Optimización y evaluación del dibujo a mano y el hilado en húmedo para la producción de fibra de seda de araña recombinante

Resumen

El protocolo presentado proporciona un conjunto versátil de métodos para optimizar la solubilización de proteínas de seda recombinantes para hilar; probar la hilabilidad mediante dibujo a mano; producir fibras largas y continuas con hilatura en húmedo automatizada; y evaluar comparativamente la morfología, la alineación molecular, el comportamiento mecánico y el contenido estructural secundario de proteínas de o dentro de las fibras.

Resumen

Las sedas de araña son famosas por sus propiedades mecánicas, con una alta resistencia, una alta extensibilidad distintivas o una combinación de estas que conducen a una alta tenacidad. Una araña tejedora de orbes hembra típica produce siete tipos diferentes de seda, cada uno típicamente hilado a partir de proteínas específicas del tipo y diseñado mecánicamente para una función de supervivencia distinta. La producción de seda de araña recombinante proporciona una ruta prometedora para obtener estos materiales, evitando los desafíos en la obtención de grandes cantidades de sedas naturales y brindando ventajas al permitir la personalización de proteínas, por ejemplo, a través de la mutagénesis dirigida al sitio o la construcción de proteínas de fusión.

En el protocolo presentado, describimos una metodología para evaluar la idoneidad de las proteínas para el hilado a través de enfoques de estirado manual e hilado húmedo. Comenzando con una proteína en polvo liofilizada adecuadamente purificada, se detallan los métodos para optimizar el estado inicial de la proteína solubilizada para proporcionar un estado de "droga giratoria" de alta concentración. A continuación, se comparan los enfoques de dibujo a mano y de hilado húmedo, incluida una discusión sobre los métodos para modular el comportamiento de la fibra utilizando un dibujo posterior al giro como parte del proceso de hilado. A continuación, se detalla un flujo de trabajo típico para caracterizar las fibras de seda resultantes y tomar una decisión sobre qué condiciones de hilado tienen más probabilidades de ser fructíferas, incluida la microscopía óptica para evaluar el diámetro de la fibra y su uniformidad; microscopía de luz polarizada para estimar el grado de alineación (supra)molecular que se logra dentro de la fibra; pruebas de tracción para evaluar la resistencia, la extensibilidad, el módulo de Young y la tenacidad; y espectromicroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) para evaluar la estructuración secundaria de proteínas dentro de la fibra.

Este protocolo ha demostrado ser adecuado para varias proteínas de seda de araña recombinantes diferentes basadas en dominios repetitivos y no repetitivos de seda aciniforme (envoltura); seda piriforme; y proteínas de fusión que comprenden seda aciniforme, piriforme y/o ampulada mayor (dragalina). Se proporciona una aplicabilidad más amplia a través de varios pasos destacados en los que las condiciones y los parámetros pueden variar para adaptarse al comportamiento de una proteína individual y lograr diferencias en el resultado funcional.

Introducción

Las arañas producen sedas para diversas tareas especializadas, incluida la construcción de telarañas, la captura de presas y la protección de huevos¹. Las sedas de araña exhiben propiedades mecánicas sobresalientes que superan las de la mayoría de los materiales naturales y sintéticos conocidos,^lo que impulsa esfuerzos considerables hacia la producción de materiales de seda de araña diseñados y mejorados para diversas aplicaciones industriales y biomédicas. La espidroína, la proteína que forma la seda de araña, está compuesta por un dominio repetitivo relativamente grande delimitado por dominios N-terminal y C-terminal no repetitivos³, y las propiedades mecánicas únicas de algunos tipos de seda se han relacionado con la repetición de motivos cortos dentro del dominio repetitivo ^4,5,6. A diferencia del gusano de seda de morera cultivado comercialmente (Bombyx mori), que produce grandes cantidades de seda en un formato de capullo consistente adecuado para la cosecha, las arañas son organismos inherentemente caníbales y territoriales que producen seda en cantidades limitadas, lo que representa un desafío para la producción y recolección agrícola⁷. Dadas estas limitaciones, la producción de seda de araña recombinante se ha desarrollado como una alternativa más factible y sostenible para obtener de manera controlada cantidades suficientes de seda de araña para su aplicación.

La producción de seda de araña recombinante requiere la selección de un huésped adecuado para la expresión de proteínas. La seda de araña se ha expresado en varios sistemas hospedadores, incluidas las bacterias ^8,9, las levaduras^10,11, las células de insectos¹², las plantas^13,14 y las células de mamíferos^15,16, siendo Escherichia coli el sistema huésped más utilizado. Los altos pesos moleculares de las espidroínas, que pueden alcanzar hasta 700 kDa⁷, presentan desafíos significativos para la expresión de construcciones de longitud completa. Para producir seda de araña recombinante con propiedades comparables o mejoradas en relación con las de las sedas de araña natural, la estrategia principal empleada es la expresión de variantes truncadas, como construcciones con un número limitado de unidades repetidas (con o sin dominios no repetitivos), quimeras formadas por combinaciones de diferentes tipos de seda y sedas híbridas fusionadas con proteínas que no son de seda. Por ejemplo, la espidroína ampulada mayor recombinante (284,9 kDa) se expresó con éxito en una E. coli modificada metabólicamente, y la seda resultante exhibió propiedades mecánicas comparables a las de la seda ampulada mayor natural⁹. Además, una fibra de seda de ingeniería compuesta por dos unidades repetidas de espidroína piriforme y dos unidades repetidas de espidroína aciniforme demostró una extensibilidad superior a cualquiera de las sedas piriformes o aciniformes constituyentes, comparable a la de la seda flageliforme natural¹⁷.

La producción de proteínas recombinantes también permite la incorporación directa de péptidos funcionales o segmentos de proteínas en proteínas de seda, lo que permite la fabricación de biomateriales con propiedades que se adaptan a aplicaciones específicas. Por ejemplo, la fusión genética y química de motivos de unión celular RGD con una seda modificada genéticamente derivada de las principales espidroínas ampuladas dio como resultado películas que mejoraron significativamente la adhesión y proliferación de fibroblastos¹⁸. En un estudio separado, se demostró que una construcción de seda híbrida compuesta por un motivo de unión al factor de crecimiento nervioso β (NGF) fusionado con una proteína quimérica que comprende dos unidades repetidas de espidroína aciniforme y el dominio C-terminal de una espidroína ampulada principal apoya el crecimiento y la diferenciación de células similares a las neuronas¹⁹.

Dada la expresión y purificación exitosas de una proteína de seda recombinante, puede procesarse en diversas formas, como hidrogeles, películas, fibras, nanopartículas, espumas y esponjas, según la aplicación prevista^20,21. Para permitir la producción de fibra de seda artificial, se han desarrollado métodos de hilado que imitan ciertos aspectos del proceso de hilado de fibras naturales altamente complejo y estrictamente regulado de las arañas. En la seda ampulada mayor natural, las espidroínas son producidas por las células epiteliales en la glándula ampulada principal y almacenadas en un estado soluble dentro de la luz a altas concentraciones (hasta el 50% (p/v))²², formando una droga giratoria acuosa. A medida que la droga giratoria se mueve a través del conducto giratorio, experimenta cambios en el pH, la concentración de iones, el contenido de agua y las fuerzas de cizallamiento tanto por el estrechamiento del conducto como por el proceso de pultrusión de la fibra, que induce la transformación de proteínas de seda líquida en fibras sólidas^23,24. La identificación de un disolvente adecuado que pueda solubilizar o suspender proteínas de seda recombinantes a alta concentración para formar una droga giratoria es, por lo tanto, un primer paso crítico en el proceso de hilado de fibras artificiales.

Se ha empleado una amplia gama de disolventes para la formulación de dopes de hilatura de proteínas de seda, y se ha demostrado que la elección del disolvente influye en la formación de fibras y en las propiedades mecánicas^25,26. En consecuencia, una consideración cuidadosa de la selección de disolventes de droga es esencial para optimizar las características de la fibra resultante. Las drogas giratorias pueden formularse utilizando disolventes orgánicos o acuosos, como 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol (HFIP)²⁷, hexafluoroacetona (HFA)²⁸, mezclas de ácido trifluoroacético (TFA) y 2,2,2-trifluoroetanol (TFE)²⁶, ácido fórmico²⁹ y fosfato de sodio/tampón Tris³⁰. Dado que la solubilidad de las proteínas suele estar influenciada por factores como el pH, la fuerza iónica y la concentración, la identificación de un disolvente de dopaje adecuado generalmente implica la evaluación sistemática de varios disolventes, la optimización del pH y las concentraciones de proteínas y, en algunos casos, el uso de mezclas de disolvente y agua para determinar las condiciones óptimas de dopaje giratorio. Además, la viscosidad de la droga giratoria es un parámetro importante a evaluar antes del proceso de hilatura porque una solución de droga altamente viscosa puede impedir el flujo de fluido durante la hilatura, mientras que una droga insuficientemente viscosa generalmente no será adecuada para la formación de fibras^31,32. Cabe señalar que el uso de condiciones duras de dopaje de espín puede alterar la estructura de la proteína tras una exposición prolongada; Por lo tanto, el desarrollo de disolventes de dopaje respetuosos con el medio ambiente sigue siendo un área activa de investigación.

El dibujo a mano y el hilado en húmedo son dos métodos comunes de hilatura de fibra de seda recombinante. Las propiedades mecánicas de las fibras producidas con cada método dependen en gran medida tanto de las condiciones de hilatura como del procesamiento posterior al centrifugado. El estirado manual, también conocido como hilado por estirado, es un método simple de producción de fibras en el que las fibras se extraen de soluciones de proteínas purificadas, normalmente utilizando una punta de pipeta, fórceps o pinzas, seguido de secado al aire y caracterización 33,34,35,36,37. Si bien el dibujo a mano proporciona un enfoque excelente para detectar rápidamente una variedad de condiciones de formación de fibras de seda y, en general, clasificar el comportamiento mecánico de la fibra resultante, esta técnica no es fácilmente escalable a fibras continuas largas (es decir, de varios metros de longitud). Como alternativa, empleamos el centrifugado en húmedo, que aplica la extrusión continua de una droga giratoria a una velocidad constante en un baño de coagulación, normalmente un disolvente acuoso u orgánico compuesto por una mezcla de agua y etanol o metanol 9,15,31,38,39,40 . La inmersión de la droga de hilado en el baño de coagulación provoca una rápida desolvatación de proteínas, lo que resulta en la formación de fibras continuas²⁴. Posteriormente, las fibras se extraen del baño de coagulación a una velocidad constante, ya sea igualadas a la velocidad de extrusión para proporcionar fibras hiladas (AS) o sometidas a un estirado posterior al centrifugado para proporcionar fibras posteriores al hilado (PS) que generalmente tienen propiedades mecánicas mejoradas. El estirado posterior al centrifugado generalmente implica el estiramiento de las fibras en una proporción de 2 a 8 veces su longitud original en el aire, en un solvente o después de la inmersión en solvente, y cada parámetro contribuye a propiedades mecánicas específicas 15,17,31,38.

Si bien este protocolo se centra en los métodos de dibujo a mano e hilado húmedo, es importante colocar estos métodos en contexto. Se han informado métodos de electrohilado para sedas de araña recombinantes de condiciones acuosas y orgánicas, lo que permite la producción de esteras de fibra, fibras alineadas e hilos, con fibras típicamente en la escala nanométrica de^{diámetro 41}. Esto proporciona la ventaja potencial de las fibras a nanoescala y el desafío correspondiente si se desean fibras a escala micrométrica, generalmente con el requisito de realizar un procesamiento posterior al centrifugado para inducir la transformación a una estructura de lámina β para mejorar la mecánica y la compatibilidad con el agua. Se han obtenido cintas de seda de araña recombinantes de varios metros de ancho y grosor a escala micrométrica mediante hilatura en seco a partir de disolvente orgánico⁴², con una demostración reciente de que la incorporación de iones metálicos en la etapa de dopaje de espín mejora la mecánica⁴³. El hilado⁴⁴ basado en microfluidos, que incluye una combinación reciente de tecnología de impresión 3D con hileras de microagujas diseñadas para imitar la hilera⁴⁵ natural, es adecuado para el hilado de fibra de seda recombinante altamente controlable. A pesar de la amplia variedad de métodos que se informa que son adecuados para la producción de fibra de seda (o similar a la seda), el presente protocolo detalla la producción de fibra de seda recombinante mediante dibujo a mano e hilado en húmedo, ya que estos métodos han demostrado ser traducibles a varias variantes diferentes de seda recombinante en nuestras manos y proporcionan un punto de partida manejable para el desarrollo de biomateriales y la evaluación comparativa.

Después del hilado y la recolección de fibras, se utiliza rutinariamente una combinación de técnicas ópticas, mecánicas y espectroscópicas para caracterizar las propiedades después del hilado. Cada método proporciona información clave sobre el proceso de formación de fibras y su correlación con el rendimiento del material. Aquí, nos enfocamos en un subconjunto de estos métodos, señalando que existen muchas otras metodologías que brindan información clave sobre las propiedades y el rendimiento de la fibra de seda. La microscopía óptica se utiliza para evaluar la morfología de las fibras, lo que permite comparar los diámetros de las fibras hiladas en condiciones idénticas y variables 17,31,38,46. Esta técnica también es importante para identificar y eliminar segmentos de fibra con defectos o anomalías antes de su posterior caracterización. Además, se puede emplear microscopía de luz polarizada para evaluar el grado de alineación molecular dentro de la fibra, ya que los niveles más altos de alineación generalmente se asocian con propiedades mecánicas mejoradas 17,26,47. La caracterización mecánica se lleva a cabo a través de pruebas de tracción, donde se miden las curvas de tensión-deformación y se utilizan para cuantificar parámetros como la resistencia a la tracción, la extensibilidad, el módulo de Young y la tenacidad, proporcionando información esencial para evaluar la idoneidad de la fibra en aplicaciones estructurales o biomédicas 17,33,48. La técnica final cubierta aquí, la espectromicroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR), se aplica para investigar la estructura secundaria de las proteínas, particularmente el grado de formación de láminas de β, ya que esto juega un papel crucial en la estabilidad de la fibra y la resistencia mecánica 17,46,49. Juntas, estas técnicas proporcionan una comprensión integral de la morfología, la estructura y el comportamiento mecánico de las fibras de seda producidas de forma recombinante.

Protocolo

En este protocolo, asumimos que el punto de partida es una proteína de seda liofilizada en polvo. Esto sería más típicamente una proteína de seda de araña recombinante en nuestro trabajo. En la Figura 1 se proporciona una descripción general del protocolo, con cada uno de los siguientes cinco pasos que se detallan a continuación: (1) preparación y optimización de la droga giratoria; (2) estirado a mano o hilado húmedo de fibra de seda; (3) diámetro de la fibra y evaluación morfológica por microscopía óptica; (4) evaluación mecánica mediante ensayos de tracción; y, (5) evaluación de la estructura secundaria mediante espectromicroscopía FTIR.

Figura 1: Descripción general esquemática de los pasos clave en el protocolo para la producción, recolección y caracterización de fibra de proteína de seda de araña recombinante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Preparación y optimización de la droga giratoria

NOTA: Para optimizar la solución de droga de hilado de fibra, intente solubilizar concentraciones variables de proteína de seda de araña recombinante en diferentes solventes para preparar soluciones de droga (Tabla 1). Solo los solventes que disuelven la proteína, dando una solución de droga clara y libre de precipitados, deben emplearse para los intentos de hilado de fibra.

1. Preparación de disolventes
   1. Para hacer 8:1:1 TFA/TFE/H₂O, mida 800 μL de TFA, 100 μL de TFE y 100 μL de agua ultrapura tipo 1 en un tubo de vidrio dentro de una campana extractora. Mezcle bien todos los componentes. Tape el tubo de vidrio y cúbralo con parafilm para evitar la evaporación de los componentes volátiles.
      NOTA: Siempre prepare una solución nueva para el hilado de fibra.
      PRECAUCIÓN: Manipule TFA y TFE con cuidado, TFA es altamente corrosivo y volátil, mientras que TFE es inflamable y tóxico. Use el EPP adecuado, incluidos guantes, batas de laboratorio y gafas de seguridad, para evitar el contacto con la piel y la posibilidad de inhalación.
   2. Para hacer 3:1:1 TFA/TFE/H₂O, dentro de una campana extractora, transfiera 300 μL de TFA, 100 μL de TFE y 100 μL de agua ultrapura tipo 1 a un tubo de vidrio y mezcle los componentes. Tape el tubo de vidrio y cúbralo con parafilm para minimizar la evaporación de los componentes volátiles.
      NOTA: Siempre prepare una solución nueva para el hilado de fibra.
   3. Para hacer 7:3 HFIP/H₂O, mezcle 700 μL de 1,1,1,3,3,3-hexafluroro-2-propanol (HFIP) con 300 μL de agua ultrapura tipo 1 para hacer 1 mL de solución. Prepare la solución fresca cuando sea necesario.
      PRECAUCIÓN: Manipule HFIP dentro de una campana extractora y evite la inhalación o el contacto con la piel.
   4. Para hacer un tampón de fosfato de potasio de 50 mM (pH 7,5), tome 800 mL de agua desionizada en un vaso de precipitados y disuelva 1,199 g de fosfato de dihidrógeno de potasio (KH₂PO₄- MW. 136. 09 g/mol) y 7,173 g de fosfato de potasio dibásico (K₂HPO₄- MW. 174,18 g/mol) en él. Mezcle bien todos los componentes y ajuste el pH de la solución con NaOH o HCl. Rellene el volumen a 1 L con agua desionizada y guárdelo a temperatura ambiente.
   5. Para hacer un tampón Tris-Cl de 10 mM (pH 8,0), disuelva 1,21 g de clorhidrato de Tris (MW. 157,60 g/mol) en 800 mL de agua desionizada. Ajuste el pH con NaOH y rellene el volumen final a 1 L con agua desionizada. Guarde la solución a temperatura ambiente.
   6. Para hacer 20 mM de tampón de acetato de Na, en 450 mL de agua desionizada, disuelva 0,55 g de acetato de sodio (MW. 82,03 g/mol) y 0,02 M (6 mL) de ácido acético. Rellene el volumen a 500 ml con agua desionizada y guárdelo a temperatura ambiente.
   7. Para hacer un tampón de fosfato de citrato de 1 M (pH 7,0), disuelva 11,69 g de hidrogenofosfato disódico (Na₂HPO₄- MW. 141,96 g/mol) y 1,85 g de ácido cítrico (MW. 192,12 g/mol) en 400 mL de agua desionizada. Ajuste el pH de la solución con HCl o NaOH y ajuste el volumen final a 500 ml con agua desionizada.
   8. Para hacer la solución de ácido fórmico-CaCl₂ al 98%, diluya el ácido fórmico al 98% mezclando 98 ml de ácido fórmico con 2 ml de agua desionizada para un total de 100 ml de solución. Ahora, agregue 4 g de CaCl₂ a 100 ml de solución de ácido fórmico al 98% para preparar una solución de ácido fórmico-CaCl₂ al 4% p/v. Guarde la solución a temperatura ambiente.
      NOTA: Consulte la Tabla 1. Solo los solventes que disuelven la proteína, dando una solución de droga clara y libre de precipitados, deben emplearse para los intentos de hilado de fibra.
2. Preparación de solución de droga de hilado de fibra
   1. Pese la proteína de seda de araña liofilizada de acuerdo con la concentración deseada (p. ej., 10 mg para una solución al 10% (p/v) en 100 μL de disolvente) y mezcle con el volumen adecuado de disolvente (p. ej., 100 μL para una concentración del 10% (p/v)).
   2. Agite la mezcla hasta que la proteína en polvo se disuelva completamente en el solvente.
   3. Como la solubilidad de la proteína de seda de araña varía según el disolvente y el tipo de proteína, comience con una concentración baja de proteína (10% p/v) y aumente gradualmente la concentración (25-30% p/v) según sea necesario.
   4. Después de la disolución completa de la proteína, evalúe cualitativamente la viscosidad de la solución de droga. Si la solución de droga parece insuficientemente viscosa, aumente gradualmente la concentración de proteína hasta obtener una solución clara y viscosa. Utilice el agua como estándar de referencia.

Solvente	Concentración de proteínas (% - p/v)	Referencia
8:1:1 TFA/TFE/H2O	10 – 25	19
3:1:1 TFA/TFE/H2O	10 – 30	26
7:3 HFIP/H2O	15 – 30	31
Tampón de fosfato de potasio de 50 mM (pH 7,5)	10 – 25	50
Tampón Tris-Cl de 10 mM (pH 8,0)	10 – 20	34
Tampón de acetato de Na-20 mM (pH 5,0)	10 – 25	49
Tampón de fosfato de citrato 1 M (pH 7,0)	10 – 25	51
Ácido fórmico al 98% – CaCl2	20 – 25	52

Tabla 1: Disolventes recomendados y concentraciones de proteínas para preparar dopes de hilado de fibra.

2. Hilado y recolección de fibra

NOTA: Consulte la Figura 2 para obtener una representación esquemática del dibujo a mano y la Figura 3 para las diversas configuraciones de dispositivos de centrifugado en húmedo que se detallan a continuación.

Figura 2: Dibujo a mano de fibras de seda de araña. (A) Se prepara un marco de papel en forma de C y se une a un portaobjetos de vidrio con cinta transparente a la izquierda y cinta adhesiva de doble cara a la derecha para permitir el dibujo de fibra de izquierda a derecha. (B) Se coloca una gota de droga giratoria en la cinta transparente y se estira a mano una sola fibra a la cinta de doble cara a través de la abertura del marco en forma de C con una punta de pipeta de plástico. (C) La fibra se asegura al marco de papel en el portaobjetos de vidrio con cinta adhesiva en los lados izquierdo y derecho. (D,E) Demostración del proceso representativo (D) de dibujo a mano para una seda de araña recombinante efectivamente solubilizada en una droga giratoria y (E) la fibra resultante antes de asegurarla con cinta adhesiva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Hilado húmedo de fibras de seda de araña. En todos los casos, la droga giratoria se coloca en una jeringa hermética de vidrio y se extruye a una velocidad constante usando una bomba de jeringa a través de una aguja de metal de punta roma (es decir, la hilera) en un baño de coagulación (por ejemplo, etanol al 95%). (A) Las fibras hiladas se recogen en el rodillo 1, girando bajo control de computadora a una velocidad que coincide con la velocidad de extrusión. (B) El estiramiento posterior al giro en el aire se logra guiando las fibras a través del rodillo 1 y recogiéndolas en el rodillo 2, que gira a un múltiplo de la velocidad del rodillo 1 (por ejemplo, el doble de la velocidad para una relación de extracción de 2x). De manera similar, las fibras se pueden producir (C) después de la inmersión en solvente (por ejemplo, etanol al 40%, agua, etc. según sea adecuado para una seda determinada) guiando las fibras del rodillo 1 al rodillo 3 (sumergidas en un baño de solvente y girando a la misma velocidad que el rodillo 1) antes de guiarlas al rodillo 2 (girando a un múltiplo de la velocidad de los rodillos 1 y 3); o (D) en disolvente guiando las fibras del rodillo 1 al rodillo 3 (sumergidas en un baño de disolvente y girando a la misma velocidad que el rodillo 1) y luego al rodillo 4 (también sumergido en disolvente y girando a un múltiplo de la velocidad de los rodillos 1 y 3) antes de la recogida en el rodillo 2 (velocidad igualada a la del rodillo 4). La configuración modular significa que se pueden probar fácilmente varias permutaciones en las condiciones de hilado de fibras, ciertamente no limitadas a las cuatro que se muestran esquemáticamente aquí. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Dibujo a mano
   1. Prepare un marco de papel en forma de C con una ventana de 1 cm x 0,5 cm (largo x ancho) y colóquelo en un portaobjetos de vidrio (Figura 2). Asegure la parte superior del marco de papel a la diapositiva de vidrio con cinta adhesiva. Fije cinta adhesiva transparente a un brazo del marco de papel para crear una superficie hidrofóbica para la deposición de la solución de droga y coloque cinta adhesiva de doble cara en el brazo opuesto para asegurar la fibra.
   2. Deposite 10-20 μL de solución de hilandería sobre la cinta transparente a temperatura ambiente (22 ± 2 °C).
   3. Sumerja una punta de pipeta de plástico de 200 μl en la gota de solución de droga y extraiga verticalmente de la solución con una velocidad constante (~6 mm/s), lo que permite extraer las fibras de la solución.
   4. Guíe la fibra tirada a mano a través de la ventana del marco y fíjela a la cinta de doble cara. Seque la fibra al aire a temperatura ambiente, luego asegure ambos extremos de las fibras con cinta adhesiva adicional.
   5. Concéntrese en la parte de la fibra que abarca el marco del papel para su posterior caracterización.
2. Centrifugado en húmedo
   1. Construya un dispositivo de giro húmedo, con el aparato detallado aquí con capacidades de control de motor mejoradas en relación con las iteraciones anteriores^31,38.
      1. Fabrique una placa de montaje de metal rígido que se sostenga verticalmente y se mecanize con una configuración adecuada para conectar un conjunto de motores paso a paso (consulte la Figura 3). Cada montaje del motor requiere orificios perforados para permitir el atornillado seguro de los motores paso a paso en la parte posterior de la placa de montaje (es decir, cuatro orificios espaciados y del tamaño adecuados) y un quinto orificio para permitir el paso del eje del motor.
      2. Elija motores paso a paso bipolares con un paso de 1,8°, par de retención de 45 N∙cm, eje de 24 mm de largo y 5 mm de diámetro con un corte en "D" de 15 mm de largo, cuerpo de 39 mm, corriente nominal de 1,50 A, resistencia de fase de 2,3.
      3. Desarrollar un sistema para controlar la velocidad y la dirección de rotación de cada motor, como el utilizado anteriormente para una variedad de tipos de fibra de seda 17,53,54, que emplea una interfaz gráfica de usuario (GUI) codificada en Python para una Raspberry Pi conectada a varios controladores de motor paso a paso como se detalla en https://github.com/raineylab/MotorController.git.
      4. Para el hilado, fije cada motor que se utilice en una configuración de hilatura determinada a un cilindro metálico mecanizado (diámetro 6 cm, longitud 8 cm para los de las posiciones 1 y 2 de la figura 3, rodillos ranurados con un diámetro de 9 cm en cada extremo que se estrechan hasta un diámetro de 6 cm en el centro del rodillo, longitud de 7 cm en las posiciones 3 y 4 de la figura 3; véase, por ejemplo, la Figura 4 para ver la configuración de ejemplo).
      5. Para la hilera (Figura 3), use una jeringa de vidrio de 0,25 ml con una aguja de metal fijada permanentemente con un extremo romo (diámetro interno de 0,127 mm) montada en una bomba de jeringa que extruye la droga de centrifugación a una velocidad controlada en un baño de coagulación.
   2. Centrifugar la solución de droga a 20.000-21.000 × g durante 30 min a temperatura ambiente y recoger el sobrenadante para el hilado de fibra.
      NOTA: Elimine las partículas residuales para evitar la obstrucción de la aguja de extrusión durante el centrifugado en húmedo.
   3. Cargue 50-80 μL de solución de droga giratoria en la jeringa que sirve como hilera.
   4. Asegure la jeringa en una bomba de jeringa y ajuste la extrusión a una velocidad de 600 μL/h.
      NOTA: Ajuste y optimice la velocidad de extrusión para permitir la formación de fibra para una condición de droga de hilado de proteínas determinada.
   5. Preparar el baño de coagulación (etanol al 95%/agua desionizada al 5%, v/v).
   6. Coloque la bomba de jeringa de modo que la aguja de la jeringa que contiene la solución de droga se sumerja en el baño de coagulación.
   7. Conecte los rodillos al aparato de hilatura, ajuste la velocidad de los rodillos con el software de control del motor y encienda los motores necesarios para una configuración de hilatura determinada.
      NOTA: Haga coincidir la velocidad de rotación del rodillo 1 con la velocidad de extrusión. Las velocidades de extrusión de 400 μL/h o 600 μL/h corresponden a 6 rpm o 9 rpm para el rodillo 1. Si se imparte un sorteo posterior al giro, uno o más de los rodillos 2-4 deben configurarse para que giren correspondientemente más rápido.
   8. Encienda la bomba de jeringa y use pinzas para guiar la fibra que se forma en el baño de coagulación de una de las siguientes maneras.
      1. Para recolectar fibras AS, guíe la fibra formada en el baño de coagulación hacia el primer rodillo (velocidad igual a la velocidad de extrusión) para su recolección.
      2. Para realizar estiramientos posteriores al giro en el aire, establezca la velocidad de rotación del rodillo 2 en un múltiplo del rodillo 1. Guíe la fibra de la coagulación sobre el rodillo 1 sin enrollarla alrededor del rodillo 1 y recójala en el rodillo 2.
         NOTA: Una relación de dibujo posterior al giro de 2x requiere que la velocidad de rotación del rodillo 2 sea el doble que la del rodillo 1; 3x, triple; y así sucesivamente.
      3. Para realizar el estiramiento posterior al centrifugado después de la inmersión en disolvente, llene el baño de disolvente con el disolvente deseado (por ejemplo, agua desionizada; etanol 2:3 v/v/H₂O; etc.) y guíe la fibra desde el baño de coagulación alrededor del rodillo 1 (velocidad de rotación adaptada a la velocidad de extrusión), alrededor del rodillo 3 (velocidad de rotación igual al rodillo 1) en el baño de disolvente, y recoger la fibra en el rodillo 2 en el aire (girando a un ritmo más rápido que los rodillos 1 y 3).
         NOTA: La velocidad de rotación del rodillo 2 en relación con los rodillos 1 y 3 determinará la relación de extracción posterior al giro como en el paso 2.2.8.2.
      4. Para realizar el estiramiento posterior al centrifugado en disolvente, llene el baño de disolvente con el disolvente deseado (por ejemplo, agua desionizada; etanol 2:3 v/v/H₂O; etc.) y guíe la fibra desde el baño de coagulación alrededor del rodillo 1 (velocidad de rotación adaptada a la velocidad de extrusión), alrededor del rodillo 3 (velocidad de rotación igual al rodillo 1) en el baño de disolvente, alrededor del rodillo 4 en el baño de disolvente (velocidad de rotación un múltiplo de la de los rodillos 1 y 3) y recoja la fibra en el rodillo 2 en aire (velocidad de rotación adaptada al rodillo 2).
         NOTA: La velocidad de rotación de los rodillos 2 y 4 en relación con la de los rodillos 1 y 3 determinará la relación de extracción posterior al giro como en el paso 2.2.8.2.
         Recolecte las fibras en condiciones ambientales controladas para evitar la influencia de la humedad y la temperatura en el comportamiento de la fibra. Nuestro objetivo es una humedad relativa ~ 28,2 ± 2,4% y una temperatura ~ 28,0 ± 2,2 °C.

Figura 4: Pasos clave en el hilado húmedo de fibras de seda de araña. (A) Centrifugar la extrusión de la droga en el baño de coagulación seguida de la recolección de fibra (el rectángulo rojo de la izquierda resalta la aguja utilizada para la extrusión de la droga; el rectángulo rojo de la derecha es el camino de la fibra de seda hilada en húmedo. (B) Ilustración de la fibra sometida a estiramiento posterior al giro en el aire (rectángulo rojo para guiar el ojo). (C) Ilustración del estiramiento posterior al giro de la fibra después de la inmersión en agua (rectángulo rojo para guiar el ojo). (D) Fibra de seda recombinante continua recolectada en un rodillo (por ejemplo, fibra enrollada en la flecha roja). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Evaluación microscópica óptica de fibras

1. Montaje de fibra
   1. Cree un soporte de papel en forma de C cortando un cuadrado de 1 x 1 cm de una hoja de papel rectangular de 3 x 2 cm (Figura 5).
   2. Fije el soporte en forma de C a un portaobjetos de microscopio de vidrio con cinta adhesiva.
   3. Coloque dos trozos de cinta adhesiva de doble cara a cada lado del espacio de 1 cm del soporte de papel en forma de C.
   4. Retire una fibra del rodillo en el que se recogió y corte un segmento de aproximadamente 2 cm de largo.
      NOTA: Evite el uso de fuerza excesiva al manipular fibras para evitar la deformación del material u otra alteración de las propiedades.
   5. Coloque el segmento de fibra en la parte superior de la cinta de doble cara, asegurándose de que el eje largo de la fibra esté alineado paralelo al borde inferior del soporte (Figura 5).
   6. Asegure la fibra con cinta adhesiva encima de cinta adhesiva de doble cara en ambos lados.
   7. Coloque un trozo adicional de cinta adhesiva para fijar firmemente la parte inferior del soporte de papel al portaobjetos de vidrio para evitar que la fibra se mueva hasta su uso.
   8. Almacene las fibras montadas en una caja de almacenamiento de portaobjetos hasta que se usen para pruebas de imágenes y tracción.
2. Determinación del diámetro y evaluación de defectos
   1. Examine las fibras montadas mediante microscopía óptica. Primero, examine toda la longitud de la fibra en busca de imperfecciones visibles, como cuellos, torceduras, abultamientos o fibras dobles. Si se observa algún defecto, excluya esas fibras de las pruebas mecánicas.
   2. Para las fibras que parecen libres de defectos, tome tres micrografías con un aumento de 10x a lo largo del eje largo de la fibra, una en el medio y otra cerca de cada extremo de la fibra.
   3. Mida el diámetro de la fibra con el software ImageJ⁵⁵ :
      1. En ImageJ, vaya al menú Analizar y seleccione Establecer escala (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S1). Ajuste la escala de acuerdo con la configuración de calibración del microscopio y configure la unidad de medición en micrómetros (μm) (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S2).
      2. Con la herramienta de línea, dibuje una línea recta perpendicular al eje largo de la fibra que se extienda desde un borde de la fibra hasta el otro borde.
      3. Para cada micrografía, mida el diámetro de la fibra en seis regiones diferentes a lo largo de la fibra.
      4. Después de dibujar cada línea, haga clic en Medir en el menú Analizar para mostrar el diámetro de la fibra (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S3).
3. Evaluación cualitativa de la alineación molecular mediante microscopía de luz polarizada
   1. Utilice microscopía de luz polarizada para evaluar la alineación molecular dentro de la fibra después de la evaluación del diámetro y los defectos mediante microscopía óptica.
      1. Examine la fibra con un microscopio óptico invertido equipado con una platina giratoria, un control deslizante analizador fijo y un polarizador giratorio de 90°.
      2. Coloque la fibra a aproximadamente 45 ° en relación con la luz polarizada del plano incidente para maximizar el brillo debido a la birrefringencia, mejorando la visibilidad de la estructura molecular.
      3. Tome una imagen de la fibra en estas condiciones para evaluar su birrefringencia.
         NOTA: La birrefringencia alta sugiere una estructura molecular bien alineada, mientras que la birrefringencia baja o nula sugiere una estructura más amorfa u orientada al azar.

Figura 5: Montaje de fibra de seda de araña en portaobjetos de vidrio que permite el análisis posterior utilizando un soporte de papel en forma de C y una serie de capas de cinta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Ensayo de tracción

NOTA: Un dispositivo de prueba de tracción adecuado para la evaluación precisa de las fibras de seda se puede producir fácilmente a un costo relativamente bajo^25,56. Brevemente, fabrique un par de abrazaderas de acero inoxidable para permitir un agarre firme de cada extremo de cada fibra en un marco en forma de C que se está probando (por ejemplo, Figura 6). Conecte una de estas pinzas a un peso colocado en una balanza analítica y la otra a una bomba de jeringa. La bomba de jeringa debe configurarse para permitir una tracción constante a una velocidad de deformación establecida. La balanza analítica debe estar interconectada con una computadora para la recopilación de datos de peso/masa registrados en función del tiempo.

Figura 6: Diagrama esquemático que muestra los pasos preparatorios para la prueba de tracción. (A) El soporte de papel con fibra (consulte la Figura 5 para la configuración) se separa de la diapositiva de vidrio y se monta verticalmente con un clip unido a un peso. (B) Esta abrazadera ponderada se coloca en la balanza analítica y la parte superior del soporte de papel se asegura a una abrazadera unida a una varilla que está firmemente fijada en una bomba de jeringa. El soporte de papel se corta horizontalmente en el medio antes de comenzar la prueba de tracción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Adquisición de datos de la curva de tensión-deformación
   1. Después de medir el diámetro de la fibra, realice pruebas de tracción en la misma fibra con un aparato casero (Figura 6).
      1. Separe el marco de papel en forma de C que sostiene la fibra del portaobjetos de vidrio y asegúrelo a una abrazadera unida a un peso (Figura 6A).
      2. Conecte la balanza analítica al software de registro/control de datos y navegue hasta el Workbench (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S4).
      3. Configure el experimento en el software de control de balanzas haciendo clic en el botón Iniciar . Introduzca el nombre del experimento cuando se le solicite (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S5).
      4. Asegúrese de que la balanza analítica esté vacía y coloque la abrazadera ponderada con la fibra sobre ella.
      5. Conecte la parte superior del marco de papel a una abrazadera conectada a la bomba de jeringa y corte un lado del soporte de papel para permitir que la fibra se mueva libremente (Figura 6B).
         NOTA: Asegúrese de que ambas abrazaderas estén paralelas entre sí y que la fibra esté centrada dentro de la abrazadera a una longitud de calibre de 10 mm.
      6. Tarar la balanza para poner a cero la masa del peso y sujetar y presionar el botón Ejecutar en la bomba de jeringa y hacer clic en Aceptar en el software de control de la balanza (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S6).
      7. Cuando la fibra se rompa, presione Stop en la bomba de jeringa y el botón Sí en el software de control de balanza (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S7) para registrar el peso medido en función del tiempo.
      8. Transfiera datos a una hoja de cálculo u otro paquete de software de procesamiento de datos adecuado para su procesamiento. Copie el registro de datos de peso versus tiempo en el portapapeles y péguelo en la hoja de cálculo de pruebas mecánicas proporcionada (Archivo complementario 2) o exportando los datos como un archivo de texto e importándolos con el análisis adecuado.
2. Procesamiento de datos de la curva de tensión-deformación
   NOTA: El siguiente protocolo se basa en la hoja de cálculo de pruebas mecánicas formateada para su uso en Microsoft Excel (Archivo complementario 2).
   1. Asegúrese de que los parámetros experimentales sean correctos (columna C).
   2. Agregue los registros masivos en función del tiempo a la hoja de cálculo (la "Masa neta" en la Columna F). Si hay valores de masa registrados antes de que comenzara el estiramiento, elimine estos valores eliminando las celdas correspondientes con un desplazamiento de los datos hacia arriba. Si se registran valores de masa después de que se rompe la fibra, elimine estas celdas de datos.
   3. Rellene automáticamente los valores de índice de la columna E agregando incrementos de 1 para que el número total de índices coincida con el número total de valores de masa medidos en la columna F.
   4. Vuelva a escalar la masa neta para que comiencen en 0 g y aumenten durante el experimento de estiramiento restando la masa neta inicial de cada valor de masa neta y multiplicando esta diferencia por -1 (Columna G).
   5. Calcule el cambio en la longitud de la fibra en cada medición multiplicando el índice de medición por la velocidad de extracción de la bomba de jeringa y el tiempo transcurrido entre las mediciones de masa registradas (columna H).
   6. Calcule la deformación de ingeniería dividiendo el cambio en la longitud de la fibra por la longitud original (Columna I).
      NOTA: Este cálculo da la deformación de ingeniería en mm/mm. Para convertir los valores de deformación de ingeniería a %, multiplique los valores de la columna I por 100%.
   7. Registre la extensibilidad como el valor máximo de deformación de ingeniería (celda T3).
   8. Calcule la fuerza (en N) requerida para lograr cada cambio de longitud registrado convirtiendo la masa de g a kg y multiplicándola por la gravedad estándar (9,81 m/s²; Columna J).
   9. Calcule la tensión de ingeniería (en Pa) dividiendo la fuerza determinada en un grado dado de extensión por el área de la sección transversal de la fibra y multiplíquela por ^10-6 para convertirla a MPa (Columna K).
   10. Registre la tensión máxima observada como la tensión última (Celda U3) y la tensión a la rotura como el valor de tensión final registrado antes de la rotura de la fibra (Celda V3).
   11. Calcule el área bajo la curva de tensión-deformación para obtener la tenacidad utilizando la regla trapezoidal para calcular el área bajo la curva después de cada medición (Columna L). Suma estas áreas para encontrar la dureza (celda W3).
   12. Calcule el módulo de Young (en MPa) determinando la pendiente de la región lineal inicial de la curva tensión-deformación utilizando la función LINEST. Convertir a GPa multiplicando por 10³ (Celda X3).

5. Espectromicroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR)

1. Prepare una muestra para FTIR pegando con cinta adhesiva un segundo portaobjetos de vidrio en la parte inferior de un portaobjetos preparado para microscopía óptica.
2. Imagen óptica y recopilación espectral FTIR
   1. Llene el detector con nitrógeno líquido para enfriar el detector.
   2. Software de control de instrumentos FTIR abierto.
   3. En la ventana Ver y recopilar (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S8) abra la pestaña Colección , establezca Modo de recopilación en ATR y Detector en Refrigerado (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S9).
   4. Coloque la diapositiva en el soporte de diapositivas y colóquelo en el escenario.
   5. Ajuste la iluminación superior a 100 y la apertura y la iluminación inferior a 0.
   6. Enfoque el centro del campo de visión para la imagen del microscopio óptico de la muestra en la fibra utilizando el joystick físico o el joystick digital en el software para controlar la posición del centro del campo de visión y el plano focal.
   7. Establezca el modo de recopilación en Mapa (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S8).
   8. Seleccione la región que se va a fotografiar y medir con la herramienta Vista de mapa - Área. Haga clic y arrastre el cursor para especificar la región para la que se adquirirán los espectros en la vista previa de la micrografía (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S8). Cada círculo de la imagen representa un espectro adquirido en esa posición. Si es necesario, modifique los bordes de este cuadro colocando el cursor sobre un borde de cuadro determinado y luego haciendo clic y arrastrando a la ubicación deseada. Traslade todo el cuadro haciendo clic y arrastrando dentro del rectángulo. Modifique el área del cuadro y el número de puntos de datos en Escenario, Apertura y Pantalla (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S10).
   9. Haga clic con el botón derecho en la vista previa de la micrografía y seleccione Capturar mosaico para guardar la imagen (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S8).
   10. Establezca la presión ATR haciendo clic en el menú desplegable Perfil de presión actual . Para las fibras proteicas, use una presión del 2% (es decir, la presión ATR más baja posible) para minimizar el daño a la fibra (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S8).
   11. Inserte la punta ATR FTIR.
   12. Haga clic en el botón Recopilar (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S8) para adquirir un espectro de fondo y luego el espectro en cada uno de los puntos seleccionados. Una vez completada la recopilación, los datos se mostrarán en una nueva ventana.
3. Preparación de datos para el análisis posterior
   1. Haga clic con el botón izquierdo en el mapa de calor o en la micrografía para ver el espectro que se adquirió en la posición correspondiente (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S11).
   2. Haga clic derecho en un espectro para analizarlo y seleccione Copiar (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S11).
   3. Haga clic derecho en la barra de Windows en la parte superior de la pantalla y seleccione Nueva ventana (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S11).
   4. Haga clic en el botón Pegar en la parte superior de la pantalla cuando se abra la nueva ventana (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S11).
   5. Utilice el mismo enfoque para copiar y pegar cualquier otro espectro deseado para el análisis en esta ventana.
   6. Resalte un espectro o espectros presionando Ctrl mientras hace clic en cada espectro deseado o resaltando los espectros deseados en el menú desplegable.
   7. Haga clic en Guardar como... y guarde los archivos como archivos .spa para analizar los datos en el software de control del espectrómetro o como .csv para analizar los datos en otro paquete de software (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S12).
4. Análisis de segunda derivada utilizando software específico del instrumento
   1. Abra los espectros que se analizarán en el paquete de software de análisis y procesamiento espectral específico del instrumento.
   2. Para convertir entre los modos % de transmitancia y absorbancia, utilice Ctrl+A (% de transmitancia a absorbancia) o Ctrl+T (absorbancia a % de transmitancia).
   3. Seleccione la región de interés haciendo clic en Ver | Límites de visualización (o, Ctrl+D) (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S13A). Para ver las bandas de amida I (1.700-1.600 ^cm-1) y amida II (1.600-1.500 ^cm-1), específicamente, establezca los límites del eje X de inicio y fin en los números de onda apropiados. Si analiza más de un espectro, seleccione Aplicar a todos los espectros. Haga clic en Aceptar (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S13B).
   4. Para trazar la segunda derivada, haga clic en Proceso | Derivado... y elija Segundo en el menú desplegable (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S14A). Seleccione la derivada de Norris con una longitud de segmento de 5 y un espacio entre segmentos de 5 (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S14B). Los mínimos del espectro de la segunda derivada coinciden con los picos de componentes dentro del espectro de absorbancia original.
      1. Si el espectro es demasiado ruidoso para evaluar los mínimos, suavice el espectro haciendo clic en Proceso>Suavizado automático (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S15). Luego, calcula la segunda derivada y encuentra los mínimos.
   5. Relacione los números de onda en los mínimos de la segunda derivada con las posiciones de banda características para estructuras secundarias utilizando una tabla de referencia (por ejemplo, Tabla 2) para obtener información sobre la estructura secundaria de la proteína.
5. Deconvolución de picos mediante software de análisis específico del instrumento
   1. Establezca la región de visualización en el área que se va a deconvolutar como en el paso 5.4.3. Solo esta región será deconvolutada.
   2. La línea de base corrige la región espectral seleccionada utilizando uno de los siguientes métodos:
      1. Haga clic en Proceso | Corrección automática de la línea de base (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S16); o
      2. Haga clic en Proceso | Línea de base correcta (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S17A) y luego seleccione Lineal en el menú desplegable y especifique la región espectral que se corregirá la línea de base en el espectro de posición haciendo clic y arrastrando los dos puntos que especifican los límites inferior y superior de la región que se corregirá con fines de deconvolución. A continuación, seleccione Agregar a la ventana en el segundo menú desplegable y haga clic en el botón Agregar (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S17B).
   3. Con el espectro corregido de línea base seleccionado, haga clic en Analizar | Resolución máxima... para abrir la ventana Resolución de picos (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S18).
   4. Seleccione los espectros y curvas que desea analizar utilizando la barra de selección en el lado izquierdo de la pantalla.
   5. Elija Gaussian/Lorentzian con una configuración de Sensibilidad baja y una configuración FWHH de 2 en la pestaña Buscar picos y luego haga clic en el botón Buscar picos (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S19).
   6. Haga clic en el botón Picos para abrir una tabla que describa los picos.
      1. Si se han seleccionado más picos de los que son físicamente razonables, haga clic en Eliminar pico hasta que se obtenga el número correcto de picos para el análisis (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S20). Por ejemplo, para la región de amida I, generalmente se informan de 5 a 11 picos en la literatura (Tabla 2).
      2. Para asegurarse de que todos los picos sean positivos después del ajuste, haga clic en Editar pico y establezca la altura mínima en 0. Luego, haga clic en Siguiente y repita para cada pico seguido de Aceptar para cerrar la ventana de edición (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S21).
      3. Si hay números de onda específicos que deben estar presentes en la deconvolución final, haga clic en Editar pico y fije el centro del pico en el número de onda especificado en el cuadro Valor seleccionando Fijo o proporcione un rango mediante los cuadros Límite inferior y Límite alto . Haga clic en Aceptar para aplicar esta configuración al pico dado.
         NOTA: En este paso, es óptimo utilizar las posiciones de pico encontradas durante el análisis de la segunda derivada o los picos de una tabla de referencia de estructuras secundarias FTIR, idealmente anotadas para un tipo de muestra de seda similar (por ejemplo, Tabla 2).
   7. Haga clic en el botón Ajustar picos (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S22).
      1. Si el algoritmo de ajuste de picos no converge correctamente, haga clic en Ajustar picos de nuevo para continuar ajustando los picos de forma iterativa.
   8. Haga clic en el botón Picos... para obtener información sobre la posición, la altura, FWHH y el área de todos los picos que se ajustaron.
      1. Estos picos se pueden copiar en el portapapeles haciendo clic en Portapapeles para permitir que se peguen en otra ventana o archivo (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S23).
      2. Copie picos y espectros en otra ventana seleccionando el destino en el menú desplegable de selección de ventana junto al botón Agregar (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S24).
      3. Haga clic en el botón Seleccionar todo y use Archivo | Guardar como para guardar los picos y espectros como archivos .spa y/o .csv (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S25).
   9. Relacione cada pico de componente con una estructura secundaria utilizando una tabla de referencia. El área relativa de los picos correspondientes a una estructura secundaria dada con respecto al área total de todos los picos asignados proporciona la proporción de la proteína que tiene esa estructura secundaria.
6. Preparación de datos para el análisis posterior utilizando software de terceros
   1. Abra un libro de trabajo y cargue los datos espectrales en el software de análisis y procesamiento espectral de terceros seleccionando el comando Datos | Conectar al archivo | Elemento de menú Texto/CSV (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S26). Seleccione el archivo deseado en el Explorador de archivos y haga clic en Abrir.
   2. Trace el espectro resaltando las columnas que se van a trazar y seleccionando el menú Trazar | 2D básico | Elemento de menú de línea (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S27).
   3. Haga doble clic en el eje x y use la pestaña Escala para ajustar el rango para que se ajuste al pico de Amide I (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S28).
   4. Si los datos son muy ruidosos, suaviza la curva eligiendo el botón Análisis | Procesamiento de señales>Diálogo>Abrir... (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S29A).
      1. Establezca la opción Recalcular en Automático, el Método en Savitzky-Golay, Puntos de ventana en 5, Condición de contorno en Ninguno y Orden polinómico en 2 (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S29B).
      2. Haga clic en Aceptar para procesar.
7. Análisis de segundas derivadas utilizando software de terceros
   1. Seleccione el análisis | Matemáticas | Diferenciar | Abrir diálogo... (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S30).
   2. Establezca la opción Recalcular en Automático, establezca el Orden de derivadas en 2, seleccione la opción Trazar curva de derivadas y haga clic en Aceptar (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S31).
   3. Si la curva de la segunda derivada resultante es muy ruidosa, siga los pasos 5.7.1. y 5.7.2, seleccionando Savitzky-Golay Smooth en la pestaña Smooth del cuadro de diálogo Diferenciar .
   4. Como en 5.4.5, relacione los números de onda en los mínimos de la segunda derivada con estructuras secundarias.
8. Deconvolución de picos utilizando software de terceros
   1. Después de hacer clic en el gráfico del espectro de absorbancia de amida I, seleccione el botón Análisis | Picos y línea de base | Analizador de picos | Abrir diálogo... (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S32).
   2. En el cuadro de diálogo Objetivo - Ajustar picos (Pro), establezca la opción Recalcular en Automático, seleccione Ajustar picos y haga clic en Siguiente. (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S33A).
   3. En el cuadro de diálogo Modo de línea base , establezca el parámetro Modo de línea base en Línea recta y haga clic en Siguiente (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S33B).
   4. En el cuadro de diálogo Tratamiento de línea de base , seleccione Restar línea de base automáticamente, haga clic en el botón Restar ahora y haga clic en Siguiente (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S33C).
   5. En el cuadro de diálogo Buscar picos , desactive Activar búsqueda automática y haga clic en Añadir.
      1. Haga doble clic en la ventana que contiene el gráfico de un espectro con los picos que se van a ajustar.
      2. Seleccione picos basados en los mínimos observados en la segunda derivada (paso 5.7.4) o tablas de referencia (por ejemplo, Tabla 2).
      3. Haga clic en Listo y, a continuación, haga clic en Siguiente (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S33D).
   6. En el cuadro de diálogo Ajustar picos (Pro), seleccione Generar informe a partir del resultado de ajuste actual y haga clic en Ajustar. seguido de Finalizar (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S33E).
   7. Evalúe la pestaña PeakProperties1 del libro para ver el centro, el área integrada y el FWHM de cada pico (Archivo complementario 1 - Figura complementaria S34). Como en el paso 5.5.9, relacione cada pico de componente con un tipo de estructura secundaria y evalúe el porcentaje de la estructura de la proteína con esa estructura secundaria.

Rango de número de onda (cm-1)	Asignación
1605-1615	Cadenas laterales Tyr/hebras de β agregadas
1616-1621	Cadenas de β agregadas/láminas de β intramolecular [débil]
1622-1627	Láminas de β intermoleculares [fuerte]
1628-1637	Láminas de β intramoleculares [fuerte]
1638-1646	Bobina aleatoria / Cadenas extendidas
1647-1655	Bobina aleatoria
1656-1662	α-Hélices
1663-1696	Vueltas
1697-1703	Hojas de β intermoleculares [débil]

Tabla 2: Asignaciones de bandas vibratorias de la región Amida I para seda de Bombyx mori basadas en la evaluación comparativa de varios estudios de Hu et ^al.57.

Resultados

Una solución de droga ideal para hilar es una solución transparente, viscosa y sin precipitados, que indica la disolución completa de la proteína (Figura 7A). Por el contrario, la disolución incompleta da como resultado una suspensión lechosa o precipitados visibles (Figura 7B, C). El tiempo requerido para la disolución completa de la proteína varía en función del solvente, con algunos solventes, como las mezclas TFA / TFE / H₂O, que generalmente disuelven completamente la proteína en un intervalo de tiempo de 30 minutos, mientras que otros, como HFIP, pueden requerir agitación nocturna junto con vórtices ocasionales.

Figura 7: Optimización de la solución de droga giratoria. (A) Un disolvente capaz de disolver completamente la proteína proporciona una solución de droga giratoria clara y viscosa. La disolución parcial o suspensión de la proteína por una elección de disolvente no óptima puede dar lugar a (B) un estado demasiado viscoso, generalmente con precipitado visible o (C) una suspensión lechosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La Figura 2E muestra una fibra dibujada a mano representativa, mientras que la Figura 4D muestra una fibra enrollada en húmedo. Antes de cualquier análisis posterior, la microscopía óptica es esencial para evaluar la calidad de la fibra. En la Figura 8 se muestran micrografías ópticas representativas de fibras de seda recombinantes hiladas en húmedo adecuadas para el análisis posterior e hiladas con dos condiciones diferentes (consulte la Figura 3 para ver configuraciones de hilatura húmeda de muestra). Mediante microscopía óptica (Figura 8A), está claro que estas fibras exhiben un diámetro uniforme, con un diámetro disminuido aparente tras la aplicación de un dibujo posterior al giro (es decir, tal como se centrifuga (AS) frente a un estiramiento posterior al hilado en una proporción de 4x en etanol al 40% (4x-EtOH)). El mayor grado de birrefringencia que resulta en un mayor contraste en la microscopía de luz polarizada (Figura 8B) es consistente con una alineación molecular mejorada en la fibra como resultado del proceso de extracción posterior al giro. Finalmente, debe tenerse en cuenta que lo más probable es que se observen defectos en alguna fracción de las fibras evaluadas, lo que hace que un segmento determinado de fibra no sea adecuado para el análisis posterior. En la Figura 9 se muestran dos ejemplos de este tipo.

Figura 8: Micrografías ópticas representativas de fibras de seda de araña recombinantes hiladas en húmedo. Las fibras en el estado AS y después de un estiramiento posterior al giro de 4x en etanol (EtOH) se ilustran para una construcción de seda piriforme-aciniforme quimérica (Py₂W₂) observada por microscopía óptica (columna izquierda) y microscopía de luz polarizada (columna derecha). Las imágenes se reproducen con permiso de Ghimire et ^al.17. Barras de escala = 30 μm. Abreviaturas: AS = as-spun; EtOH = etanol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Ejemplo de posibles defectos de fibra observables mediante microscopía óptica. (A) Un ejemplo de un defecto "abultado". (B) Un ejemplo de un defecto de "cuello". Barras de escala = 20 μm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Después de asegurarse de que no hay defectos en un segmento de fibra determinado y después de la determinación del diámetro (sección 3.2 del protocolo), se pueden realizar pruebas de tracción (por ejemplo, Figura 6). En la Figura 10 se muestran las curvas representativas de tensión-deformación obtenidas para una seda de araña recombinante quimérica hilada en diferentes condiciones. Dependiendo de las condiciones de hilado, las fibras resultantes varían desde frágiles (estado AS) hasta altamente extensibles con una resistencia similar a la del estado AS (estado 2x-aire) hasta fibras mucho más fuertes y menos extensibles (estado 4x-EtOH). Cabe señalar que se deben evaluar múltiples segmentos de fibra y lotes de fibras hiladas para evaluar de manera inequívoca y rigurosa el comportamiento mecánico.

Figura 10: Curva representativa de tensión-deformación de fibras hiladas a partir de diversas condiciones. Las fibras se analizaron en el estado de hilado (AS) o mediante la producción utilizando estiramiento automatizado posterior al centrifugado (relación de extracción y condición de estiramiento (aire frente a solvente) indicados). Figura adaptada con permiso de Ghimire et al.(2024)¹⁷. Abreviatura: AS = as-spun. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Finalmente, la estructura secundaria del estado de fibra se puede evaluar mediante espectromicroscopía ATR-FTIR. Los espectros típicos de fibra de seda adquiridos por esta metodología (Figura 11A, B) tendrían bandas de proteínas características, incluido un pico ancho de amida A (centrado alrededor de ~ 3,300 ^cm-1), un pico de amida I (~ 1,600-1,700 ^cm-1) y un pico de amida II (~ 1,500-1,600 ^cm-1). Aquí, nos enfocamos en la evaluación de la región amida I (por ejemplo, Figura 11C, D). El análisis de la segunda derivada es útil como medio de identificación de componentes clave del pico de amida I (Figura 11E, F), proporcionando credibilidad a la deconvolución cuantitativa del pico (Figura 11G-J) que permite la evaluación y comparación de las proporciones del tipo de estructura secundaria observadas en una fibra de seda hilada en una condición determinada.

Figura 11: Análisis de espectros FTIR y estructura secundaria. (A, B) Espectros FTIR de fibras Py₂W₂ producidas por hilado húmedo en el estado (A) tal como se hilan (AS) y (B) incorporando un estiramiento posterior al centrifugado 4 en etanol. (C, C) Regiones de amida I de los espectros FTIR que se muestran en A y B, respectivamente. (E-F) Segunda derivada de las regiones de amida I que se muestran en C y D, respectivamente, calculada utilizando el paquete de software indicado. (G-J) Deconvolución de pico de amida I realizada utilizando los paquetes de software (G e I) OMNIC o (H y J) OriginPro, siendo los paneles G e I la deconvolución correspondiente a C y H y J a D . Abreviaturas: FTIR = infrarrojo por transformada de Fourier; AS = as-spun. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Más allá de las técnicas individuales, la correlación de los datos de estructuración secundaria, rendimiento mecánico y orientación (supra)molecular suele ser esencial tanto para comprender las influencias de los diferentes parámetros de hilatura en el material resultante como para la optimización racional del proceso de hilatura. En las deconvoluciones FTIR que se muestran en la Figura 11, por ejemplo, comparando el AS con las condiciones de 4×-EtOH para una seda quimérica, las contribuciones sustanciales de la hoja de β a la banda de amida I son claras para ambas condiciones, pero comprenden una mayor proporción de la estructura secundaria total para el estado estirado posterior al hilado en relación con el estado AS, independientemente del método de deconvolución (p. ej., Figura 11G, H vs. Figura 11I, J). Esto es consistente tanto con la fuerza sustancialmente mayor observada para la condición de 4×-EtOH que el estado AS (Figura 10) como con la mejora en la alineación molecular en la condición 4×-EtOH en relación con el estado AS (Figura 9). La caracterización y el análisis detallados, que cubren el rango de condiciones que se muestran en la Figura 10, se informaron previamente¹⁷. Por lo tanto, no hemos recapitulado todo el análisis aquí, sino que hemos utilizado esta comparación por pares como una demostración de la forma en que estas tres clases de datos son complementarias entre sí y permiten el desarrollo de una comprensión mucho más completa del comportamiento de la fibra que cualquier técnica aislada.

Archivo complementario 1: Un archivo que contiene las figuras complementarias S1-S34 que representan la medición del diámetro de la fibra, el procesamiento de datos mecánicos y la adquisición y procesamiento de datos FTIR. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Una hoja de cálculo que permite determinar las propiedades mecánicas clave (es decir, tensión, deformación, módulo de Young y tenacidad) a partir de datos de masa frente a tiempo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La producción de proteínas recombinantes permite el emocionante potencial de fabricar materiales en una amplia variedad de formatos, y los avances recientes implican que estos materiales basados en proteínas se están acercando a un uso industrial más generalizado⁵⁸. Aquí, nos hemos centrado en la producción de fibra a partir de seda recombinante, ya que este es el formato de seda recombinante directamente relacionado con las sedas de araña fibrosa nativas. Se ha promocionado que las fibras de seda tienen numerosas aplicaciones potenciales debido a las reconocidas propiedades mecánicas de las sedas de araña natural y debido al potencial para producir fibras de alto rendimiento de manera sostenible³². Las aplicaciones propuestas van desde textiles de alto rendimiento hasta materiales absorbentes de energía, productos de cuidado personal y uso sanitario^58,59. Los dispositivos y materiales a base de seda de araña en formatos portátiles o en otros contextos donde se mejora la conductividad eléctrica también están bajo exploración activa tanto para aplicaciones biomédicas como más amplias⁶⁰. Por lo tanto, existe un amplio interés en desarrollar, optimizar y personalizar materiales a base de seda de araña. En este protocolo, describimos una serie de procedimientos dirigidos a la producción rápida de fibra, ya sea después de la preparación de una nueva proteína de seda recombinante o para modular las propiedades de los materiales de una seda recombinante que ya se ha establecido que es hilable.

Independientemente del método de hilatura que se emplee, es fundamental determinar las condiciones que permiten la producción de dopaje de centrifugación mediante la detección de las condiciones de disolvente/tampón y la concentración de proteínas, como se detalla en este documento. El objetivo final es la solubilización de la proteína a una concentración suficientemente alta para permitir una rápida conversión en una fibra sin autoensamblaje fuera de la vía en agregados u otras especies insolubles que impedirán el hilado "productivo". Se trata típicamente de una solución transparente y relativamente viscosa, que probablemente comprende especies autoensambladas como micelas/nanopartículas ^26,61 y/o separación de fases líquido-líquido⁶². Este protocolo no detalla métodos para evaluar exhaustivamente el estado de la droga de espín, ya que se puede lograr un hilado de fibra exitoso a través de la evaluación iterativa de varias dopes de espín y configuraciones de centrifugado. Se puede lograr una visión molecular y supramolecular detallada del estado de la dopaje de espín mediante técnicas como la viscometría, la dispersión de la luz, la espectroscopia de dicroísmo circular de UV lejano, la espectroscopia de resonancia magnética nuclear y/o la microscopía electrónica²⁶. También debe tenerse en cuenta que la proteína recombinante en sí misma puede modificarse para mejorar su comportamiento para el giro, siendo la inclusión de los dominios globulares no repetitivos N- y C-terminal un ejemplo de un método para aumentar la solubilidad de la espidroína³². En resumen, sin una identificación adecuada de la droga de espín, no es factible proceder a pruebas comparativas de las condiciones de centrifugado.

Una vez que se han identificado una o más condiciones de la droga de espín, el dibujo a mano proporciona una ruta rápida para evaluar las propiedades de la fibra de seda. Dado que se requieren volúmenes sustancialmente más bajos de droga para el dibujo manual productivo, se requieren masas mucho más bajas de proteína pura, lo que lo convierte en un excelente precursor de los enfoques automatizados de hilado en húmedo. Esto también proporciona un método muy manejable y sencillo para comparar directamente las propiedades de la fibra de diferentes espidroínas³³, nuevamente con el beneficio de que la producción de fibra es relativamente sencilla con pequeñas cantidades de proteína. Esto significaría que la optimización de los protocolos de expresión y purificación de proteínas para obtener los mayores rendimientos necesarios para el centrifugado húmedo puede centrarse en las espidroínas más prometedoras. La desventaja, por supuesto, es que el dibujo a mano no es susceptible de producir fibras largas y continuas o cantidades sustanciales de fibra de manera simplificada.

Dada suficiente proteína, el hilado húmedo proporciona ventajas para la producción optimizada de fibras largas y continuas³². No solo esto, sino que las propiedades de la fibra se pueden modular fácilmente a través del proceso de hilado. La elección de las condiciones de la droga giratoria, por ejemplo, proporciona una ruta clara para mejorar la mecánica de la fibra. En el caso de una proteína de seda aciniforme recombinante de ~ 60 kDa, por ejemplo, cambiar de una droga de espín a otra con todos los demás parámetros de giro constantes condujo a cambios dramáticos en la extensibilidad de la fibra²⁶. Esto, a su vez, se relacionó con la forma en que la espidroína aciniforme se ensambló en la droga de espín antes del hilado, con una homogeneidad mejorada de las nanopartículas autoensambladas en la droga de espín que se correlaciona con una mecánica de fibra mejorada. La incorporación de un dibujo posterior al giro, teniendo en cuenta que la relación de extracción debe optimizarse para un tipo de fibra determinado, también suele mejorar la mecánica de la fibra de seda a través de una combinación de alineación molecular mejorada y conversión mejorada a, por ejemplo, cristalitos de lámina β que fortalecen las fibras³². Finalmente, el uso de diferentes condiciones durante la etapa de estirado posterior al giro proporciona un medio para modular las propiedades de la fibra. La exposición al solvente, ya sea inmediatamente antes o durante la extracción, puede cambiar sustancialmente las propiedades mecánicas y estructurales de la fibra^17,38, teniendo en cuenta que las diferentes espidroínas tendrán diferentes preferencias y tolerancias de solventes (p. ej., con fibras aciniformes recombinantes que son altamente compatibles con el agua^26,31 frente a fibras piriformes recombinantes que experimentan contracción en agua³⁸ frente a fibras de espidroína piriforme-aciniforme quimérica que exhiben la compatibilidad con el agua de la espidroína aciniforme a pesar de que esta es menos de la mitad de la proteína en masa¹⁷).

El protocolo descrito proporciona un enfoque altamente personalizable y versátil para evaluar y optimizar la hilabilidad y las propiedades de la fibra de las sedas de araña recombinantes. En todos los casos, las propiedades de la fibra resultantes deben analizarse y compararse de manera consistente y sólida. Aquí, proponemos el uso de microscopía óptica, incluida la microscopía de luz polarizada, las pruebas de tracción y la espectromicroscopía FTIR como un "conjunto de herramientas estándar" de técnicas para este propósito. Se pueden aplicar técnicas adicionales de caracterización biofísica y de materiales para ampliar la comprensión de las fibras resultantes, pero este conjunto de técnicas proporciona una cobertura sobresaliente de las propiedades clave de la morfología, la alineación intrafibrilar / anisotropía, el rendimiento mecánico y la estructuración secundaria de proteínas. En particular, aunque la espectromicroscopía FTIR proporciona un medio relativamente sencillo para evaluar la estructuración secundaria de la fibra de seda y la microscopía de luz polarizada permite inferencias sobre el grado de alineación molecular mejorada que se ha logrado, otras metodologías como la espectroscopia de RMN de estado sólido^63,64, la difracción de rayos X⁶⁴, la espectromicroscopía Raman polarizada⁶⁵ y/o la microscopía óptica no lineal⁵⁴ para evaluar de manera más integral la cristalinidad, la alineación y la estructuración dentro de las fibras de seda para la elucidación completa de la relación estructura-mecánica. Dada la idoneidad del hilado húmedo para otros tipos de proteínas⁶⁶, anticipamos que este protocolo será generalmente aplicable más allá de las sedas recombinantes.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1,1,1,3,3,3-hexafluropropanol (HFIP)	Thermo Fisher Scientific	445820500	Utilizado para la preparación de dopaje
Jeringa 1725LTSN con aguja cementada con punta Luer	Hamilton	81100	Utilizado para
2,2,2-trifluoroetanol (TFE)	Sigma-Aldrich	T63002-500G	Utilizado para la preparación de dopaje
Etanol absoluto	Fisher Scientific	BP28184	Utilizado para baño de coagulación
Ácido acético	Fisher Scientific	A38-212	Utilizado para la preparación de dopaje
Balanza analítica	Mettler Toledo	XS105	Dispositivo de prueba de tracción
Cloruro de calcio (CaCl < sub>2< / sub>)	Sigma-Aldrich	C-3881	Utilizado para la preparación de dopaje
Ácido cítrico	Millipore Sigma	77-92-9	Utilizado para la preparación de dopaje
Computadora	Raspberry Pi	Raspberry Pi 4 Modelo B	Dispositivo de hilado húmedo: proporciona la capacidad de usar la interfaz gráfica de usuario para controlar motores paso a paso
Hidrogenofosfato disódico (Na2HPO4)	Millipore Sigma	7558-79-4	Utilizado para la preparación de dopaje
Ácido fórmico	Fisher Scientific	A118-500	Utilizado para la preparación de dopaje
Portaobjetos de vidrio	Millipore Sigma	S8902-1PAK	Utilizado para el montaje de fibra
Ácido clorhídrico (HCl)	EM Science	HX0603-53	Utilizado para la preparación de dopaje
MCT-A Detector refrigerado	Thermo Fisher Scientific	840-199300	Evaluación FTIR de la estructura secundaria de la fibra
Placa de montaje	Fabricado internamente	Dispositivo de
NEMA 17 Motor paso a paso biopolar NEMA 17	STEPPERONLINE	17HS15-1504S-X1	Dispositivo de hilado en húmedo - nota: se requieren varios motores para realizar el estiramiento posterior al centrifugado
Microscopio FTIR Nicolet iN10	Thermo Fisher Scientific	912A0604	Evaluación FTIR de la estructura secundaria de la fibra
Nicolet iN10 Etapa de mapeo	Thermo Fisher Scientific	840-198800	Evaluación FTIR de la estructura secundaria de la fibra
Nicolet iN10 Joystick de etapa motorizada	Thermo Fisher Scientific	840-199800	Evaluación FTIR de la estructura secundaria de la fibra
Nicolet Slide-On Ge Micro Tip ATR 350	Thermo Fisher Scientific	840-194800	Evaluación FTIR de la estructura secundaria de la fibra
OMNIC Picta versión 1.7.224	Software de control de instrumentos Thermo	Fisher Scientific	INQSOF018
OMNIC versión 9.11.745	Thermo Fisher Scientific	INQSOF018	Software de procesamiento y análisis de datos específico del instrumento FTIR
Microscopio óptico/de luz polarizada	Zeiss Canada	Axio Observer A1	Microscopio óptico invertido
OriginPro 2025 10.2 SR1	OriginLab Corporation	OriginPro 10.200196	Software de análisis y procesamiento de datos FTIR de terceros
Fosfato de dihidrógeno potásico (KH2PO4)	Fisher Scientific	P285-10	Utilizado para la preparación de dopaje
Fosfato potásico dibásico (K2HPO4)	Fisher Scientific	BP363-500	Utilizado para la preparación de dopaje
Fuente de alimentación	ALITOVE	ALT-1205	Dispositivo de hilado húmedo - Adaptador de fuente de alimentación de 12V 5A Convertidor AC 100-240V Entrada con conector de salida de CC de 5.5x2.5mm - nota: para un rendimiento óptimo, puede requerir una fuente de alimentación separada para cada motor
Acetato de sodio	Sigma-Aldrich	S2889-1KG	Utilizado para la preparación de dopaje
Hidróxido de sodio (NaOH)	Millipore Sigma	1310-73-2	Utilizado para la preparación de dopaje
Rodillos giratorios	Fabricado internamente		Utilizado para
cables de motor paso a paso	XMSJSIY	B0BD5FV3R2	Dispositivo de hilado húmedo: proporciona conexión desde controladores de motor paso a paso a motores paso a paso
Controlador de motor paso a paso (Pi HAT)	Adafruit	DC & Motor paso a paso HAT para Raspberry Pi	Permutación del controlador del motor del dispositivo de giro húmedo 1 - tenga en cuenta la tasa de rotación limitada del motor de ~46 rpm Controlador del
motor paso a paso (USB)	Polulu	Tic T249	Permutación del controlador del motor del dispositivo de giro húmedo 2 - úselo cuando se necesite una rotación superior a 46 rpm Bomba de
jeringa	KD	Scientific Modelo 100	Dispositivo de prueba de tracción y dispositivo de centrifugado húmedo
Ácido trifluoroacético (TFA)	Millipore Sigma	TX1276-7	Utilizado para la preparación de dopaje
Tris-clorhidrato	EMD Millipore	9310-500GM	Utilizado para la preparación de dopaje
Concentrador USB	Acasis	B07Q3TYF15	Dispositivo de centrifugado húmedo - Concentrador USB alimentado de 48 W - Concentrador de datos USB 3.0 de 10 puertos ACASIS - con interruptores de encendido/apagado individuales y adaptador de corriente de 12 V/4 A Divisor USB - interfaz entre los controladores de motor paso a paso Raspberry Pi y Tic T249