Ingeniería 3D Flipwell para el desarrollo de sistemas asíncronos para terapias toxicológicas e inmunomoduladoras en células bacterianas, intestinales e inmunitarias

Maria A. Beamer; Saori Furuta

doi:10.3791/68701

Method Article

Ingeniería 3D Flipwell para el desarrollo de sistemas asíncronos para terapias toxicológicas e inmunomoduladoras en células bacterianas, intestinales e inmunitarias

DOI:

10.3791/68701

⸱

October 17th, 2025

Maria A. Beamer¹ , Saori Furuta²

¹Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, ²MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artículo proporciona un protocolo detallado con pasos clave para guiar la ingeniería y utilización de 3D Flipwell. Describimos y mostramos cómo ensamblar las pilas de insertos de cocultivo y utilizarlas para cocultivar capas estratificadas de bacterias intestinales, epitelios intestinales y macrófagos para modelar el entorno de la mucosa intestinal.

Abstract

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Para estudiar las funciones del secretoma bacteriano en la polarización de las células inmunitarias y la homeostasis de la mucosa intestinal, desarrollamos un modelo de cocultivo tridimensional utilizando insertos disponibles comercialmente en un formato apilado espalda con espalda. Denominamos a este sistema 3D Flipwells, y cocultivamos con éxito bacterias, epitelio de colon y células inmunitarias en capas estratificadas para recapitular el microambiente de la mucosa intestinal. Este sistema de cocultivo permite la siembra de células epiteliales de colon en un lado de la membrana y monocitos no adherentes indiferenciados en el otro, lo que permite la progresión sincrónica de la polarización epitelial del colon, la formación de moco y la diferenciación y polarización de monocitos-macrófagos dentro de un solo cocultivo sin la necesidad de separar y volver a colocar macrófagos prediferenciados. Este sistema es fácil de construir y solo requiere unos pocos materiales y herramientas fácilmente disponibles. Probamos su utilidad analizando las respuestas de los componentes de cocultivo a la sepiapterina (SEP), el precursor endógeno de BH₄ (tetrahidrobiopterina), un cofactor de la óxido nítrico sintasa (NOS). Demostramos que el tratamiento SEP de 3D Flipwell indujo la formación de biopelículas por bacterias intestinales, la producción de moco por el epitelio del colon y la polarización proinmunogénica de los macrófagos. Esto indicó que SEP desencadenó la activación de un mecanismo de defensa de la mucosa a través de la diafonía entre diferentes componentes celulares. Se necesitan más experimentos para investigar el papel de las comunicaciones de la mucosa que conducen a la reprogramación de las células inmunitarias y para evaluar la utilidad de este sistema de cocultivo para detectar nuevas terapias inmunomoduladoras.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La diafonía entre las células inmunitarias y el microbioma intestinal influye en gran medida en la eficacia de los diferentes tratamientos de enfermedades. Dicha diafonía se ve notablemente modificada por estímulos externos, que incluyen, entre otros, anomalías metabólicas del huésped, cambios en la dieta, manifestación de enfermedades y tratamiento farmacológico. Estos cambios podrían conducir a un desequilibrio en la composición de la microflora, una condición denominada disbiosis ^1,2,3.

Para comprender mejor las....

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Protocol

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1. 3D Ingeniería Flipwell

Todo el trabajo debe realizarse dentro de un gabinete de cultivo celular. Coloque todos los suministros dentro del gabinete.
Abra la tapa de la placa de Petri y reserve. Abra la hoja del bisturí de su carcasa protectora y colóquela en el borde del fondo de la placa de Petri. Asegurar la esterilidad.
PRECAUCIÓN: Se requiere un manejo cuidadoso de la hoja del bisturí. Use guantes resistentes a cortes y reforzados con fibra para proteger las manos si es necesario.
Abra el embalaje protector estéril del inserto comercial de 12 pocillos. Asegurar la esterilidad. ....

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Results

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Para determinar la relevancia biológica de los cocultivos de Flipwell de bacterias intestinales, epitelios de colon y macrófagos, tratamos los cocultivos con sepiapterina (SEP), un modulador del metabolismo de la arginina, para promover la producción de óxido nítrico ^9,10,11 en comparación con el DMSO de control. Determinamos los efectos del tratamiento con SEP en cada componente de los cocultiv.......

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Discussion

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Para recrear la arquitectura de la mucosa intestinal in vitro, hemos diseñado un sistema de cocultivo simple que comprende capas estratificadas de bacterias intestinales, células epiteliales del colon productoras de moco y macrófagos. Este sistema de cocultivo múltiple nos ha permitido estudiar los efectos de la diafonía entre el secretoma bacteriano, el epitelio intestinal y los macrófagos en la inducción de la reprogramación inmunogénica y los mecanismos de defensa de la mucos.......

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Disclosures

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Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses. Por la presente, los autores renuncian a todas las garantías, ya sean expresas o implícitas, en la mayor medida permitida por la ley. Bajo ninguna circunstancia los autores serán responsables, ya sea bajo cualquier estatuto, contrato, agravio o cualquier otra teoría legal, por cualquier daño especial, incidental, indirecto, punitivo, múltiple o consecuente que surja o esté relacionado con el uso de herramientas en la construcción de los Flipwells, el uso de reactivos BSL, líneas celulares, cultivos bacterianos, el uso del sistema Flipwell en un ambiente anaeróbico en una cámara anaeróbica. Esta limitación de responsabilidad incluye, entre otros, cualquier forma no especificada de uso de Flipwell que no se describa explícitamente en este documento.

Acknowledgements

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La autora principal expresa su sincera gratitud a la Dra. Saori Furuta por sus excelentes habilidades de tutoría, orientación y apoyo continuos a través de largas distancias y diseño de proyectos hábiles y continuos que fomentan fantásticas oportunidades de aprendizaje. Los autores también agradecen a la Dra. Vandana Sharma por su experiencia y orientación en microbiología y al Dr. Veani R. Fernando por la preparación de macrófagos THP-1. Además, los autores agradecen a los Dres. Andrew Kleinhenz y William T. Gunning en la Instalación de Microscopía Electrónica, y a Cassandra Zamora y Kristin Kirschbaum en el Centro de Instrumentació....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
0,4% PFA (véase la receta en Reactivos y Soluciones)	Descrito en el texto
Pipeta sorológica de 10 ml	Corning	4488
Placa TC de 12 pozos, Compañero de reparto	Corning	3513
Tubos cónicos de 15 ml, SpectraTube	Alkali Scientific	C2715
200 y micro; l tips	USA Scientific	1111-1700
Insertos de 24 pozos - Insertos de cultivo para placas de 24 pozos, PET 0.4 y micro; M	BrandTech Scientific	782710
Flipwells 3D prefabricados, esterilizados por UV	Laboratorio de fabricación
4% PFA (véase la receta en Reactivos y Soluciones)	Descrito en el texto
Fondo de Sepiapterin de 50 mM (SEP, ver receta en Reactivos y Solución)	Carrera en Henan Chemical Co	CAS#: 17094-01-8
Tubos cónicos de 50 ml	Greiner Bio-One	227261
Pipeta serológica de 5 ml	Corning	4487
70-95% de etanol (alcohol etílico)	Laboratorios de Descontaminación	04-355-151
Papel de aluminio	Fisher Scientific	01-213-100
Agujas de alimentación animal, calibre 20 1,5" longitud, de un solo uso	Fisher Scientific	01-208-87
Buffer de dilución de anticuerpos (véase la receta en Reactivos y Soluciones)	Descrito en el texto
Cámara Celular Attofluor	ThermoFisher Scientific	A7816
Cinta de autoclave	Fisher Scientific	15-901-111
Cepas de Bacillus subtilis wt (3A1T) en stock de glicerol ()	Centro Genético de Stock de Bacillus (https:// bgsc. org/
Guantes BioGrip Pink Nitrilo sin polvo sin látex	Fabricación de alta calidad	P2810
Buffer bloqueador (véase la receta en Reactivos y Soluciones - Suero de Cabra Normal al 10% en PBS)	Descrito en el texto
Buffer de bloqueo (véase la receta en Reactivos y Soluciones)	Descrito en el texto
Microscopio de campo claro (Nikon o equivalente) Eclipse Ts2	Nikon	TS2
Celdas Caco-2	ATCC	HTB-37
Incubadora de cultivo celular, 37 y grados; C, 5% CO2 (Eppendorf CellXpert)	Eppendorf	6734010015
Centrifugadora (Eppendorf, centrífuga 5804/5804 R o equivalente	Eppendorf	22622501
Tubos centrífugas de 50 ml SpectraTube	Alkali Scientific	C2750
Insertos de cultivo para placa de 12 pozos, PET, 0,4 y micro; m, estéril	BrandTech Scientific, BRAND Insert 2en1, BIO-CERT	782730
Medio de montaje DAPI VectaShield	Laboratorios Vector	H-1000
Fondo profundo de placa de Petri, placa de Petri apilable de poliestireno de 100 x 25 mm de profundidad, estéril y nbsp;	USA Scientific	8609-0625
XP de ayuda de pipeta Drummond	Drummond y Drummond;	4-000-101
Centrífuga Eppendorf 5804 con rotor oscilante para tubos cónicos de 50 ml	Eppendorf	22622501
Pinzas, acero inoxidable, autoclave estéril, 2 juegos	VWR	82027-438
Pinzas, acero inoxidable, autoclave estéril, 2 juegos, pinzas para muestras	VWR	82027-438
Matraz de cristal 500 ml	Corning	4980-500
Hemacitómetro (Neubauer con llaves de cobertura)	Thermo Fisher Scientific	50-312-90
Celdas HT-29-MTX-E12	Millipore Sigma	12040401
ImmunoPen (opcional)	Fisher Scientific	4021761EA
Guantes resistentes a base de Kevlar u otros cortes (opcional)	Ferretería o Amazon
Cinta de laboratorio o cinta de envío	Fisher Scientific & nbsp;	159015R
Campana de flujo laminar Serie 1300 A2 BSC Clase II	ThermoFisher Scientific	1375
Campana de flujo laminar con luz UV SterilGARD	La Compañía Baker	SG403A-HE
Marcadores a prueba de disolventes	VWR	52877-310 o 95042-566
Medios para células Caco-2 (DMEM a base de alta glucosa, véase la receta en Reactivos y Soluciones)	descrito en Mensaje de texto
Medios para células HT-29 (DMEM Glucosa alta, véase la receta en Reactivos y Soluciones)	Descrito en el texto
Medios para células THP-1 (RPMI, véase la receta en Reactivos y Soluciones)	Descrito en el texto
Tubo de microcentrífuga, 1,7 ml, estéril y nbsp;	Alkali Scientific	C3017-ST
Tubos microcentrífugas	Thermo Fisher	3451
Medios Miller LB (véase la receta en Reactivos y Soluciones)	Sigma-Aldrich	L3522
Alicates de punta fina, 2 juegos	Ferretería o Amazon
Guantes sin látex sin polvo de nitrilo Aurelia Amazing	MidSci	92885
Tapas de placa de Petri, estéril tipo placa de Petri de halcón de 100x15 mm	Corning Inc	351029
Acetato de mirestado de phorbol (PMA) (100 ng/μ l, véase la receta en Reactivos y Soluciones) y nbsp;	InvivoGen	Tlrl-pma
Puntas de pipete (10 y micro; 1, 200 & micro; 1000 y micro; l) PurePoint o equivalente	Alkali Scientific y nbsp;	ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS
Película transparente	Abacería
Solución de colagénasa de trabajo Purecol (100 & micro; g/mL)	BioMatrix Avanzada	5005-100ML
Tapas redondas #1 1 oz (Corning Float Glass o Fisherbrand)	Corning o Fisherbrand	50143822 o 12-546-2 25CIR-2
Bisturí, estériles, desechables y nbsp;	Mopec o Feather #10	AJ136 o 2975#10
Sepiapterina (septiembre, 100 y micro; M, consulta la receta en Reactivos y Solución)	Carrera en Henan Chemical Co	CAS#: 17094-01-8
Incubadora agitada ajustada a 220 rpm 37&º; C	Eppendorf New Brunswick Scientific	M12990080
Adhesivo de silicona Loctite Silicona transparente IDH o 3M Marine Grade Silicon Clear transparente con punta de nariz	Loctite o 3M	1745658 o PN08019
Pipeta de canal único Eppendorf Research Plus, 200 y micro; l	Eppendorf
Pipetas de canal único (10 y micro; 1, 200 & micro; 1000 y micro; l)	Eppendorf	2231001122
Espectrofotómetro NanoDropOneC	Thermo Fisher Scientific	13-400-519
Agua desionizada estéril
Serina estéril tamponada con fosfato (PBS) sin calcio ni magnesio	Fisher Scientific	BSS-PBS-1X6
Jeringuilla de 3 ml o 5 ml con punta Luer-Lok	BD	309585 o 309603
Celdas THP-1	ATCC	TIB-202
Pipetas de transferencia, estériles	Fisherbrand	13-711-20
Triton X-100	Millipore Sigma	X100
Solución azul de tripán	VWR	97063-702
Tripsina-EDTA 0,25%	Thermo Fisher Scientific	25200-056
Limpia a Kimwipes Professional con el Poliescudo Anti-Estadísticas LintGuard	Kimberly-Clark	34120
Anticuerpos primarios:
Antihumano CD163	Abcam	156769
Anti-humano CD68	Novus Biologicals	NB100-683-0,1 mg
Antihumano CD80, E3Q9V	Tecnologías de señalización celular	15416
Anti-humano CK20	Tecnologías de la vida	PA5-82875
MUC2 antihumano (996/1)	ThermoFisher	MA5-12345
Anticuerpos secundarios:
Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit IgG (para CD80 y CK20)	ThermoFisher	A11008
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (para MUC2 y CD68 o CD163)	ThermoFisher	A11005
Reactivos y Soluciones:
Caco-2 Medio:
DMEM con glucosa alta (4,5g/L) y 1% (v:v) de GlutaMax	Thermo Fisher Scientific	35050061
FBS 10% (v:v) inactivado por calor	Sigma	F2242-500ML
Aminoácidos no esenciales 1% para medios Caco-2	Thermo Fisher Scientific	11140076
Estreptococo de pluma 1% (v:v)	Sigma	F2242-500ML
HT-29-MTX Media
DMEM con glucosa alta (4,5g/L) y 1% (v:v) de GlutaMax	Thermo Fisher Scientific	35050061
FBS 10% (v:v) inactivado por calor	Sigma	F2242-500ML
HEPES (concentración final de 10 mM)	Thermo Fisher Scientific	15630080
Estreptococo de pluma 1% (v:v)	Sigma	F2242-500ML
THP-1 Medio:
Suero fetal bovino inactivado por calor (FBS) (10% v:v)	Sigma	F2242-500ML
Glucosa (concentración final de 4,5 g/L)	Thermo Fisher Scientific	A249001
GlutaMax 1% (v:v) Concentración final de 2 mM	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES (concentración final de 10 mM)	Thermo Fisher Scientific	15630080
Estreptococo de pluma 1% (v:v)	Sigma	F2242-500ML
Instituto Conmemorativo Roswell Park (RPMI)-1640 medio	Thermo Fisher Scientific	11875119
Piruvato de sodio (concentración final de 1 mM)	Thermo Fisher Scientific	11360070
Purecol (dilución a 1:30 100 & micro; g/ml):
Purecol 3 mg/ml 1:30 a 100 y micro; g/ml	BioMatrix Avanzada	5005-100ML
Agua desionizada estéril
L-Sepiapterin (50 mM):
L-Sepapterina (SEP)	Carrera en Henan Chemical Co	CAS#: 17094-01-8
5 mg/mL	InvivoGen	Tlrl-pma
BSA 1% albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	5470
DMSO	Sigma	D2650
Miller LB	Sigma-Aldrich	L3522
Suero normal de la misma especie que el anticuerpo secundario	Sigma	NS02L-1ML
Paraformaldehido	Sigma-Aldrich	441244

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications. J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).
Xuan, C., et al.

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