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Artículo de método

La senescencia inducida por fármacos en las células hepáticas promueve la polarización de los macrófagos M2: implicaciones para la hepatotoxicidad asociada a los inhibidores de la tirosina quinasa

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DOI:

10.3791/68725

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17 de octubre de 2025

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1Department of Life Sciences, Shiv Nadar Institution of Eminence, 2Independent Researcher, 3Servier Institute of Translational Medicine

En este artículo

Resumen

Aquí, estudiamos la hepatotoxicidad causada por lapatinib y neratinib a través de la polarización de macrófagos impulsada por SASP, que ofrece una comprensión mecanicista más profunda más allá de las pruebas de toxicidad tradicionales. Este enfoque demuestra cómo los hepatocitos senescentes influyen en las respuestas inmunitarias. Esto es particularmente valioso para evaluar los efectos a largo plazo de los fármacos y descubrir nuevos objetivos terapéuticos para controlar la hepatotoxicidad inducida por fármacos.

Resumen

El lapatinib y el neratinib son inhibidores de la tirosina cinasa (ITC) aprobados para tratar el cáncer de mama metastásico HER2 positivo, pero su uso clínico está limitado por la hepatotoxicidad. Dentro de los hepatocitos, las enzimas del citocromo P450 producen metabolitos reactivos de estos fármacos, causando daño en el ADN, disfunción mitocondrial y estrés oxidativo, que conducen a la lesión de los hepatocitos. Este estrés celular desencadena la senescencia de los hepatocitos, un estado de detención del crecimiento acompañado de la secreción de factores proinflamatorios y de remodelación tisular llamados fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP). SASP modifica significativamente el microambiente hepático, influye en el comportamiento de las células inmunitarias y empeora el daño tisular. Demostramos que lapatinib y neratinib inducen senescencia y SASP en la línea celular hepática HepG2. Además, SASP de estas células senescentes promueve la polarización similar a M2 de los macrófagos RAW264.7. Aunque los macrófagos M2 se asocian con respuestas antiinflamatorias y reparación tisular, su actividad excesiva o prolongada puede provocar daño tisular y fibrosis. Nuestros hallazgos destacan un mecanismo por el cual la senescencia de los hepatocitos inducida por TKI y la SASP modulan la respuesta inmune y pueden contribuir a la toxicidad hepática en pacientes con cáncer de mama. Esto subraya la importancia de dirigirse a las células senescentes o a los factores SASP para reducir la toxicidad hepática y mejorar los resultados del tratamiento, lo que hace que la identificación de senoterapéuticos eficaces sea un enfoque de investigación vital. No ha habido ningún informe de la literatura que demuestre el efecto del secreterma de células hepáticas inducido por TKI en la polarización de los macrófagos.

Introducción

Lapatinib y neratinib, ambos inhibidores de la tirosina quinasa (TKI) de molécula pequeña, recibieron la aprobación de la FDA en 2007 y 2017, para el tratamiento del cáncer de mama metastásico1. Se sabe que estos medicamentos inhiben el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano, HER22, un receptor de tirosina quinasa que se sobreexpresa en ciertos cánceres de mama3. A pesar de su éxito clínico, lapatinib y neratinib también se asocian con efectos adversos, particularmente hepatotoxicidad 4,5. La lesión hepática aguda, que se manifiesta por niveles elevados de aminotransferasa, ocurre en aproximadamente el 14% de los pacientes sometidos a tratamiento con lapatinib o neratinib6. La hepatotoxicidad se atribuye en gran medida al metabolismo hepático de estos fármacos, que involucra enzimas del citocromo P450 (CYP), predominantemente CYP3A4/5 7,8. Estas enzimas catalizan la formación de intermedios quinona-imina, que son electrófilos y altamente reactivos 9,10. Estos metabolitos reactivos, incluidos el lapatinib O-desalquilado, el lapanib N-desalquilado y el N-hidroxilapatinib, el neratinib O-desalquilado y el naratinib N-desmetilado, pueden formar aductos covalentes con macromoléculas celulares, interrumpiendo así las funciones celulares normales y, en última instancia, provocando lesión hepática11.

Los metabolitos reactivos de lapatinib y neratinib también pueden inducir estrés oxidativo, un desencadenante clave de la senescencia celular12. La senescencia celular es un estado de crecimiento detenido pero metabólicamente activo, caracterizado por la secreción de varias citoquinas proinflamatorias, factores de crecimiento y proteasas. Este fenotipo secretor se conoce como fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP)13,14,15. El SASP puede afectar profundamente el microambiente circundante, a menudo promoviendo la inflamación y la remodelación de los tejidos. En el contexto de la terapia contra el cáncer, el SASP puede enriquecer la población de células madre cancerosas y modificar la respuesta inmune para favorecer la supervivencia tumoral16. Además, las citoquinas inflamatorias pueden exacerbar el daño tisular. Especulamos que en pacientes tratados con lapatinib y neratinib, la lesión hepática se debe en parte a la senescencia inducida por TKI y la producción proinflamatoria de SASP.

Nuestros experimentos demostraron que lapatinib y neratinib inducen la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) en las células hepáticas, lo que conduce a daños en el ADN y disfunción mitocondrial, lo que a su vez desencadena la senescencia celular. Esta senescencia puede contribuir a la hepatotoxicidad inducida por lapatinib / neratibib al liberar factores SASP, que pueden influir en la polarización de los macrófagos.

Los macrófagos juegan un papel crítico en la respuesta inmune y su fenotipo funcional puede cambiar en respuesta a diversos estímulos17,18. El fenotipo clásico de macrófagos M1 se asocia típicamente con respuestas proinflamatorias, incluida la producción de citocinas como TNF-α e IL-1β, y generalmente se considera un marcador de inflamación aguda19,20. Por el contrario, el fenotipo de macrófagos M2 se asocia con fibrosis, reparación tisular21, inmunosupresión y respuesta a la inflamación crónica22,23. Las citocinas inflamatorias en el SASP pueden influir en la polarización de los macrófagos, promoviendo la conversión de macrófagos M1 a un fenotipo similar a M223. Este cambio en la polarización puede tener implicaciones significativas para el microambiente inmunológico, lo que puede conducir a la inmunosupresión, la progresión tumoral y la remodelación de la arquitectura tisular.

Para investigar la polarización de macrófagos inducida por lapatinib y neratinib, utilizamos la línea celular RAW264.7, una línea celular similar a un macrófago murino comúnmente utilizada en la investigación inmunológica24,25. Las células RAW264.7 se derivan de ratones BALB/c y se utilizan ampliamente para estudiar la inflamación, la fagocitosis y las respuestas inmunitarias25. Responden a diversos estímulos, incluidos los lipopolisacáridos (LPS), y son particularmente valiosos para estudiar la función de los macrófagos, la producción de citoquinas y la biología del cáncer26. En este estudio, HepG2, una línea celular de hepatoma humano, se trató con lapatinib y neratinib para imitar los efectos hepatotóxicos observados en los pacientes. La línea celular HepG2 se utiliza a menudo como modelo de estudio del metabolismo de los fármacos y la hepatotoxicidad debido a su origen humano y linaje de carcinoma hepatocelular27. Después de tratar las células HepG2 con los TKI, se recolectaron los medios acondicionados y se agregaron a las células RAW264.7. Se monitorizaron los cambios fenotípicos de macrófagos posteriores, centrándose en si el tratamiento induce un cambio del fenotipo M1 proinflamatorio al fenotipo M2 inmunosupresor.

La hepatotoxicidad inducida por fármacos generalmente se estudia mediante ensayos de citotoxicidad, evaluación de marcadores inflamatorios y el uso de modelos animales. En comparación con estos, nuestro método de examinar la hepatotoxicidad inducida por TKI lapatinib y neratinib a través de factores de fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP) y su influencia en la polarización de los macrófagos tiene varias ventajas. En primer lugar, nuestro método establece una conexión entre los factores SASP producidos por las células hepáticas senescentes inducidas por fármacos y la inmunidad innata, que puede estar relacionada con la remodelación de los tejidos, la inflamación crónica y la carcinogénesis 28,29,30,31. Las pruebas de toxicidad convencionales no pueden ayudarnos a capturar las interacciones a corto plazo entre el hígado y las células inmunitarias, ni pueden revelar el impacto a largo plazo de los TKI en la inflamación y la fibrosis hepáticas, particularmente en el contexto de la exposición crónica a medicamentos. Cuando se combina con un enfoque proteómico adecuado para identificar los componentes de SASP, esta técnica puede ayudar a identificar biomarcadores predictivos de hepatotoxicidad inducida por TKI e informar el diseño de intervenciones terapéuticas para mitigarla 29,30,31.

Para la implementación, los investigadores deben utilizar sistemas de medios acondicionados o de cocultivo con líneas celulares hepáticas e inmunes, como se describe, y evaluar biomarcadores de senescencia, así como macrófagos M1 y M2. Este método es más eficaz para evaluar la lesión hepática aguda o crónica inducida por fármacos, o para explorar estrategias para minimizar los efectos fuera del objetivo de las terapias contra el cáncer 29,30,31.

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Protocolo

1. Cultivo celular

  1. Cultive células HepG2 en medio Eagle modificado (MEM) con glucosa alta con suero bovino fetal al 10% (FBS) y células RAW264.7 en medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco con glucosa alta con FBS al 10% a 37 °C con 5% de CO 2 y actualice cada 3 días.
    NOTA: No se recomienda el uso de antibióticos a menos que haya contaminación por hongos o bacterias. Las células RAW264.7 crecen muy rápido y deben eliminarse después de 2 días.

2. Ensayo MTT

  1. Recuento de células y siembra de células
    1. Cultivar células HepG2 en una placa de cultivo de 60 mm en una incubadora de cultivo celular en medios de crecimiento completos (MEM + 10% FBS).
    2. Cuando las células hayan sido confluentes en un 80%, retire los medios de crecimiento, lave rápidamente con 1 ml de 1x PBS y agregue 600 μL de tripsina 0,5x. Incubar durante 5-6 min.
      NOTA: Todos los pasos deben realizarse en un gabinete de cultivo celular BSL 2.
    3. Neutralice la tripsina agregando 1,2 ml de medios de crecimiento completos dentro del BSL 2.
      NOTA: Para evitar la tripsinización excesiva, se deben agregar medios completos, el doble del volumen de tripsina agregada.
    4. Tome la suspensión celular en un tubo de microcentrífuga (MCT) de 5 ml y gránula centrifugando a 180 g (1000 rpm) durante 3-4 min a temperatura ambiente (RT).
    5. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el sedimento celular en 1 ml de medio, pipetee para mezclar como una suspensión de una sola célula y cuente con un hemocitómetro bajo un microscopio.
    6. A continuación, coloque las células HepG2 en una placa de 96 pocillos a 5000-7000 células por pocillo, en medios de crecimiento completos, por triplicado para cada dosis de fármaco, y manténgalas en la incubadora durante 12-16 h.
      NOTA: La confluencia celular debe ser del 50-60% para el tratamiento farmacológico, y este paso debe realizarse dentro de la campana.
  2. Tratamiento farmacológico
    1. Prepare concentraciones de trabajo gradualmente crecientes de lapatinib y neratinib en dimetilsulfóxido (DMSO) a partir de la concentración de stock (30 mM y 3,5 mM, respectivamente) dentro de la campana. Las concentraciones finales son 1, 2,5, 5, 10, 15, 25, 50 μM para lapatinib y 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10 μM para neratinib en medios de crecimiento (MEM + 5% FBS). Mantenga un control sin tratamiento para ambos medicamentos.
    2. Deseche el medio anterior de la placa de 96 pocillos que contiene las células, agregue 100 μL de medio con el fármaco e incube durante 48 h dentro de la incubadora.
  3. Tinción y cuantificación
    1. Después de 48 h, agregue 10 μL de colorante de bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT; 5 mg/mL), disuelva en 1x solución salina tampón de fosfato (PBS) en cada pocillo e incube durante al menos 2 h dentro de la incubadora hasta que aparezcan cristales de color púrpura.
      NOTA: Agregue el colorante directamente en un medio que contenga fármaco y no incube las células con colorante durante más de 4 h.
    2. Después de la incubación, retire el colorante, disuelva los cristales en 100 μL de DMSO en cada pocillo e incube durante 15 min, seguido de tomar la densidad óptica (OD) a 595 nm.
      NOTA: Este paso se puede realizar fuera del capó.

3. Ensayo de galactosidasa SA-β

  1. Tratamiento farmacológico
    1. Placas de células HepG2 en placas de 35 mm a una densidad de 40 x 104 células por placa en tres juegos, uno para lapatinib, otro para natinib y un control no tratado.
      NOTA: Los pasos de recuento y recubrimiento de celdas son los descritos en el paso 2.1.
    2. Agregue 1 μl de lapatinib de 5 mM de material de trabajo y 1,43 μl de neratinib de 3,5 mM de material principal en 2 mL de medio para obtener una concentración final de 2,5 μM (dosis subletal) de lapatinib y neratinib.
      NOTA: La dosis subletal del fármaco se selecciona siguiendo el gráfico de supervivencia celular en el ensayo MTT.
    3. Retire los medios anteriores de los platos y lave con 500 μL de 1x PBS una vez, y agregue medios que contengan medicamentos (dentro de la campana) y manténgalos durante 48 h dentro de la incubadora.
  2. Fijación y tinción
    1. Después de 48 h, retire el medicamento, dé un lavado rápido con 500 μL de 1x PBS una vez y fije con 1,5 mL de formaldehído al 2% y glutaraldehído al 0,2% en 1x PBS durante 10 min a temperatura ambiente.
    2. Después de la fijación, lave las placas con 1 ml de 1x PBS dos veces y asegúrese de que la solución fijadora se elimine correctamente. Añadir 1,5 ml de solución de tinción (40 mM de tampón de ácido cítrico/Na-fosfato, 5 mM de K4[Fe(CN)6], 5 mM de K3[Fe(CN)6], 150 mM de NaCl, 2 mM de MgCl 2, 1 mg/mL de X-gal en agua esterilizada en autoclave) e incubar durante 8 h a 37 °C sin CO2.
      NOTA: El período de incubación puede variar según el tipo de célula; para HepG2, el período de incubación no debe exceder las 8 h.
    3. Después de la tinción, lave las placas rápidamente en 1 ml de 1x PBS dos veces y capture imágenes de campo claro con un aumento de 20x y 40x con un microscopio de epifluorescencia. Capture un mínimo de cuatro o cinco campos para cada grupo de tratamiento.
      NOTA: El volumen de la solución fijadora y de tinción variará con el tamaño de la placa, y todos los pasos se pueden realizar fuera de la campana.
  3. Cuantificación de imágenes
    1. Tome una foto de un campo, cuente el número total de celdas y las celdas que muestran una señal azul. Calcule manualmente el porcentaje de celdas con una señal azul. Calcule al menos cuatro imágenes, tome el promedio, trace en un gráfico de hoja de cálculo y realice una prueba t.

4. Detección de ROS

  1. Recubrimiento celular y tratamiento farmacológico
    1. Placas de células HepG2 en placas con fondo de vidrio de 35 mm a una densidad de 40 x 104 células por placa en tres juegos: uno para lapatinib, otro para natinib y un control no tratado.
      NOTA: Los pasos de recuento y recubrimiento de celdas son los descritos en el paso 2.1.
    2. Siga la misma estrategia de tratamiento que se describe en el paso 3.1.
  2. Tinción e imágenes
    1. Después de 48 h de tratamiento, agregue 2 μM de reactivo rojo intenso ROX de celda (5 mM de material), 1 μM de Mito Tracker Green (1 mM de material) durante 30 min y contratinte con colorante de tinción nuclear Hoechst de 500 nM (500 μM de material).
      NOTA: Se debe agregar tinte dentro de la campana y se debe evitar la exposición directa a la luz. La contratinción se realiza agregando colorante de tinción nuclear Hoechst durante la administración de otros colorantes.
    2. Después de 30 min, retire el tinte y lave con 1x PBS para eliminar el exceso de tinte e imagen con un microscopio confocal con un aumento de 100x (emersión de aceite, longitud de onda de excitación de 640 nm, 488 nm y 405 nm, respectivamente).
  3. Cuantificación de imágenes
    1. Cuantifique la señal de ROX rojo celular utilizando el software Fiji ImageJ y compárela con la señal del control no tratado. Use MitoTracker verde para indicar que la señal se origina en las mitocondrias. Después de trazar los gráficos de barras con valores promedio, realice una prueba t.

5. Recolección de medios acondicionados (CM)

  1. Tratar las células HepG2 con 2,5 μM de lapatinib o neratinib durante 48 h (estrategia de tratamiento similar al paso 3.1, excepto en este experimento, colocar70 x 10 4 células en una placa de 60 mm).
  2. Después de 48 h, retire el medicamento y lave con 500 μL de 1x PBS una vez.
  3. En el día máximo de senescencia (después de 48 h de tratamiento farmacológico), agregue 4 ml de medios MEM sin suero (sin FBS ni ningún otro suplemento) a las células tratadas con el medicamento, así como al control no tratado durante 48 h.
    NOTA: El volumen de medios sin suero dependerá del tamaño de la placa.
  4. A continuación, recoja los medios sin suero que contienen todo el secretoma, denominados medios acondicionados, y guárdelos a -80 °C para su uso futuro.
    NOTA: Después de recolectar el CM, debe centrifugarse durante 5 min a 2800 g (4000 rpm) para eliminar las células muertas y otros desechos celulares. Las células RAW264.7 se cultivan típicamente en DMEM, pero CM se recolecta en MEM según las condiciones de cultivo de HepG2. Para mantener la compatibilidad, los medios acondicionados deben mezclarse con DMEM sin suero en una proporción de 1:1 antes de la incubación de RAW264.7.

6. Polarización M1 / M2 en RAW264.7

  1. Recubrimiento de celdas
    1. Siga el recuento celular y la siembra celular como se describe en el paso 2.1, excepto el paso de tripsinización. Mientras tripsiniza las células RAW264.7, agregue 600-700 μL de tripsina 0.5x, incube durante 15-20 min en la incubadora, y para neutralizar la tripsina, agregue 2 mL de medios de crecimiento (DMEM + 10% FBS) y coloque 70 x104 células en un plato de 60 mm en tres juegos: lapatinib, neratinib y un control no tratado.
  2. Inducción RAW264.7
    1. Retire el medio de cultivo regular, lave con 1 ml de 1x PBS una vez y agregue el CM correspondiente durante 48 h.
      NOTA: Antes de agregar el CM, asegúrese de acondicionarlo con DMEM sin suero en una proporción de 1: 1, ya que las células RAW264.7 crecen en DMEM, por lo que mantener las células en MEM causará estrés, lo que puede obstaculizar el resultado. El cultivo de RAW264.7 en CM (medios sin suero) durante 48 h también puede causar estrés; En ese caso, se puede hacer una incubación de 24-30 h antes de recoger los datos.
    2. Después de la incubación, deseche el CM, lave con 1 ml de 1x PBS, agregue 600 μl de tripsina en cada placa, incube durante 10 min y luego sedimente a 180 g (1000 rpm) durante 3 min a temperatura ambiente. Utilice el pellet para la purificación de proteínas o guárdelo a -80 °C para uso futuro.
      NOTA: El tiempo de tripsinización variará según el tipo de célula y no se recomienda centrifugar por encima de 180 g.
  3. Aislamiento de proteínas y western blot
    1. Prepare el tampón de lisis mezclando el tampón de lisis del ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) y el cóctel de inhibidores de proteasa en una proporción de 100:1. Agregue el tampón de lisis al gránulo celular, vuelva a suspender e incube en hielo durante 30 min.
      NOTA: El volumen del tampón de lisis variará con el tamaño de la paleta de celdas, y la lisis se puede realizar fuera de la campana. Si el pellet se almacena a -80 °C, primero descongele el pellet en hielo, dé un breve giro y elimine cualquier medio residual.
    2. Después de la incubación, centrifugar el lisado celular a 20.000 g durante 30 min a 4 °C. Recoja el sobrenadante y proceda a la transferencia occidental, o guárdelo a -20 °C para uso futuro.
    3. Preparar la muestra de proteína tomando 35-40 μg de proteína, añadir 1x colorante de carga, calentar durante 5-6 min a 95 °C, ejecutar SDS-PAGE (gel de acrilamida al 10% y al 12%) a 90 V y transferir a la membrana de nitrocelulosa.
    4. NOTA: Para obtener información más detallada sobre la transferencia occidental, consulte Joubert et al.32.
    5. Verifique la expresión de los marcadores de polarización M1 y M2, mediante el desarrollo de la transferencia utilizando un revelador de peroxidasa de rábano picante (HRP), iNOS (M1) y arginasa1 (M2), respectivamente, mediante el uso de anticuerpos anti-NOS2 y anti-ARG1.
      NOTA: La concentración de ambos anticuerpos primarios, anti-NOS2 y anti-ARG1 es de 1:1000, y el anticuerpo secundario anti-conejo es de 1:10.000.
  4. Polarización de macrófagos mediante LPS e IFN-γ
    1. Placa 70 x 104 celdas RAW264.7 en dos platos de 60 mm.
      NOTA: El procedimiento de recubrimiento es similar al paso 6.1.
    2. Después de 12-16 h, mezcle 4 μL de lipopolisacárido de 1 μg/mL (LPS, la concentración de stock es de 1 mg/mL) y 1,33 μL de interferón-γ de 33 ng/mL (IFN-γ, la concentración de stock es de 100 μg/mL) en 4 mL de medios de crecimiento (DMEM + 10% FBS) y agregue al RAW264.7 pre-sembrado, manteniendo un control no inducido.
    3. Después de 48 h, recolecte el sedimento celular mediante tripsinización, aísle la proteína, ejecute un western blot y verifique la expresión de iNOS (M1) y ARG1 (M2), respectivamente, mediante el uso de anticuerpos anti-iNOS y anti-ARG1.
      NOTA: Todos los desechos de cultivos celulares y bioquímicos deben desecharse en un contenedor de riesgo biológico, esterilizarse en autoclave adecuadamente y luego eliminarse.

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Resultados

Se realizó una serie de ensayos para evaluar el impacto de TKI lapatinib y neratinib en las células del carcinoma hepatocelular (HepG2) y sus efectos paracrinos posteriores en los macrófagos. Las células HepG2 se trataron con concentraciones variables de lapatinib o neratinib, y la viabilidad celular se midió a las 48 h utilizando el ensayo MTT (Figuras 1A, B). Sobre la base de las curvas de supervivencia, se eligió una d...

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Discusión

El presente estudio explora los efectos indirectos del tratamiento con lapatinib o neratinib sobre la polarización de los macrófagos a través de medios acondicionados recolectados de células hepáticas HepG2 tratadas con TKI. Utilizando macrófagos RAW264.7, observamos un fenotipo M2 al exponernos a los medios acondicionados, como lo indica la regulación positiva de ARG1. Morfológicamente, los macrófagos tratados mostraron una forma característica agrandada y alargada, lo que respalda aún ...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la Institución de Eminencia Shiv Nadar por el apoyo a la infraestructura. Este estudio está financiado por la subvención CRG/2022/003242 del Departamento de Ciencia y Tecnología.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Línea celular de HepG2NCCSLínea celular adherente
Línea celular RAW264.7NCCSLínea celular adherente
DMEM (Eagle Medium Modificado de Dulbacco)HimediaAT066Glucosa alta, polvo
MEM (Eagle Medium ModificadoGibco611100-053Polvo
PBS (Suero tampón de fosfato)HimediaTS1101Polvo
Solución de tripsina-EDTAHimediaTCL007Solución
FBS (Suero Bovino Fetal)HimediaRM1112Líquido
Tinte MTTHimediaTC191Polvo
LapatinibSelleckchemS2111Polvo
NeratinibCompañía Química de Caimán18404Polvo
DMSO (Dimetil Sulfóxido) HimediaTC185Solución
Formaldehído y nbsp;RankemF0080Solución
GlutaraldehídoSigma-aldrich340855Solución
Ácido cítrico monohidrato, puroHimediaGRM229Polvo
Fosfato de sodio dibásico anhidro  HimediaMB024Polvo
Ferrocianuro potásico, K4[Fe(CN)6]Fisher Scientific & nbsp;P-236-500
Ferricianuro de potasio, K3[Fe(CN)6]Fisher Scientific & nbsp;P-232-500
NaClSRL41721Polvo
MgCl2 hexahidratoHimediaGRM-1068Polvo
X-GalSRL45904Polvo
LipopolisacáridoSigma-aldrichL6529
interferón recombinante humano-γHimediaCF040-20MCG
Reactivo rojo profundo Cell ROXThermo fisher scientificC10422
HoechstInvitrogen, Thermo Fisher ScientificH3570Polvo
MitoTRACKER VerdeInvitrogen, Thermo Fisher Scientific1842298Polvo
Anticuerpo anti-ARG1AfinidadDF6657Solución, MW calculado - 35kDa, MW observado - 65kDa
Anticuerpo anti-NOS2Cloudo Clone Corp.PAA837Hu01Solución, MW calculado - 130kDa, MW observado - 65kDa
Anticuerpo anti-iNOSAfinidadSolución, MW calculada - 130kDa, MW observada - 120kDa
Anticuerpo anti-GAPDHBiobharati LifeScience Pvt.LtdBB-AB0060Solución
Anticuerpo anticonejoCompañía Química de Caimán10004301Solución
Membrana de nitrocelulosa  Merck Millipore Ltd. HATF00010 (Número de producto)
femtoLUCENTTMPLUS HRPG Biociencias  786-003
Antenas parabólicas de 60mm¡NUCK150462
Placa de 96 pozos,  ¡NUCK165306
Incubadora de cultivos celulares  Thermo Fisher Scientific371
Microscopio 1. Microscopio Invertido LEICA    2. Microscopio Confocal Nikon 1. LED DMIL & nbsp;       2. Ti2E, A1R  Ambos son números de modelo
Sistema de Imagen iBrightInvitrogen, Thermo Fisher ScientificCL1500 (número de modelo)
Lector de matrículasBio-RADLector de microplacas iMark
Centrifugadora Thermo Fisher ScientificSorvall ST 8R (número de modelo)

Referencias

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