Procedimiento de transección/resutura del nervio ciático en ratón para estudiar la reparación nerviosa y la recuperación funcional

Summary

Este protocolo describe un modelo de transección y resutura del nervio ciático en ratones para estudiar la regeneración de nervios periféricos utilizando neuronas ganglionares de la raíz dorsal adultas. Permite el análisis in vivo del crecimiento axonal, la reinervación muscular y la recuperación funcional tras una lesión nerviosa.

Abstract

La reparación nerviosa es crucial para restaurar la función tras una lesión axonal. Sin embargo, las neuronas maduras en el sistema nervioso central (SNC) tienen una capacidad limitada para regenerar sus axones tras una lesión debido a la disminución de la capacidad de crecimiento intrínseco y a un entorno hostil. En cambio, las neuronas del sistema nervioso periférico (SNP) presentan un potencial regenerativo robusto. Entre ellas, las neuronas adultas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) son especialmente conocidas por su capacidad de regenerarse eficazmente tras lesiones nerviosas periféricas, lo que las convierte en un modelo ideal para estudiar los mecanismos celulares y moleculares subyacentes a la reparación nerviosa. Aquí se describe una técnica de microsutura modificada, denominada "lazo antes de la transección", para generar un modelo de transección y resutura del nervio ciático en ratones, seguido del análisis de la regeneración axonica. También se ha demostrado que las evaluaciones conductuales y la reinervación muscular valoran la recuperación funcional. Tras la transección y resutura del nervio ciático, los animales presentan inicialmente déficits conductuales, pero la recuperación completa suele observarse a los 30 días posteriores a la lesión. Aplicar fármacos que promuevan la fusión axonal en el lugar de la lesión acelera significativamente la recuperación funcional. Este sistema modelo ofrece una herramienta poderosa para investigar los mecanismos que rigen la reparación nerviosa en mamíferos in vivo.

Introduction

La lesión axonal es una consecuencia común y grave del daño cerebral y medular, a menudo causada por lesiones traumáticas, neurotoxinas o trastornos neurológicos que alteran la conectividad neuronal y perjudican la regeneración^{axonal 1,2}. No todas las neuronas poseen una capacidad intrínseca de regeneración, crucial para la reparación de axones seccionados. La tasa de regeneración axonal está influida por múltiples factores, incluyendo el potencial intrínseco de crecimiento de la neurona, la eficiencia en la síntesis de proteínas, la dinámica del citoesqueleto, la eliminación de restos de mielina y la disponibilidad de factores^{de crecimiento 3,4}.

En el sistema nervioso central (SNC) adulto de mamíferos, la lesión axonal conduce a una capacidad regenerativa disminuida, principalmente debido a la falta de factores intrínsecos que promueven el crecimiento y a la presencia de señales extrínsecas^{inhibitorias 1,5}. En cambio, los axones del sistema nervioso periférico (SNP) poseen una capacidad robusta para regenerarse tras una lesión, gracias a los mecanismos intrínsecos de autorreparación de las neuronas periféricas y a la rápida reactivación de los programas de crecimiento pro-regenerativo. Al lesionarse, el segmento distal del axón se desconecta del soma neuronal y sufre degeneración walleriana, caracterizada por desintegración y fragmentación^{axonal 6,7}. La eliminación eficiente de los restos axonales y de mielina por parte de las células gliales es esencial para una regeneración exitosa, ya que previene la formación de cicatrices que podrían dificultar el crecimiento axonal ^3,8. Este proceso, junto con la remodelación del citoesqueleto de axones lesionados, favorece el recrecimiento del muñón proximal y facilita la reinervación del objetivo. Estos eventos ocurren en fases parcialmente superpuestas, durante las cuales la activación inducida por lesión de factores de transcripción como ATF3 y c-Jun promueve programas de expresión génica^{pro-regenerativa 4,9,10}.

La fusión axonal regenerativa representa un mecanismo eficiente para restaurar la conectividad neuronal tras la lesión^{axonal 11}. Este proceso fue descrito por primera vez en el cangrejo de río Procambarus clarkii en 1967-12 y desde entonces ha sido documentado en varias especies^{13, 14, 15, 16}, incluyendo Caenorhabditis elegans¹⁷. Aunque la evidencia directa de la fusión axonal en mamíferos sigue siendo limitada, se han empleado con éxito estrategias inductoras de fusión para mejorar la reparación^{nerviosa 11}. Cabe destacar que el químico fusógeno polietilenoglicol (PEG) promueve el resellado de membranas y ha demostrado facilitar la recuperación funcional tras lesiones tanto en los nervios periféricos como en la médula espinal en modelos^mamíferos 18,19,20,21,22,23,24. Hallazgos recientes indican que la depleción de la peroxidasa de glutatión (GPX) es suficiente para promover la fusión axonal en C. elegans²⁵. De manera similar, los ratones knockout condicional de Gpx4 o aquellos tratados con el inhibidor de GPX ML162 mostraron una recuperación funcional acelerada tras la transección del nervio ciático, potencialmente mediante fusión axonal^{mejorada 25}.

El nervio ciático es un nervio mixto compuesto por axones sensoriales, somáticos motores y^{automotores autónomos 26}. Proviene de los segmentos espinales L4 y L5 en ratas²⁷, y de los segmentos L3 y L4 en ratones²⁸. Debido a su accesibilidad y consistencia anatómica, la lesión del nervio ciático se ha convertido en uno de los modelos más utilizados para estudiar la regeneración del nervio^{periférico 29,30}. Estos modelos permiten investigar tanto los mecanismos neuronales intrínsecos como los factores ambientales extrínsecos que influyen en el crecimiento axonal y la recuperación^{funcional 3,4,9}. El uso de la trituración del nervio ciático como paradigma experimental en neurociencia se remonta a finales del siglo^{XIX 29}. Además de los modelos de aplastamiento nervioso, la transección nerviosa se utiliza ampliamente para estudiar la regeneración de axones y la recuperación funcional. Sin embargo, la transección clásica del nervio ciático seguida de sutura en ratones suele ser menos reproducible y fiable que en ratas, debido al pequeño tamaño del nervio y su textura^frágil.

Utilizando un modelo modificado de transección y resutura del nervio ciático, denominado "bucle antes de la transección", se generaron con éxito²⁵ modelos reproducibles de transección y resutura del nervio ciático. Este enfoque elimina la necesidad de manipular el nervio tras la transección mediante la preinserción de la sutura antes del corte, reduciendo así el esfuerzo mecánico y minimizando la variabilidad debida a la técnica quirúrgica. Se encontró que niveles moderados de modulación de GPX contribuyeron a la recuperación funcional tras la transección completa del nervio ciático^{del ratón 25}. El cotratamiento de bajas concentraciones ML162 (0,25 μM⁾³², inhibidor de GPX y polietilenglicol (PEG, 500 mM)18,19,20,21,22,23,24 en la lesión de resutura del nervio ciático (SNT) mejoró con éxito la puntuación de comportamiento evaluada mediante pincipollas, asimetría de falla del pie y la prueba de dispersión de los dedos ^25,33.34. Los fragmentos de axones distales amputados de neuronas ganglionares de la raíz dorsal (DRG) de mamíferos degeneran en 3 días, lo que provoca alteraciones en las uniones neuromusculares (NMJ^)6,35, y las neuronas DRG regenerativas reinervan los músculos para recuperar sus funciones. El grupo de cotratamiento SNT/resuture-ML162/PEG mostró NMJs inervadas y puntuaciones de comportamiento mejoradas en el punto de inicio (3 días después de la operación), lo que indica una recuperación temprana de la función^{neuromuscular 25}.

Aquí se describe el método de microsutura "bucle antes de la transección" y la administración de fármacos que permitió las observaciones anteriores en ratones. Un protocolo de fusión PEG-fusión previamente establecido, que permite la reparación rápida de nervios seccionados de ratas, fue^{modificado 18}. Se informó inicialmente que el polietilenglicol (PEG) promovía la reconexión exógena de los axones gigantes mediales (MGA) de cangrejo de río cortados in^{vitro 36}. Los protocolos de fusión PEG mejoraron los resultados conductuales en el 25%-30% de los ensayos que involucraron lesiones por separación por aplastamiento del nervio ciático de la rata, aunque no se observó recuperación funcional en los primeros^{puntos 34}. Las mejoras posteriores incorporaron el concepto de sellado endógeno por^{membrana 37}. Tras una lesión nerviosa, la reparación rápida del plasmalemo es neuroprotectora y previene la neurodegeneración. La acumulación inducida por Ca²+ de vesículas unidas a membranas facilita este proceso^{de sellado 38}. La transección nerviosa completa altera el axolema así como las vainas endoneurial, perineurial y epineurial en el lugar de la lesión. La microsutura de la vaina epineurial alinea los muñones del nervio proximal y distal. Durante el paso de sutura, el uso de solución fisiológica hipotónica libre de Ca²+ reduce la formación de vesículas delimitadas por membrana, manteniendo abiertas las vainas endoneuriales y perineuriales y permitiendo que se aproximen de cerca mediante las suturas epineuriales. A continuación, la aplicación de solución salina que contiene^{Ca 2+} induce la acumulación de vesículas para sellar la ruptura plasmalemémica^{restante 18}.

En este protocolo, se utilizaron ratones adultos FVB (8-10 semanas) y ratones C57BL/6, y no se observó ninguna diferencia específica de la cepa. El nervio ciático en ratones se encuentra aproximadamente a 1-2 mm por debajo del músculo glúteo a mitad del muslo y es notablemente más delgado y frágil que en ratas, lo que requiere mayor precisión quirúrgica durante la disección y sutura. Se debe tener cuidado para evitar que los nervios se sobreestiren o manipulen en exceso que puedan comprometer la recuperación funcional. Este enfoque consiste en seccionar completamente el nervio, lo que resulta en un espacio físico entre los muñones proximal y distal. Debido a que esta brecha inhibe la regeneración axonal directa, la recuperación exitosa suele requerir intervención microquirúrgica o injerto nervioso.

Dado que el nervio ciático del ratón es más fino y delicado que el de la rata, se requiere mayor precisión quirúrgica. Aunque la microsutura se utiliza comúnmente, puede causar inadvertidamente traumatismos adicionales debido a una manipulación excesiva o a pasadas repetidas de^aguja. Estas limitaciones pueden introducir variabilidad y potencialmente dificultar la evaluación de nuevas estrategias de tratamiento. Por lo tanto, lograr resultados quirúrgicos consistentes minimizando el daño nervioso inducido por sutura es esencial para evaluar de forma fiable la recuperación funcional en modelos de transección nerviosa. Utilizando este método de "bucle antes de la transección", se generaron modelos reproducibles de transección y resutura del nervio ciático, y se evaluaron los efectos del tratamiento dual con PEG y ML162 sobre la recuperación funcional. En general, a pesar de su uso generalizado, el modelo de transección del nervio ciático en ratón presenta desafíos técnicos debido al pequeño tamaño y fragilidad del nervio. Este método modificado de resutura descrito aquí aborda una necesidad crítica de un protocolo microquirúrgico reproducible y estandarizado que minimice el daño mecánico.

Protocol

Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en San Antonio (Número de protocolo: 20200082AR). Se utilizaron ratones adultos machos y hembras FVB (8-10 semanas, 20-25 g) para los procedimientos experimentales JoVE descritos aquí. Los ratones C57BL/6 (de 8-10 semanas, 20-25 g) se usaron solo en cirugías de práctica preliminar realizadas antes de los experimentos formales para optimizar la precisión del manejo y sutura. Estas sesiones de práctica confirmaron que el procedimiento de "bucle antes de la transección" produjo resultados comparables en ambas cepas; por lo tanto, todos los datos formales presentados en este manuscrito se obtuvieron de ratones FVB. Inicialmente se incluyeron un total de diez ratones con FVB (cinco machos y cinco hembras) para la resección del nervio ciático, seguida de tratamiento con ML162 + PEG. Un animal mostró una variación anatómica congénita en la que el nervio ciático se bifurcó en dos ramas principales antes del lugar de la transección, lo que resultó en cirugía incompleta y exclusión del análisis. Por ello, se realizaron análisis conductuales e histológicos en nueve animales (n = 9). Ambos sexos mostraron una recuperación regenerativa y conductual comparable, y no se observaron diferencias específicas por sexo. Un ratón adicional se sometió a una doble penetración de sutura sin transección nerviosa (control simulado) para evaluar el posible impacto del propio procedimiento de sutura en los resultados conductuales. No se observaron diferencias notables en la respuesta regenerativa entre sexos. Los animales fueron alojados en condiciones estándar con un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas, a 75 °F y humedad relativa del 40%-60%, con acceso ad libitum a comida y agua. Se utilizaron ratones machos y hembras, y no se observaron diferencias notables entre animales machos y hembras. Los procedimientos quirúrgicos se realizaron bajo anestesia isoflurana del sistema de anestesia de bajo flujo SomnoSuite. Las pruebas de comportamiento comenzaron en el segundo día postoperatorio y se repitieron en los días 4, 7, 10, 14, 18, 22 y 27, según se indica en las cifras correspondientes. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Transección/resutura del nervio ciático y tratamiento farmacológico

1. Colocar al animal sobre una almohadilla calefactada donde se pudiera observar el nervio ciático bajo un microscopio estereoscópico de disección (Figura 1A).
2. Anestesiar al ratón usando el sistema de anestesia de bajo flujo SomnoSuite.
   NOTA: Confirma la profundidad de la anestesia por la ausencia de respuestas reflejas, como la reacción a un pellizco en el dedo del pie, antes de iniciar la cirugía. Aplica pomada oftálmica veterinaria en los ojos para evitar la sequedad corneal.
3. Afeita el vello del muslo y alrededor.
   NOTA: Elimina los pelos afeitados y caídos de la forma más limpia posible. De lo contrario, los pelos se pegarán a la sutura de nailon 10-0 y contaminarán el nervio ciático. Los pelos residuales pueden eliminarse suavemente con cinta de laboratorio o cinta adhesiva tras el afeitado para asegurar un campo quirúrgico limpio. Desinfecta el lugar quirúrgico limpiando secuencialmente la zona afeitada con etanol al 70%, betadina y una última toallita con etanol al 70% usando algodón autoclavado.
4. Localizar el hueso del fémur y realizar una pequeña incisión cutánea de aproximadamente 1,0 cm (rango 0,8-1,2 cm) a la mitad del muslo, aproximadamente ~1 mm posterior y en paralelo al hueso del fémur usando tijeras quirúrgicas finas.
   1. Retrae suavemente el glúteo mayor para exponer el bíceps femoral subyacente. Luego, utiliza las puntas de las tijeras para separar suavemente las cabezas anterior y posterior del bíceps femoral, sin cortar, para exponer el nervio ciático bajo la muesca ciática. Estos pasos se realizan bajo observación visual directa, no bajo el microscopio.
5. Extrae el nervio ciático del cuerpo usando pinzas microdiseccionadoras para facilitar la cirugía en el nervio ciático (Figura 1A).
   NOTA: Asegura las pinzas con cinta adhesiva para evitar que se extienda más allá de cierto nivel y así minimizar el daño al nervio ciático. Coloca la punta de la pinza bajo el nervio ciático y levanta el nervio ciático hacia arriba usando el muslo del ratón como punto de apoyo. Ten cuidado de levantar el nervio solo lo necesario para facilitar la sutura y evita aplicar tensión o tirarlo hacia fuera, ya que un estiramiento excesivo puede dañar los axones o las estructuras circundantes.
6. Enfoca el microscopio en el nervio ciático expuesto. A partir de este paso, continúa por el Paso 15 utilizando un microscopio (Figura 1A).
7. Penetrar el doble del nervio ciático con sutura de nailon 10-0 (Figura 1B,C). Ve al Paso 1-8 para el control sin cortes. Ve al Paso 1-11 para la sección nerviosa.
   NOTA: Se realizaron dos penetraciones separadas aproximadamente por un ancho de nervio (~0,7 mm), posicionadas simétricamente a cada lado del sitio de transección previsto. Este espaciamiento aseguraba una correcta alineación de los muñones proximal y distal, minimizando al mismo tiempo el estrés mecánico en la lesión. Haz la penetración a través del centro del nervio ciático con la sutura, asegurando que las dos penetraciones realizadas por la sutura sean precisamente paralelas. Las suturas 10-0 son pequeñas y deben controlarse con pinzas muy finas. Se utilizó nylon no absorbible 10-0 porque proporciona excelente estabilidad a la tracción y mínima reactividad tisular durante el periodo de observación de 30 días. Este material se utiliza ampliamente en modelos microquirúrgicos de reparación nerviosa en ratones y^{ratas 18,31}. No se utilizaron suturas absorbibles porque la degradación gradual podría comprometer la alineación de los muñones nerviosos seccionados antes de que la recuperación funcional esté completa. Para minimizar la variabilidad dependiente del operador, todos los procedimientos quirúrgicos fueron realizados por un único cirujano formado tras una extensa práctica microquirúrgica bajo un estereomicroscopio. El método de "bucle antes de la transección" reduce aún más la variabilidad al eliminar la necesidad de manipular el nervio tras la transección, asegurando así una alineación y tensión consistentes entre animales. Esto requiere mucha práctica y un alto nivel de control. Antes de realizar cirugías con animales, los principiantes pueden encontrar útil practicar el movimiento de sutura utilizando hilos sintéticos finos como el hilo dental para desarrollar destreza y control bajo un estereoscopio.
8. Haz un nudo con cuidado con la sutura de nailon.
9. Coloca el nervio ciático expuesto bajo la capa muscular y cierra la piel usando suturas de nylon 4-0.
10. Determina que la doble penetración del nervio ciático con una sutura de nailon 10-0 no afecta al comportamiento del ratón.
    NOTA: Para confirmar esto, los ratones que sufrieron doble penetración de sutura sin transección fueron sometidos a las mismas pruebas de comportamiento utilizadas en los grupos experimentales, incluyendo pincil, asimetría de falla del pie y expansión de los dedos. Estos ratones alcanzaron consistentemente puntuaciones completas equivalentes a los controles de tipo salvaje no operados, lo que indica que el procedimiento de sutura por sí solo no afectó la función del nervio ciático.
11. Corta el nervio ciático a mitad de camino entre las dos suturas de nailon 10-0 usando un bisturí (Figura 1D).
    NOTA: Para minimizar la variabilidad, todas las cirugías fueron realizadas por el mismo experimentador entrenado utilizando un procedimiento estandarizado. Además, el diseño de "lazo antes de la transección" minimiza inherentemente la variabilidad al evitar el manejo nervioso tras la transección, asegurando una colocación y tensión consistentes de suturas en todos los animales. La posición de las suturas se verificó bajo un microscopio de disección para asegurar la uniformidad entre los animales.
12. Guarda las pinzas.
13. Lava el nervio cortado con solución salina tamponada con fosfato libre de Ca²+ (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄/_{NaH 2}PO₄, pH 7,4), preparada sin cloruro de calcio.
    NOTA: Enjuaga el muñón del nervio seccionado con PBS libre de calcio durante aproximadamente 10-20 segundos para limpiar la sangre y evitar un sellado prematuro. La sutura debe completarse rápidamente en 1-2 minutos para mantener la alineación y la viabilidad del tejido.
14. Elimina el PBS libre de Ca²⁺ absorbiéndolo con un pañuelo.
15. Haz un nudo con cuidado con la sutura de nailon (Figura 1E). Procede al Paso 20 si no se planifica o no se requiere tratamiento con drogas.
    NOTA: Se utilizó un nudo cuadrado estándar para la microsutura, compuesto por dos pasos opuestos apretados suavemente con pinzas finas bajo un estereomicroscopio. Los dos axones seccionados conectados por la sutura vuelven a una forma cercana a su forma original. La reconexión de un vaso sanguíneo seccionado puede ser un indicador visual de que los muñones del nervio proximal y distal están correctamente alineados. Durante el procedimiento, el tejido debe parecer fresco y húmedo, sin palidez ni compresión. Evita atar la sutura demasiado fuerte, ya que esto podría colapsar los vasos sanguíneos o deformar el nervio. Antes de atar el nudo final, asegúrate de que los extremos nerviosos estén aproximados sin tensión. Si es necesario, reposiciona suavemente la extremidad para facilitar la alineación natural en lugar de tirar del nervio, ya que una tensión excesiva puede aumentar el riesgo de neuroma o fibrosis.
16. Coloque 0,25 μM de ML162 en DMSO diluido en PBS sobre el nervio ciático suturado usando una jeringuilla. Deja que el nervio ciático suturado se sumerga en el fármaco durante 1 minuto.
17. Retira el ML162 absorbiéndolo con un hisopo de algodón estéril.
18. Coloque 500 mM de PEG en agua destilada, precalentados a 37 °C, sobre el nervio ciático suturado usando una jeringuilla. Deja que el nervio ciático suturado se sumerga en el fármaco durante 1 minuto.
    NOTA: 500 mM de PEG es una solución densa que puede solidificarse a temperatura de sala de operaciones. Coloque la jeringuilla sobre una almohadilla calefactada durante la operación para asegurar que el PEG permanezca líquido. Se cree que el PEG promueve la fusión de membranas al eliminar moléculas de agua entre las bicapas lipídicas adyacentes, permitiendo así un contacto cercano con la membrana y la fusión espontánea. Aunque el mecanismo molecular preciso sigue siendo investigado, se ha demostrado que este enfoque facilita la continuidad axonal y mejora la recuperación funcional en modelos de lesiones nerviosas periféricas.
19. Retira el PEG absorbiéndolo con un pañuelo.
20. Lava el nervio suturado con PBS que contiene Ca²⁺ (PBS suplementado con 1 mM de_{CaCl 2}; 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de tampón fosfato, pH7,4).
21. Elimina el PBS que contiene Ca²+ absorbiéndolo con un pañuelo.
22. Coloca el nervio ciático expuesto bajo la capa muscular y cierra la piel usando suturas de nylon 4-0.
23. Una vez que el animal se haya recuperado de la anestesia, devólvelo a su jaula.
    NOTA: Tras el cierre de la piel, el lugar quirúrgico se trató con un ungüento antibiótico tópico que contenía un analgésico. Cada animal fue monitorizado con una almohadilla térmica hasta que recuperó suficiente conciencia para mantener la reclinación esternal. Los animales eran alojados individualmente y devueltos a su grupo solo tras la recuperación completa de la función motora. Aunque el entorno quirúrgico no se mantenía bajo una campana de flujo laminar, todos los instrumentos quirúrgicos se esterilizaban y los procedimientos se realizaban mediante técnica aséptica con manos enguantadas y herramientas estériles.

2. Prueba de conducta - Pinchazo

NOTA: Para evaluar la respuesta de sensibilidad mecánica de alto umbral tras la lesión³³.

1. Coloca el ratón en una malla metálica y déjalo moverse libremente durante 30 minutos para que se adapte al nuevo entorno.
2. La parte más lateral de la superficie plantar de la pata trasera estaba dividida en 5 áreas (de la A a la E). Aplica suavemente el Austerlitz (tamaño 000) en la superficie plantar de la pata ipsilateral. El pinchazo se aplicó dos veces, desde el dedo más lateral (área A) hasta el talón (área E).
   NOTA: No penetres la piel.
   NOTA: Se consideró positiva una respuesta cuando el animal retiró rápidamente la pata de los dos estímulos de pinchazo. El ratón fue calificado con 1 en esta zona y luego probado en la siguiente (máximo 5). Si ninguna de las solicitudes recibía una respuesta positiva, la nota global era 0. Utiliza el territorio safeno del mismo lado ipsilateral como control positivo. Siempre provocará una respuesta positiva.

3. Prueba de comportamiento - Asimetría de falla en el pie (FF)

NOTA: Para medir qué tan bien los axones ciáticos inervan más músculos proximales³⁴.

1. Permite que los animales se deambulen libremente por una malla metálica elevada en la jaula para adaptarse al entorno. Un ensayo consta de un total de 50 pasos por extremidad posterior.
2. Anota cuando los animales fallan. Los criterios de puntuación son los siguientes.
   Puntuación 1: Culpa parcial. Tiró hacia atrás antes de que la pierna cayera completamente hasta el muslo.
   Puntuación 2: Culpa total. Se me cayó completamente hasta la entrepierna.
3. Calcular la puntuación compuesta de fallas en el pie de todas las extremidades traseras lesionadas y no lesionadas de todos los animales en cada momento postoperatorio.
   Puntuación compuesta de faltas en el pie = (# faltas parciales x 1) + (# faltas completas x 2)
4. Divide la puntuación compuesta de falla del pie por 50 (paso totales por extremidad) para obtener el porcentaje de falla de cada extremidad posterior.
   % de fallo en el pie = Puntuación compuesta de faltas en el pie/50 (pasos totales) x 100%
5. Se restan las fallas en los pies de la extremidad posterior lesionada de la proporción de fallas en la extremidad trasera intacta para obtener una puntuación de asimetría para cada animal en un momento postoperatorio dado.
   Puntuación de asimetría por falla en el pie = %FF (miembro intacto) - %FF (miembro lesionado)

4. Prueba de conducta - Propagación de los dedos

NOTA: Para evaluar la recuperación motora tras una lesión nerviosa. Según un estudio anterior, la prueba de motor de dispersión de los dedos es más sensible que el análisis de la marcha para detectar la recuperación de la función motora tras una lesión del nervio^{ciático 30}.

1. Cubre suavemente al animal con un trozo de tela y levanta la cola para observar claramente las patas traseras.
   NOTA: Alternativa: Agarra suavemente la nuca del ratón, arregla la cola, gírala y haz que el ratón se retuerza para observar el movimiento de los dedos.
2. Otorga la puntuación de apertura de los dedos de la siguiente manera:
   Puntuación 2: Expansión total. Define como una expansión completa, amplia y sostenida de todos los dedos durante al menos 2 segundos.
   Puntuación 1: Dispersión intermedia. Cualquier movimiento que no alcance una puntuación de dispersión completa. Temblar ligeramente, o moverse parcialmente.
   Marcador 0: Sin spreading. Ningún movimiento.
   NOTA: Todas las evaluaciones conductuales (pinchazo, falla en el pie y expansión de los dedos) fueron revisadas dos veces por un experimentador ciego a los grupos de tratamiento. Los animales fueron asignados aleatoriamente a grupos de tratamiento en el momento de la cirugía de acuerdo con el diseño utilizado en nuestro estudio previo (Ko et ^al.25), que incluía cuatro condiciones experimentales (solo resutura, PEG, ML162, ML162 + PEG). El artículo actual presenta datos del grupo ML162 + PEG, analizados de forma independiente manteniendo el rigor experimental original.

5. Perfusión y procesamiento de tejidos para histología

1. Anestesiar profundamente al animal y realizar perfusión transcárdica con solución salina con fosfato tamponado (PBS) a través del ventrículo izquierdo.
2. Incisa la aurícula derecha para permitir un drenaje sanguíneo completo.
3. Sumergir los tejidos recogidos en paraformaldehído (PFA) al 4% a 4 °C durante la noche para fijarlos.
4. Lava los tejidos fijos tres veces con PBS y luego incubalos en PBS a 4 °C durante la noche.
5. Crioprotege los tejidos sumergiéndolos en sacarosa al 30% a 4 °C durante la noche.
6. Incrusta los tejidos en un compuesto OCT, congélalos y secciona a 12 μm de grosor usando un criostato.
7. Guarda los bloques de tejido a -80 °C y criosecciones a -20 °C hasta su uso.
8. Solo para la recogida del nervio ciático, se omite la perfusión, ya que el contenido sanguíneo no afecta significativamente la calidad de la inmunotinción en estos tejidos periféricos.

Results

El protocolo anterior de fusión^PEG-18 se modificó para mantener resultados quirúrgicos consistentes y minimizar el daño nervioso causado por la sutura²⁵. Al colocar la sutura para que penetre a través del nervio antes de la transección, se minimizó el daño causado por pellizcar con pinzas o pinchar con una aguja tras la transección. Para probar el efecto de atar una sutura que penetra un nervio en su función, la sutura se pasó dos veces por...

Discussion

Los estudios de regeneración nerviosa utilizando modelos de transección nerviosa se realizan ampliamente en el nervio ciático^{del ratón 31,39}. Sin embargo, debido a su pequeño tamaño y textura blanda, el nervio ciático del ratón es difícil de manipular suavemente con herramientas quirúrgicas, y el tejido es propenso a desgarrarse durante la sutura. El proceso de microsutura, que a menudo implica manipulación excesiva, puede provoc...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pinzas #55	Dumostar-Biología	11295-51	Uno en cada mano. Necesitarás dos para agarrar una sutura de nylon 10-0.
Sutura de nylon 10-0	DemeTECH	NL761000,4F0P
Sutura de nylon 4-0	Mago de la Matriz	0197
Anti-beta-tubulina	R& Sistemas D	MAB1195
Anti-NF-200	Millipore Sigma	N4142
Austerlitz tamaño 000			Para la prueba de pinchazo
CF488 alfa-bungarotoxina conjugada	Biotium	00005
Tijeras diseccionadoras	Kent Scientific & nbsp;
Tijeras finas para sutura	Kent Scientific & nbsp;
Pinzas de iris	Kent Scientific & nbsp;
K& Almohadilla calefactante para animales pequeños H	K& Productos para mascotas H
ML162	Millipore Sigma	SML2561
Kit quirúrgico para ratón	Kent Scientific & nbsp;
Portaagujas	Kent Scientific & nbsp;
Polietilenglicol (PEG)	Millipore Sigma	P5413
SCG10	Novus Biologicals	NBP1-49461
SomnoSuite	Kent Scientific & nbsp;		Para anestesia con isoflurano
Pinza divisora			Se usaba para exponer el nervio ciático.