Artículo de método

Uso de listas de genes expresados diferencialmente en humanos para realizar análisis de enriquecimiento de vías posteriores y priorización de objetivos

DOI:

10.3791/68732

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3 de octubre de 2025

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1Department of Microbiology and Molecular Biology, Brigham Young University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El trabajo actual describe un protocolo para ejecutar el algoritmo Pathway2Targets, un script R que predice y prioriza objetivos terapéuticos basados en el perfil de las vías de señalización intracelular generadas al comparar muestras de casos versus muestras de control de un experimento de secuenciación de ARN a granel.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe una canalización computacional de varios pasos para identificar posibles objetivos terapéuticos a partir de datos de secuenciación de ARN, incluida la instalación de software relevante, la verificación de la configuración y el análisis de expresión diferencial mediante edgeR. Luego mostramos cómo utilizar el algoritmo de análisis de impacto de la vía de señalización (SPIA) para predecir vías estadísticamente significativas. Para garantizar la confianza en los resultados, nos centramos en vías significativas (p < 0,05) para reducir los resultados falsos positivos. A diferencia de los conjuntos de genes tradicionales, estas vías reflejan redes de interacción proteína-proteína, ofreciendo información mecanicista sobre procesos celulares como el ciclo celular, la respuesta inmune y el metabolismo. Estas rutas se analizan utilizando el algoritmo Pathway2Targets, que interactúa con la base de datos OpenTargets.org a través de una interfaz de programación de aplicaciones (API). Este algoritmo incorpora un novedoso enfoque de ponderación que puntúa los objetivos farmacológicos conocidos dentro de las vías identificadas, al tiempo que proporciona progreso en tiempo real. El tiempo de ejecución depende de la complejidad de la ruta y la densidad del objetivo. La salida consta de dos archivos clasificados. El primer archivo contiene una lista de objetivos farmacológicos previstos y sus puntuaciones ponderadas, mientras que el segundo consta de varios detalles para las terapias asociadas. En conjunto, esta línea facilita la priorización de objetivos y tratamientos farmacológicos en el contexto de perfiles de expresión génica específicos de la enfermedad.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La secuenciación masiva de ARN permite comparar los niveles de expresión de miles de genes en una población de células de casos frente a una población de células de control. Los experimentos generalmente están diseñados para incluir al menos muestras triplicadas, idealmente réplicas biológicas, aunque las réplicas técnicas pueden ser suficientes. Este diseño tiene en cuenta la variabilidad biológica y reduce el impacto de las muestras de valores atípicos. El análisis de estos patrones de expresión proporciona una visión detallada del efecto de la enfermedad de interés en los procesos celulares normales y puede permitir potencialmente la predicción de terapias relevantes.

El preprocesamiento de datos de secuenciación de ARN masivos generalmente incluye: control de calidad de lecturas de secuenciación (para repeticiones, adaptadores de secuenciación, GC%, etc.), recorte de lectura y extracción de adaptadores, mapeo / cuantificación de lectura 1,2,3 y análisis de expresión diferencial 4,5,6. Afortunadamente, se han automatizado una variedad de procesos analíticos para reducir el trabajo manual asociado con estos pasos 7,8,9. Una vez completado el preprocesamiento, los análisis posteriores que se realizan comúnmente incluyen análisis de sobrerrepresentación funcional con ontologías genéticas, enriquecimiento de vías de señalización y variación en el empalme. Estos análisis posteriores resumen y facilitan la interpretación de los resultados de expresión diferencial a un nivel de granularidad más alto que las listas de genes por sí solas.

Se han desarrollado varias herramientas con el objetivo de reutilizar las terapias existentes para un tipo o subtipo de enfermedad bien definido. Esto se logra entrenando el algoritmo en tipos de datos ómicos múltiples para la enfermedad prevista. Desafortunadamente, tales esfuerzos para mejorar la especificidad y la sensibilidad en una enfermedad prevista a menudo hacen que el uso de las herramientas en contextos más generales no sea óptimo10,11. Otro conjunto de herramientas es más ampliamente aplicable a los casos en que los perfiles de expresión génica coinciden con las firmas existentes de expresión génica12,13 o con los efectos cuantificados de las terapias actuales14,15. Sin embargo, estas herramientas de aplicación más amplia a menudo logran una especificidad y sensibilidad reducidas en una amplia gama de enfermedades y/o fueron entrenadas con datos obsoletos.

Por el contrario, el algoritmo Pathway2Targets se ha aplicado previamente para predecir posibles objetivos terapéuticos en el linfoma de células B, la periodontitis, el cáncer de mama con estrógenos positivos, el cáncer de mama triple negativo y el virus chikungunya 16,17,18,19,20,21. Los resultados de estos estudios demuestran que esta herramienta es capaz de predecir objetivos robustos y biológicamente relevantes. Impresionantemente, Pathway2Targets predijo 392 posibles objetivos farmacológicos para el cáncer de mama triple negativo, entre los cuales 60 se probaron en ensayos clínicos; así como 828 medicamentos individuales para TBNC, con 37 en pruebas17. En el estudio de linfoma, este algoritmo predijo 915 medicamentos, 461 de los cuales están aprobados por la FDA19.

El objetivo del trabajo actual es describir un protocolo computacional que permitirá a más investigadores, que pueden beneficiarse del acceso a instrucciones más descriptivas sobre la ejecución de programas en la línea de comandos, utilizar de manera efectiva el algoritmo Pathway2Targets recientemente desarrollado (Figura 1). Pathway2Targets predice objetivos para una afección determinada mediante la combinación de datos de expresión diferencial, asociaciones gen-enfermedad, información de ensayos clínicos, datos públicos de objetivos22, información de vías y otras métricas. Es importante destacar que este algoritmo incorpora un esquema de ponderación único y personalizable, que permite a los usuarios determinar las ~20 métricas relacionadas con el objetivo que prefieren enfatizar en su análisis, como el número de asociaciones de enfermedades, el número de vías de señalización, el número de fármacos únicos, el número de terapias en cada fase de los ensayos clínicos, etc.23. Como ejemplo de caso de uso para este protocolo, volveremos a analizar un conjunto de datos de cáncer colorrectal existente24.

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Protocolo

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Los datos de secuenciación masiva de ARN analizados en este estudio se adquirieron de bases de datos disponibles públicamente (NCBI Gene Expression Omnibus and Sequence Read Archive)25,26. Como tal, los recolectores de datos originales aseguraron la recolección ética y apropiada de estas muestras de sujetos humanos informados y con consentimiento.

1. Descargue e instale el software R

  1. Instale R (versión 4.0 o posterior) haciendo clic en un vínculo adecuado de la https://cran.r-project.org/mirrors.html Comprehensive R Archive Network (CRAN) y use la opción 0-Cloud y, a continuación, siga las instrucciones adecuadas para el sistema operativo del equipo. Este proceso generalmente toma de 5 a 10 minutos.
  2. Instale R Studio (versión 2024 o posterior) desde https://posit.co/download/rstudio-desktop/ y, a continuación, siga las instrucciones de la página de descarga. La instalación de RStudio generalmente toma ~ 10 minutos.
    NOTA: La instalación de RStudio es opcional (pero muy recomendable), ya que proporciona un entorno de desarrollo integrado que simplifica la ejecución del código, ofrece resaltado de sintaxis, facilita la administración de paquetes y ayuda a los usuarios a visualizar las salidas, lo que es especialmente beneficioso para los usuarios que están menos familiarizados con R.

2. Descargue e instale scripts de R para herramientas relevantes

  1. Descargue los siguientes scripts de R necesarios desde el repositorio de GitHub https://github.com/bpickett/Pathway2Targets. Esta URL es solo de referencia.
  2. Descargue los scripts utilizando los siguientes enlaces: SPIA versión 1.0 (descargue haciendo clic en Descargar archivo sin procesar): https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/blob/main/SPIA_Code.Rmd (ID de confirmación: 60fcd46); Pathway2Targetsversión 3.1 (descargar haciendo clic en Descargar archivo sin procesar): https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/blob/main/Pathway2Targets.R (ID de confirmación: 8e4c7c8)

3. Descargue bibliotecas de R para herramientas relevantes

  1. Mientras ejecuta R (ya sea en RStudio o en una ventana de terminal), escriba los siguientes comandos para descargar e instalar las bibliotecas de R adicionales necesarias para ejecutar el software.
    1. Inicie el programa RStudio. De forma predeterminada, el panel de la consola se encuentra en la esquina inferior izquierda de RStudio. Haga clic en cualquier lugar dentro de la ventana del panel de la consola y debería aparecer un cursor de escritura en la parte inferior después del símbolo de flecha ">".
    2. Copie y pegue el siguiente comando en el área de la consola y presione la tecla Enter :
      install.packages(c("RCurl", "stringr", "jsonlite", "httr")). 
      Una vez instalado correctamente, aparecerá un mensaje de estado que dice "Los paquetes binarios descargados están en ....".
    3. Copie y pegue el siguiente comando en el área del panel de la consola y presione la tecla Intro .
      BiocManager::install(c("SummarizedExperiment", "EnrichmentBrowser", "biomaRt", "org.Hs.eg.db")).
      Una vez instalado correctamente, aparecerá un mensaje similar que dice "Los paquetes binarios descargados están en ....".
      NOTA: El primer conjunto de bibliotecas (paso 3.1.1) consta de bibliotecas R típicas, mientras que el segundo (2.1.2) consta de bibliotecas BioConductor. Como tal, los comandos deben ingresarse por separado. Las versiones adecuadas de estas bibliotecas deben descargarse automáticamente en función de la versión de R instalada en el equipo. Cada uno de estos comandos debería tardar ~5 minutos en completarse.

4. Procesamiento de archivos

  1. Descargue el archivo de salida de expresión diferencial generado por edgeR previamente calculado (en formato RDS), generado por el software ARMOR (o similar), en el equipo local. El nombre de este archivo es generalmente edgeR_dge.rds.
  2. Revise manualmente los resultados de edgeR (o una expresión diferencial similar) para comenzar la interpretación biológicamente relevante de los resultados. Para ello, filtre por, como mínimo, un valor p corregido < 0,05 y, potencialmente, el valor absoluto del valor de cambio de pliegue logarítmico2 > 1,5. Si prueba el software, puede encontrar un archivo edgeR_dge.rds de muestra en Zenodo aquí: https://doi.org/10.5281/zenodo.15186609
    NOTA: La revisión de los genes que permanecen en estos resultados filtrados puede comenzar a explicar los mecanismos moleculares subyacentes del fenotipo asociado con las muestras de casos (en comparación con las muestras de control). Es importante reconocer que la capacidad de interpretar listas de genes de manera imparcial es extremadamente difícil debido al número relativamente bajo de símbolos genéticos que se pueden recordar rápidamente. Como tal, el análisis de la vía de señalización es una forma útil de resumir los genes filtrados en función de cómo interactúan y/o se comunican entre sí en la célula.
  3. El preprocesamiento masivo de datos de secuenciación de ARN puede tardar desde varias horas hasta días de tiempo de computación, según el tamaño del conjunto de datos que se esté analizando. Guarde este archivo .rds en la carpeta Descargas del equipo. Tenga en cuenta que este tipo de archivo .rds no es legible por humanos.

5. Ejecute el algoritmo de enriquecimiento de la vía SPIA

  1. Si se ejecuta con R, use el script de R desde GitHub o el archivo de codificación complementario 1. Escriba el siguiente comando, suponiendo que el archivo edgeR_dge.rds está en la carpeta Descargas
    Rscript --vanilla SPIA_Code.Rmd ~/Downloads/edgeR_dge.rds
    1. Si el archivo edgeR_dge.rds está en una carpeta (o directorio) diferente, reemplace este comando por lo siguiente
      Rscript --vanilla SPIA_Code.Rmd
  2. Si se ejecuta con RStudio, use el script de R de GitHub o el archivo de codificación complementario 2.
    NOTA: En el lenguaje R, agregar el símbolo de etiqueta # antes de una línea de código lo deshabilita temporalmente. Los scripts se diseñaron originalmente para ejecutarse en un entorno de línea de comandos en lugar de RStudio. Habilitar o deshabilitar ciertas líneas de código es la forma más fácil de volver a configurar la configuración de los archivos de entrada.
    1. Abra el script SPIA_Code.Rmd en R Studio haciendo clic en la opción Abrir archivo en el menú Archivo y, a continuación, seleccionando el nombre del script. En la ventana de código de R Studio, de forma predeterminada, se encuentra en el panel superior izquierdo.
    2. Seleccione todas las líneas de código en el archivo y haga clic en el botón Ejecutar (o Ejecutar línea(s) seleccionada(s)), que se encuentra encima y a la derecha de la ventana de código. Una ejecución correcta producirá un archivo con un nombre similar a
      edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_2025-04-23_
      10-56-45.12767_SPIA_Results.csv
      en el directorio de descargas. Este archivo contendrá las vías de señalización estadísticamente significativas
    3. Revise el archivo con los resultados estadísticamente significativos manualmente abriéndolo como una hoja de cálculo. El contenido de este archivo debería ayudar a resumir las cascadas de señalización intracelular subyacentes que están representadas significativamente por los genes expresados diferencialmente.
      NOTA: Completar el cálculo de vías significativas puede llevar entre ~ 30 minutos y varias horas, dependiendo de la intensidad de la señal en el conjunto de datos que se está analizando. Cuando el programa se está ejecutando, los mensajes de progreso en tiempo real se actualizarán continuamente en la ventana de la consola. Los mensajes que se actualizan con frecuencia muestran que el programa está funcionando correctamente. Se pueden encontrar descripciones más detalladas de lo que ocurre en este paso en el repositorio de GitHub: https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/tree/main
    4. Si usa el archivo de entrada de muestra, el archivo de salida de este paso se encontrará en la carpeta Descargas y se llamará
      edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_"timestamp"_SPIA_Results.csv.
      Este estilo de nomenclatura refleja el nombre del archivo de entrada, el proceso que se está realizando y la salida. Esto evita confusiones en la identificación de archivos si se procesa más de uno.
    5. Ajuste otros parámetros como se describe a continuación.
      1. Los parámetros predeterminados para el algoritmo SPIA en esta biblioteca son 1.000 permutaciones. Aumente esto a 2,000 permutaciones para mejorar la confianza en los resultados. Ajuste el número de permutaciones en las líneas 84 y 85 de este script cambiando la perm = 2000 al número deseado de permutaciones. Ajuste otros parámetros como se describe a continuación.
      2. Ajuste el enfoque de corrección del valor p en las líneas 84 y 85 eliminando padj.method = 'BH'. Esto no corregirá los valores p, lo que puede hacer que los resultados falsos positivos sean más probables.

6. Ejecución del algoritmo de priorización de objetivos Pathway2Targets en la salida de SPIA

  1. Si ejecuta R, use el script de R de GitHub o el archivo de codificación complementario 3. Utilice el siguiente comando para invocar este algoritmo
    Rscript --vanilla Pathway2Targets.R
  2. Si se ejecuta con R Studio, use el script de R de GitHub o el archivo de codificación complementario 4. Para abrir el script Pathway2Targets.R en R Studio, haga clic en la opción Abrir archivo del menú Archivo y, a continuación, seleccione el nombre del script.
    1. En la ventana de código RStudio (panel superior izquierdo), reemplace el nombre de archivo de la línea 22 por el nombre del archivo de resultados de SPIA, como (de los datos de ejemplo)
      infile <- "edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_2025-04-23_
      10-56-45.12767_SPIA_Results.csv"
    2. Seleccione todas las líneas de código del archivo y haga clic en el botón Ejecutar , que se encuentra encima y hacia el lado derecho de la ventana de código. Los mensajes de estado de progreso en tiempo real se mostrarán continuamente en el panel inferior derecho. Una ejecución exitosa producirá un archivo llamado (similar a)
      "edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_2025-04-23_
      10-56-45.12767_SPIA_Results.csv-RankedTargets.tsv"       en el directorio de descargas. El estilo de nomenclatura de los archivos refleja la entrada, el proceso y la salida
      edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_2025-04-23
      _10-56-45.12767_SPIA_Results.csv
      es la entrada de dicho archivo.
      NOTA: Este paso puede durar de una a varias horas, dependiendo del número de vías de señalización con un valor p significativo, el número de productos génicos en esas vías significativas y el número de productos génicos que son dianas farmacológicas conocidas.
  3. Se pueden ajustar algunos parámetros para el algoritmo Pathway2Targets. En concreto, ajuste los valores del multiplicador (líneas 31-38 del script) para personalizar el esquema de ponderación de cada métrica. Se pueden encontrar descripciones más detalladas de lo que ocurre en este paso en el repositorio de GitHub correspondiente: https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/tree/main
    NOTA: Como referencia, en el ejemplo, la identificación de fármacos potenciales de 132 vías, que constan de cientos de dianas individuales, tarda aproximadamente 2 h en completarse. Con base en esta métrica, es razonable estimar el tiempo total de computación.

7. Abra archivos de resultados para objetivos y terapias priorizados

  1. Se generará el archivo con los objetivos priorizados y sus métricas. Para los archivos de entrada de ejemplo, use el archivo de salida que se encuentra en la carpeta Descargas, denominado:
    edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_"timestamp"_SPIA_Results.csv-RankedTargets.tsv
    1. Este archivo, de forma predeterminada, se ordenará con los destinos ordenados en orden descendente según la métrica ponderada personalizada. Revise manualmente el archivo de salida para asegurarse de que los resultados sean biológicamente relevantes y que los objetivos sean lógicos para el fenotipo que se está evaluando.
  2. También se generará el archivo con las terapias priorizadas y sus métricas. Para los archivos de entrada de ejemplo, use el archivo de salida de la carpeta Descargas, denominado:
    edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_"timestamp"_SPIA_Results.csv-Treatments.tsv
    1. Del mismo modo, este archivo de salida también se ordenará, de forma predeterminada, con las terapias para los distintos objetivos (en el paso 7.1.1) ordenadas en orden descendente según la métrica ponderada. Revise el archivo manualmente con suficiente conocimiento previo del sistema biológico subyacente para determinar si se justifican experimentos adicionales. Se espera que múltiples terapias puedan tener la misma métrica ponderada, ya que muchos de los objetivos se verán afectados por más de una terapéutica en el mercado.

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Resultados

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La configuración descrita en los pasos 1-3 del protocolo es necesaria para permitir la ejecución posterior de SPIA y el algoritmo Pathway2Targets. Al final de cada paso, se generará un mensaje para confirmar la instalación exitosa del software. El paso 4 consiste en descargar un conjunto existente de resultados de expresión diferencial, que podría incluir el archivo de ejemplo proporcionado, un archivo existente diferente o preprocesar un conjunto de datos de secuenciación de ARN persona...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los pasos 1 a 3 del protocolo se refieren específicamente a la instalación del software de R, los scripts y las dependencias subyacentes para ejecutar correctamente el software de nivel inferior. Hay disponible una lista detallada de las bibliotecas de R necesarias (Tabla complementaria 4). El paso 4 del protocolo implica recuperar un archivo de datos de R (formato .rds), que contiene la salida de un análisis de expresión diferencial. El software común para este paso inv...

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Divulgaciones

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BEP tiene acciones en Pythia Biosciences. No se obtuvo financiación externa para el trabajo actual.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a la Oficina de Computación de Investigación de la Universidad Brigham Young por su experiencia y apoyo al acceder al entorno informático de alto rendimiento del campus.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Script R de Pathway2TargetsUniversidad Brigham Young (Laboratorio Pickett)Versión 3.1https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/blob/main/Pathway2Targets.R
R SoftwareRed Integral de Archivos R (CRAN)Versión: 4.4.3https://cran.r-project.org
Software de escritorio R StudioPostularVersión: 2024.12.1+563https://posit.co/download/rstudio-desktop/
Script SPIA RUniversidad Brigham Young (Laboratorio Pickett)Versión: 3.1https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/blob/main/SPIA_Code.Rmd

Referencias

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Etiquetas

Differential Gene ExpressionRNA SequencingSPIA AlgorithmPathway2TargetsDrug Target PredictionProtein Interaction NetworksTherapeutic Target IdentificationDisease Gene Profiles

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