Artículo de método

Edición mejorada del genoma a través de la técnica de electroporación in vivo basada en la administración de ácidos nucleicos oviductales para la generación de ratones knockout

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DOI:

10.3791/68704

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26 de agosto de 2025

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1Center of Transgenesis and Genome Editing, St. Petersburg State University, 2Resource Center Molecular and Cell Technologies, St. Petersburg State University, 3Amyloid Biology Laboratory, St. Petersburg State University, 4DNA-Nanosensoric laboratory, ITMO University, 5Laboratory of Toxinology and Molecular Systematics, L.A. Orbeli Institute of Physiology, National Academy of Sciences of the Republic of Armenia

En este artículo

Resumen

La eficiencia del método de edición mejorada del genoma mediante la administración de ácidos nucleicos oviductales (I-GONAD) es comparable a la microinyección tradicional, que requiere la recolección de cigotos de hembras donantes y la transferencia a hembras pseudoembarazadas. Este protocolo demuestra su eficacia mediante la introducción de mutaciones inducidas por CRISPR/Cas9 en el locus ROSA26 en el cromosoma 6.

Resumen

Los métodos para crear ratones knockout generalmente implican tres pasos principales: (1) recolectar embriones de hembras donantes, (2) microinyectar construcciones genéticas en los cigotos ex vivo y (3) transferirlos quirúrgicamente al oviducto de hembras pseudoembarazadas. Este proceso requiere un número significativo de animales, ya que involucra no solo a hembras donantes, sino también a machos vasectomizados y hembras pseudopreñadas. Además, las microinyecciones en el citoplasma o pronúcleo de los cigotos de ratón presentan desafíos como obstrucción de la aguja, problemas de permeabilidad de la membrana debido a la alta elasticidad y posible muerte del embrión. El desarrollo de electroporadores avanzados, como el Nepa21, brinda una oportunidad única para generar ratones con knockouts de genes específicos en un solo paso a través de un método conocido como Edición Mejorada del Genoma a través de la Administración de Ácidos Nucleicos Oviductales (I-GONAD). Esta técnica consiste en microinyectar componentes CRISPR-Cas (proteína Cas9 y ARN guía) en los oviductos de hembras preñadas a los 0,7 días después de la concepción, seguido de electroporación in vivo para administrar estos componentes directamente en los cigotos. Después del procedimiento I-GONAD, el ratón preñado lleva y da a luz a cachorros con el gen eliminado objetivo. Este artículo proporciona un protocolo detallado paso a paso para implementar el método I-GONAD en ratones, ofreciendo una alternativa más eficiente y accesible a las técnicas tradicionales de generación de ratones knockout.

Introducción

Comprender la base genética de las enfermedades es fundamental para identificar los mecanismos moleculares subyacentes a su etiología y patogénesis. Un paso clave en esta investigación es el desarrollo de modelos animales con eliminaciones genéticas dirigidas que simulan enfermedades humanas. Los ratones son particularmente valiosos para estos estudios debido a su similitud genómica general con los humanos, su pequeño tamaño, su corta vida útil y su alta fertilidad. Los modelos de ratones son importantes tanto para la investigación básica como para las pruebas preclínicas1.

Para crear un ratón knockout utilizando el sistema CRISPR-Cas9, los investigadores suelen inyectar un complejo de ARN guía y nucleasa Cas9 en un cigoto, causando una ruptura de doble hebra en el ADN diana y, por lo tanto, activando el sistema de reparación de la célula para causar una mutación en el sitio de la ruptura 1,2. La microinyección en cigotos sigue siendo el estándar de oro para este propósito. Sin embargo, este método requiere varios pasos: aislar embriones de hembras donantes, realizar microinyecciones de construcciones genéticas en cigotos y transferirlos quirúrgicamente a los oviductos de hembras pseudoembarazadas. Como resultado, es necesario mantener una gran cantidad de animales, incluidas hembras donantes, machos vasectomizados y hembras pseudopreñadas. Además, el aislamiento de los cigotos requiere la eutanasia de las hembras donantes. Por lo tanto, son preferibles protocolos que minimicen el uso de animales, en línea con los principios de las 3R (Reemplazo, Reducción, Refinamiento)3.

Los avances en la tecnología de electroporación, como el uso del sistema Nepa21, brindan una oportunidad única para generar ratones knockout de genes específicos en un solo paso utilizando una técnica conocida como edición mejorada del genoma a través de la administración de ácidos nucleicos oviductales (I-GONAD)4. El Super Electroporator NEPA21 Tipo II emplea un sistema de electroporación multipulso de 4 pasos, lo que garantiza una alta eficiencia de electroporación mientras mantiene una alta viabilidad embrionaria. I-GONAD implica la microinyección de componentes CRISPR-Cas (proteína Cas9 (500-600 ng/μl) y ARN guía (80-100 ng/μl)) en los oviductos de ratones preñados 0,7 días después de la concepción, seguida de electroporación in vivo para administrar estos componentes directamente en los cigotos5. Después del procedimiento I-GONAD, la rata preñada da a luz a crías con el gen diana knockout 6,7,8. La eficacia de este método varía según el objetivo deseado, pero es comparable con las técnicas estándar basadas en microinyección (alrededor del 50%)9,10. Además, I-GONAD podría adaptarse potencialmente para la edición del genoma en otras especies.

Este artículo presenta un protocolo paso a paso para implementar el método I-GONAD para generar ratones knockout. Como ejemplo, su eficacia se demostró al dirigirse al locus del genoma ROSA26 en el cromosoma 6 del ratón. Se seleccionó este locus ya que se somete a transcripción constitutiva sin traducción posterior. Por lo tanto, es poco probable que la introducción de una mutación en este locus tenga un efecto negativo en la salud de las crías resultantes.

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Protocolo

Todos los estudios en animales fueron aprobados por el Comité de Ética de Investigación Animal de la Universidad Estatal de San Petersburgo (Aprobación No. 131-03-5, 11 de octubre de 2022). Todos los procedimientos se adhirieron estrictamente a las pautas descritas en la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Se obtuvieron ratones CD1 de cepa endogámica de laboratorio comunes del Centro de Uso Colectivo del Instituto de Compuestos Fisiológicamente Activos de la Academia Rusa de Ciencias (IPAC RAS). Se utilizaron ratones CD1 hembra de 2-3 meses (peso promedio 27-30 g) para aparearse con ratones CD1 machos de 2,5-4 meses (peso promedio 35-37 g). Los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Diseño de ARN guía único (sgRNA) y su preparación para la transfección

  1. Utilice herramientas de análisis computacional como CHOPCHOP, SYNTHEGO Knockout Guide Design o CRISPOR para identificar posibles secuencias de sgRNA dirigidas al gen seleccionado de interés.
    NOTA: El software puede identificar posibles secuencias de sgRNA en todo el gen y sugiere múltiples variantes en la salida. Estas herramientas sugerirán las opciones de sgRNA más óptimas y permitirán al usuario elegir entre todas las variantes identificadas si es necesario. Al hacer una selección, tenga en cuenta los siguientes criterios:
    1. Proximidad del exón: elija secuencias ubicadas en exones que estén lo más cerca posible del punto de mutación deseado. Para obtener mejores resultados, considere las isoformas de empalme alternativas y seleccione la secuencia objetivo que esté presente en la mayoría de las isoformas. Considere los navegadores del genoma (por ejemplo, Ensembl) para una selección precisa de exones.
    2. Consideraciones fuera del objetivo: analice los posibles efectos fuera del objetivo utilizando el sistema de puntuación de la herramienta, seleccionando secuencias que exhiban la actividad fuera del objetivo prevista más baja.
      NOTA: Las herramientas computacionales como CHOPCHOP o Synthego son muy eficaces para evaluar la proximidad del exón y los efectos fuera del objetivo, lo que ayuda a identificar secuencias óptimas de sgRNA para una edición precisa del genoma. Al diseñar ARN guía, es importante considerar la secuencia específica del gen de interés en la cepa de ratón que se está utilizando. Para algunas cepas de ratón (p. ej., C57Bl, CBA, C3H), la secuencia genómica completa está disponible. Si dichos datos no están disponibles, puede ser aconsejable realizar una secuenciación preliminar del gen diana en la región de edición planificada. Los desajustes individuales en el ARN guía, causados por polimorfismos, pueden comprometer la eficiencia de edición. El locus del genoma del ratón ROSA 26 se dirigió a la secuencia de sgRNA: 5'-ACTCCAGTCTTTCTAGAAGA-3'.
  2. Solicite un juego de cebadores para la amplificación de PCR de plantilla de sgRNA como se describe en la Tabla 1.
    NOTA: el ARNg se puede pedir en otro lugar, ya sea como ARNg o como dúplex de ARNcr: ARNtracr.
  3. Producir una plantilla lineal de dsDNA.
    1. Prepare la mezcla maestra como se indica en la Tabla 1. Agregue la polimerasa al final y mantenga la mezcla maestra en hielo para mantener la estabilidad.
    2. Ejecute la PCR en las siguientes condiciones: Desnaturalización inicial: 30 s a 95 °C; 30 ciclos de: 20 s a 95 °C (desnaturalización), 20 s a 55 °C (recocido), 15 s a 72 °C (extensión); Alargamiento final: 2 min a 72 °C; Mantener a 4 °C.
  4. Utilice la mezcla de reacción de PCR en otra reacción de transcripción in vitro (IVT).
    1. Preparar la mezcla maestra IVT como se indica en la Tabla 2 e incubar durante 1,5 h a 37 °C. Use un termociclador para un control constante de la temperatura.
    2. Añadir 2 μL de ADNasa I e incubar durante otros 30 min a 37 °C para eliminar el molde de ADN.
    3. Inactivar la ADNasa I incubando la mezcla de reacción a 75 °C durante 5 min.
    4. Purifique el ARN utilizando el reactivo TRIZOL de acuerdo con el protocolo del fabricante.
      NOTA: La eliminación del reactivo TRIZOL y la DNAse1, sus soluciones o cualquier subproducto debe colocarse en contenedores designados para desechos químicos.
    5. Mida la concentración de ARN con un espectrofotómetro (el rendimiento típico de una reacción es de 3-5 μg). Verifique las relaciones A260 / A280 y A260 / A230. A260 / A280 debe ser al menos 2.0, y la relación A260 / A230 también debe ser al menos 2.0 (lo que significa que no hay contaminación por proteínas o solventes orgánicos). Almacene los sgRNA a -80 °C hasta su uso.
  5. Preparar la mezcla RNP para la transfección
    1. La mezcla de transfección consiste en un complejo RNP, que es una mezcla de la proteína Cas9 y sgRNA. Siga estos pasos para preparar la mezcla RNP:
    2. Diluir el tampón Tris-HCl (pH 7,5) de 1 M a 100 mM con agua libre de nucleasas y filtrar con un filtro de jeringa con un tamaño de poro de 0,022 μM, alícuota en porciones de 10 μL y almacenar a 4 °C hasta su uso.
    3. En un tubo libre de nucleasas, preparar la mezcla de transfección de los siguientes componentes en las concentraciones finales: 500 ng/μL de nucleasa spCas9, 80 ng/μL de sgRNA, 10 mM de Tris-HCl diluido con agua tratada con DEPC.
      NOTA: Se requieren altas concentraciones de los componentes de la mezcla RNP para garantizar la eficiencia adecuada del protocolo.
    4. Incubar la mezcla de transfección a 37 °C durante 10 min para permitir la formación del complejo RNP.
    5. Alícuota de la mezcla en pequeños volúmenes (2 μL) adecuados para una sola sesión de I-GONAD.
    6. Mantenga las alícuotas a 4 °C durante la sesión I-GONAD. La mezcla se prepara fresca para cada sesión de electroporación I-GONAD para mantener la estabilidad.
      NOTA: La mezcla RNP debe prepararse fresca para cada sesión de I-GONAD para garantizar una actividad y eficiencia óptimas.

2. Preparación de ratones hembra para la edición del genoma mediante la administración de ácido nucleico oviductal

  1. Apareamiento y selección de ratones hembras: Aparee ratones hembra CD1 con ratones machos CD1 de un solo alojamiento durante la noche. Por la mañana, verifique la presencia de tapones de cópula en los ratones hembra. Seleccione hembras con tapones de cópula y transfiéralas a una nueva jaula para procedimientos adicionales.
    NOTA: Para minimizar el mosaicismo genético, el momento óptimo para entregar la construcción genética es de 0,7 días después del apareamiento en la etapa10 de una sola célula (cigoto). Esto corresponde aproximadamente a las 16:00 p.m. del día en que se detectó el tapón de cópula. En esta etapa, la disección del oviducto revela que los cigotos tienen menos células del cúmulo, aunque permanecen en la ampolla. En particular, las células del cúmulo también pueden absorber ácidos nucleicos exógenos o proteínas durante la electroporación. Si el procedimiento se realiza antes, por ejemplo, a las 10 h después del apareamiento, las células del cúmulo aún rodean firmemente a los cigotos, lo que puede dificultar la administración electroforética eficiente de ácidos nucleicos en los cigotos. No use ratones estimulados hormonalmente, ya que podrían dar una cantidad excesiva de ovocitos y esto podría provocar un aborto espontáneo.
  2. Preparación de instrumentos quirúrgicos: Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos de acero inoxidable para garantizar la esterilidad.
  3. Anestesia y preparación de ratones: Pesar los ratones hembra seleccionados y anestesiarlos mediante inyección intraperitoneal utilizando una mezcla de ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente).
    1. Monitoree a los ratones para detectar la pérdida del reflejo de pellizco del dedo del pie para confirmar la anestesia adecuada. Coloque el ratón anestesiado en una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal durante el procedimiento. Proteja los ojos del ratón de la sequedad durante la anestesia aplicando ungüento veterinario.

3. Procedimiento quirúrgico

  1. Desinfecte el área dorsal (espalda) del ratón con etanol al 70%.
  2. Realice una incisión cutánea longitudinal de 0,7 cm en la región lumbar.
  3. Limpie el sitio de la incisión con un algodón empapado en etanol al 70% y elimine el vello alrededor de la incisión.
  4. Extienda la incisión a 1,3 cm empujando lateralmente con las puntas de las tijeras ligeramente abiertas.
  5. Haga con cuidado una pequeña incisión (0,7 cm) en el peritoneo para acceder a la cavidad abdominal.
  6. Extienda la incisión a 1,1 cm empujando lateralmente con las puntas de las tijeras ligeramente abiertas.
  7. Localice la almohadilla de grasa adherida al ovario y sáquela suavemente con fórceps hasta que el ovario, el oviducto y el útero sean claramente visibles.
  8. Asegure la almohadilla de grasa en su lugar con una abrazadera para vasos.
  9. Visualice el oviducto bajo un microscopio estereoscópico para una manipulación precisa (Figura 1).
  10. Cargue 2 μL de la mezcla de inyección en un capilar de plástico utilizando un pipetador separador.
    NOTA: La pipeta Stripper con capilares de plástico, diseñada originalmente para manipulaciones con embriones en clínicas de FIV, puede admitir múltiples aplicaciones, incluida la transferencia de embriones y la administración de construcciones CRISPR/Cas9 en procedimientos I-GONAD. La pipeta funciona como un dispensador de líquidos de precisión; En combinación con capilares flexibles desechables, permite la esterilidad y evita la contaminación cruzada. Los capilares de plástico son preferibles al vidrio para inyectar la mezcla de RNP para la transfección en el oviducto, ya que son menos traumáticos para los tejidos delicados. A diferencia de los capilares de vidrio, los de plástico desechables no requieren pulido con llama para suavizar los bordes afilados antes de la inserción, lo que reduce el tiempo de preparación y el riesgo de daños.
  11. Con unas microtijeras, haga una pequeña incisión (0,2 cm) en la pared del oviducto unos milímetros aguas arriba de la ampolla.
  12. Inserte con cuidado el pipeta Stripper con capilar de plástico en la incisión y expulse la mezcla de inyección al oviducto.
    NOTA: Asegúrese de que no entre aire en el oviducto, ya que esto puede afectar la eficiencia de la electroporación.
    Para evitar esto, llene el capilar de plástico de inyección con más mezcla de inyección de la necesaria y evite la inyección completa. Los capilares plásticos son adecuados tanto para la transferencia de infundíbulo como para la disección directa de la pared del oviducto entre el infundíbulo y la ampolla. El método de disección directa de la pared del oviducto podría ser menos traumático que la transferencia de infundíbulo, ya que esta última requiere una incisión inicial a través de la delgada membrana de la bolsa que cubre el oviducto y el infundíbulo. En ratones CD1, esta membrana está altamente vascularizada y cortarla puede causar un sangrado menor, lo que puede obstruir la visibilidad y complicar la microinyección de la mezcla de RNP.
  13. Retire suavemente el capilar de plástico del oviducto.

4. Electroporación y sutura

  1. Encienda el electroporador presionando el interruptor en el panel frontal.
  2. Establecer parámetros de electroporación: Pulso de poros: Voltaje: 50 V, Longitud del pulso: 5 m, Intervalo de pulso: 50 ms, Número de pulsos: 3, Tasa de decaimiento - 10%, Polaridad: +/-; Pulso de transferencia: Voltaje: 10 V, Longitud del pulso: 50 ms, Intervalo de pulso: 50 ms, Número de pulsos: 3, Tasa de decaimiento - 40%, Polaridad: +/-; Límite de corriente: in vivo.
  3. Con los electrodos tipo pinza, agarre con cuidado el oviducto y verifique el valor de resistencia presionando el botón kΩ en el electroporador. Asegúrese de que los electrodos estén lo suficientemente comprimidos para que la resistencia permanezca dentro del rango óptimo de 350-400 Ω.
    NOTA: Esto se puede lograr ajustando la distancia entre los dos electrodos cuando el oviducto intacto está intercalado entre ellos.
    1. Inmediatamente después de medir la resistencia, presione el botón Inicio para iniciar la electroporación. Este paso es fundamental para garantizar la entrega eficiente de componentes CRISPR-Cas en los cigotos4. Espere a que el botón Ω muestre una señal de "finalización". Anote los valores que se muestran en el marco Medidas.
      NOTA: El valor de impedancia debe ser de aproximadamente 250-400 Ω/150-250 mA del valor de voltaje para garantizar un equilibrio óptimo entre viabilidad y eficiencia de transferencia. Para mantener este equilibrio, evite la cobertura de las regiones del oviducto con un trozo de papel húmedo empapado en solución salina tamponada con fosfato modificado (DPBS) de Dulbecco, recomendado en algunos protocolos, ya que este paso puede disminuir significativamente la resistencia más allá del rango óptimo. La disminución de la resistencia puede elevar el voltaje a más de 250 mA, lo que lleva a la muerte celular.
  4. Después de completar la electroporación en un oviducto, vuelva a colocar con cuidado el tracto reproductivo en la cavidad abdominal. Sutura la incisión con sutura quirúrgica de ácido poliglicólico 4-0.
  5. Repita la operación y la electroporación en el segundo oviducto. Una vez completado, regrese el tracto reproductivo a la cavidad abdominal y suture la incisión como se describió anteriormente.
  6. Monitoreo posterior al procedimiento: Coloque al ratón en una jaula limpia y tibia (37 ° C) para su recuperación y controle hasta que se recupere por completo de la anestesia.
    NOTA: Después de la cirugía, aloje a los ratones en jaulas que contengan dos ratones por jaula. Si solo un ratón se sometió a cirugía, proporciónele un ratón hembra de compañía. Esta práctica ayuda a reducir el estrés innecesario para el ratón quirúrgico y promueve un entorno social más natural.

5. Genotipado

  1. Diseño de imprimación
    1. Para el genotipado, diseñe cebadores para amplificar un producto de PCR entre 300 y 600 pb de longitud. Los cebadores deben tener una longitud de 18-21 nucleótidos con una temperatura de fusión (Tm) de aproximadamente 60 °C.
    2. Evite secuencias que formen estructuras secundarias o dímeros de cebador. Utilice herramientas de software como PerlPrimer 1.1.2111, In-Silico PCR V39x1 o similares para garantizar la calidad del cebador.
    3. Realice una búsqueda BLAST en la base de datos del genoma del ratón para confirmar la especificidad del cebador y evitar la amplificación no específica11.
      NOTA: Se diseñaron los siguientes cebadores para el genotipado de la secuencia diana: Cebador directo: 5'-CTCTCCCAAAGTCGCTCTGA-3'; Cebador inverso: - 5'-TCTGTGGGAAGTCTTGTCCC-3', longitud esperada del producto de PCR: 320 pb y Tm 62 °C. Para la secuenciación de Sanger, diseñe un cebador de secuenciación que se recoza a 150-200 pb del sitio de corte de Cas9.
  2. Realizar extracción de ADN. Para la extracción rápida de ADN, el protocolo de aislamiento Hotshot12 es el más simple.
    1. Con un punzón para la oreja, recolecte un pequeño fragmento de tejido (aproximadamente 2 mm) de la oreja del ratón.
    2. Agregue 100 μL de tampón de lisis (25 mM de NaOH, 0,2 mM de EDTA, pH = 12).
    3. Incubar a 95 °C durante 60 min, agitando la mezcla en vórtice cada 20 min.
    4. Agregue 100 μL de tampón neutralizante (40 mM Tris-HCl, pH = 5) y vórtice completamente.
    5. Utilice 1-5 μL de la preparación final para PCR.
  3. Amplificación y secuenciación por PCR. Prepare la mezcla maestra de PCR como se describe en la Tabla 3. Utilice una ADN polimerasa de corrección para garantizar una alta fidelidad. Alícuota de la mezcla maestra en el número requerido de tubos y agregue ADN genómico.
    NOTA: Incluya siempre una muestra de ADN de tipo salvaje como control para el análisis de secuenciación.
  4. Ejecute la PCR para el genotipado ROSA26 . Se utilizaron las siguientes condiciones: Desnaturalización inicial: 30 s a 95 °C; 28 ciclos de: 20 s a 95 °C (desnaturalización), 20 s a 62 °C (recocido), 20 s a 72 °C (extensión); Alargamiento final: 2 min a 72 °C; Mantener a 4 °C.
    NOTA: El protocolo proporcionado es preciso para la amplificación del fragmento de locus ROSA26 (tamaño estimado 320 pb) utilizando cebadores del paso 1.1.2. Para una amplificación más específica y precisa, limite el número de ciclos de amplificación a 28-30.
  5. Secuenciación y análisis
    1. Realizar secuenciación Sanger de fragmentos de PCR obtenidos (paso 5.4).
    2. Análisis de los resultados de la secuenciación
      NOTA: La transfección exitosa dará como resultado animales en mosaico, identificables por la aparición de secuencias de ADN adicionales cerca del sitio de corte de la nucleasa en el cromatograma de secuenciación. Utilice herramientas computacionales como EditCo ICE Analysis o TIDE13 para identificar y cuantificar indels exactos en el genoma.
      1. Para utilizar el análisis ICE, basta con cargar los archivos de secuenciación de Sanger obtenidos (archivo .ab1 de control para la secuencia del producto de PCR de ratón wt sin edición y el archivo .ab1 del experimento para la secuencia del producto de PCR de ratón del experimento), introducir la secuencia de ARN guía y seleccionar la nucleasa utilizada en el experimento CRISPR.
        NOTA: La herramienta de análisis ICE calculará la eficiencia general de edición y determinará los perfiles y las abundancias relativas de todos los diferentes tipos de ediciones presentes en la muestra.
      2. Para usar TIDE, ingrese la secuencia de ARN guía, cargue los archivos de secuenciación de Sanger obtenidos (archivo .ab1 de control para la secuencia del producto de PCR de ratón wt sin edición y el archivo .ab1 del experimento para la secuencia del producto de PCR de ratón del experimento) y verifique los parámetros (en algunos casos, la configuración avanzada puede ayudar a encontrar indels mayores de 10 pb).

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Resultados

Si la electroporación tuvo éxito, los ratones experimentales: (1) darán a luz a un puñado de cachorros y (2) algunos animales tendrán diferentes indels en el genoma. Si los cebadores de genotipado están bien diseñados y el programa de PCR es óptimo, el producto de PCR estará presente en el gel de agarosa como una banda transparente del tamaño deseado. Si la nucleasa corta con éxito el ADN objetivo, entonces los animales obtenidos probablemente serán mosaicos y tendrán una variedad de ind...

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Discusión

La eficiencia de generar ratones knockout utilizando el método I-GONAD es comparable a la de las técnicas tradicionales de microinyección. Sin embargo, los métodos tradicionales implican aislar cigotos de hembras donantes, realizar microinyecciones y trasplantar embriones en los oviductos de hembras pseudoembarazadas. Por el contrario, el método I-GONAD simplifica este proceso al administrar componentes de edición del genoma directamente en los oviductos de las hembras embarazadas, elimi...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Parque de Investigación de la Universidad de San Petersburgo, Centro de Tecnologías Moleculares y Celulares. La secuenciación se realizó utilizando un analizador genético ABI 3500 xL (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) en el Centro de Recursos de Tecnologías Moleculares y Celulares, Parque Científico de la Universidad Estatal de San Petersburgo. Los autores agradecen a Maria Rubel por su ayuda en la edición y envío de los documentos. Esta investigación fue financiada por la Universidad Estatal de San Petersburgo, el proyecto de investigación ID: 129658320, y Luibov Shkodenko fue apoyado por la Fundación Científica Rusa (proyecto 25-26-00247).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,5– 5 uL pipeta Termo Científica4642020
Tubo de 1,5 mLAptaca1003/G
100-1000 uL de pipeta  Termo Científica4642090
Tubo de 200 uLAxygenPCR-02-C
20-200 uL de pipeta Termo Científica4642080
2-20 uL pipeta  Termo Científica4642060
4 tintes de carga en gelBiolabmixD-3002
AgaroseAppliChemA8963.0500
DNasa I, libre de RNasa (1 U/μ L)Thermo FisherEN0521
Conjunto dNTP, solución de 100 mMTermo CientíficaR0181
DreamTaq Green DNA Polimerasa (5 U/μ L)Termo CientíficaEP0713
Dulbecco' s solución fisiológica modificada con fosfato tamponadoSigma AldrichD8537
Análisis ICE de EditCohttps://ice.editco.bio/#/Consultado el 06.04.2025
Solución EDTA 0,5M, pH = 8AppliChemA4892,0500
Ensembl  https://www.ensembl.org/index.htmlConsultado el 09.06.2025
Bromuro de etidioBiolabmixEtBr-10
Gotas de gel para los ojos " Oftagel"URSAPHARM204604
Sistema de documentación en gel ChemiDoc XRS+Bio-Rad1708265
In-Silico PCR V39x1 https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr  Consultado el 09.06.2025
Tecnologías Integradas de ADN y nbsp;https://eu.idtdna.comConsultado el 09.06.2025
Tijeras microquirúrgicasMedin URALM124
Electroporador NEPA21Nepa GeneNEPA21Con electrodo CUY652P2,5X4
Conjunto NTP, solución de 100 mMTermo CientíficaR0481
OligonucleótidosEvrogenOrden directo, purificación estándar por desalinización
Medio sérico reducido Opti-MEM IThermo Fisher31985070
PerlPrimerhttps://perlprimer.sourceforge.netVersión 1.1.21.
Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad (2 U/μ L)Termo CientíficaF530L
Puntas de 10 uL de la pipetaUlplastHT-10-960
Puntas de pipeta 1000 uLUlplastHT-1000-576
Puntas de pipeta de 200 uLUlplastHT-200-960
Fuente de alimentación " Elf-4"Tecnología de ADNPS-400 NUEVO
Agua libre de ARNAse/ADNAsaInvitrogen10977049
Solución salinaPanEcoP011n
Sistema de electroforesis horisontal SE-1HeliconSE-1
Hidróxido de sodioSigma-AldrichS5881-500G
Escalera de ADN Step100BiolabmixS-8100
Estereomicroscopio SMZ1000Nikon5-363376
Micropipetador decapanteCooperSurgicalMXL3-STR
Puntas para stripperORIGIOMXL3-125
Aguja quirúrgica KMIZ4A1- 0,6 y veces; 20
Pinzas de suturaMedin URALM302.2
Pinzas de suturaMedin URALM303
Hilo de sutura POLYCON Nfigure-materials-10Tonzos 95234
Diseño de la Guía Knockout de SYNTHEGO  https://design.synthego.com/#/Consultado el 09.06.2025
Amplificador T100BioRad10014822
ARN polimerasa T7  Termo CientíficaEP0111
Búfer TBE 10xBiolabmixTBE-500
Marea y Marea;https://tide.nki.nl/Consultado el 06.04.2025 
Clorhidrato de TrisSuzhou Yacoo ScienceSYS-S0005-0.5
Solución de cloruro de TrizmaSigma AldrichT2663
Reactivo de TrizolInvitrogen15596026
Proteína Cas9 de TrueCutInvitrogenA36499
Tijeras universalesMedin URALM147
XilazinaInterchemie Werken de AdelaarIX2
ZoletilLaboratorio Virbac2000443714739.00

Referencias

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