactions between gut microbiota, epithelia and immunity. Sci Rep. 13 (1), 870(2023).
  8. Beamer, M. A., Furuta, S. Redefining Cell Culture Using a 3D Flipwell Co-culture System: A Mimetic for Gut Architecture and Dynamics In Vitro. Curr Protoc. 5 (2), e70107(2025).
  9. Fernando, V., et al. Reprogramming of breast tumor-associated macrophages with modulation of arginine metabolism. Life Sci Alliance. 7 (11), e202302339(2024).
  10. Sharma, V., et al. Immunogenic shift of arginine metabolism triggers systemic metabolic and immunological reprogramming to suppress HER2 + breast cancer. Cancer Metab. 13 (1), 15(2025).
  11. Zheng, X., et al. Correction of arginine metabolism with sepiapterin-the precursor of nitric oxide synthase cofactor BH(4)-induces immunostimulatory-shift of breast cancer. Biochem Pharmacol. 176, 113887(2020).
  12. Ren, G., et al. Reduced Basal Nitric Oxide Production Induces Precancerous Mammary Lesions via ERBB2 and TGFβ. Sci Rep. 9 (1), 6688(2019).
  13. Trejo, M., et al. Elasticity and wrinkled morphology of Bacillus subtilis pellicles. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (6), 2011-2016 (2013).
  14. Sadaghian Sadabad, M., et al. A simple coculture system shows mutualism between anaerobic faecalibacteria and epithelial Caco-2 cells. Sci Rep. 5, 17906(2015).
  15. Umehara, Y., Aoyagi, H. Development of a simple cultured cell-anaerobic microbial co-culture system using liquid paraffin. J Biosci Bioeng. 135 (6), 487-492 (2023).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Cocultivo 3DModelo de Mucosa IntestinalSecretoma BacterianoPolarización de Células InmunesCélulas Epiteliales del ColonPolarización de MacrófagosFormación de BiofilmTratamiento con SepiapterinaTinción Inmunofluorescente
Ingeniería 3D Flipwell para el desarrollo de sistemas asíncronos para terapias toxicológicas e inmunomoduladoras en células bacterianas, intestinales e inmunitarias
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.