Monitoreo de la absorción y localización de compuestos orgánicos en tejidos vegetales mediante un ensayo hidropónico de radiomarcado con 14C e imágenes de fósforo

Resumen

Este artículo describe un método para estudiar la remediación mediada por plantas utilizando contaminantes orgánicos marcados con ¹⁴C. Describe la preparación hidropónica de la planta, la absorción de radiomarcadores y las imágenes de fósforo para rastrear la absorción, translocación y metabolismo de contaminantes. La técnica ofrece una herramienta valiosa para evaluar el potencial de fitorremediación en varias especies de plantas y contaminantes ambientales.

Resumen

La fitorremediación, el uso de plantas para mitigar los contaminantes ambientales, ofrece un enfoque sostenible y rentable para limpiar sitios contaminados. El desarrollo de métodos que ayuden a dilucidar los mecanismos detrás de la absorción y el metabolismo de los contaminantes por parte de las plantas es crucial para mejorar las prácticas de fitorremediación. Este artículo describe un método para evaluar la absorción y transformación de contaminantes orgánicos por parte de las plantas que utilizan compuestos radiomarcados. ¹⁴Los compuestos orgánicos marcados con C, como los ácidos C-nafténicos modelo ¹⁴, se utilizan para rastrear su absorción, translocación, localización y metabolismo en los tejidos vegetales. Anteriormente hemos utilizado este método con múltiples especies de plantas, incluidas Elymus trachycaulus y Salix interior. Estas observaciones se corroboran aquí con la planta modelo, Arabidopsis thaliana, cultivada hidropónicamente en soluciones Hoagland modificadas. La captación de radiomarcadores se monitoreó mediante recuento de centelleo líquido e imágenes de fósforo, lo que permite la visualización y cuantificación de compuestos radiomarcados dentro de los tejidos vegetales. Este método detalla la preparación de materiales vegetales, el uso de compuestos radiomarcados y el proceso de análisis de la distribución y el destino de los contaminantes dentro de las plantas. El método también incluye estrategias para evaluar la exudación de compuestos y permite evaluar tanto la absorción de la planta como la translocación de contaminantes ambientales. Este enfoque proporciona información sobre los procesos de remediación mediados por plantas y se puede aplicar al estudio de una amplia gama de contaminantes ambientales y especies de plantas.

Introducción

La biorremediación es una tecnología de remediación mediada por entidades biológicas, como plantas y microorganismos. La fitorremediación, que utiliza plantas o productos vegetales para eliminar contaminantes del medio ambiente, puede complementar o servir como una alternativa a la remediación basada en microbios, superando algunas de las limitaciones del uso de microorganismos solos 1,2,3,4. La fitorremediación es rentable debido a los procesos de las plantas impulsados por el sol, donde los contaminantes se absorben a través de sus raíces o brotes y se transportan entre células y tejidos donde pueden metabolizarse, secuestrarse o volatilizarse⁵. Las plantas más efectivas para la fitorremediación suelen ser especies resistentes y tolerantes al estrés con altas tasas de transpiración, rápida producción de biomasa y sistemas de raíces profundas, como los que se encuentran en los géneros Populus y Salix ⁶. Como organismos sésiles, las plantas han desarrollado diversas vías metabólicas para manejar compuestos tóxicos en su entorno¹. Esto les dota de una amplia gama de genes y procesos bioquímicos que mejoran su capacidad para manejar contaminantes.

El marco de fitodegradación, propuesto por primera vez por Sandermann et al. (1977)⁷, describe un proceso de tres fases para la desintoxicación de contaminantes mediada por plantas: transformación, conjugación y compartimentación. En cada fase, los contaminantes sufren modificaciones enzimáticas que aumentan su hidrofilia, reducen su toxicidad y los hacen más susceptibles al secuestro o mineralización adicional⁴. Sin embargo, debido a que las plantas dependen principalmente del dióxido de carbono atmosférico para la fijación de carbono, su capacidad para mineralizar completamente los contaminantes orgánicos es potencialmente limitada. En cambio, los contaminantes pueden secuestrarse en vacuolas o paredes celulares (fitosecuestro) o volatilizarse en la atmósfera (fitovolatilización)¹.

Un desafío clave en la investigación de fitorremediación es detectar si las plantas pueden absorber y transformar contaminantes orgánicos de su entorno¹. Los métodos de detección tradicionales a menudo no rastrean con precisión las vías de absorción y translocación de contaminantes, lo que dificulta la evaluación de la capacidad de una planta para remediar contaminantes específicos ^1,5. Los compuestos orgánicos de carbono-14 (¹⁴C) radiomarcados ofrecen una poderosa solución a este problema. Al exponer las plantas a ¹⁴contaminantes marcados con C, los investigadores pueden rastrear la incorporación de carbono radiomarcado en los tejidos vegetales, proporcionando información precisa sobre la absorción, translocación y transformación del contaminante. Esta técnica permite identificar especies vegetales capaces de remediar contaminantes orgánicos específicos y ofrece una forma fiable de evaluar las vías fisiológicas implicadas. En última instancia, el uso de compuestos marcados con ¹⁴C avanza en nuestra comprensión del potencial de fitorremediación, apoyando el desarrollo de estrategias más efectivas y específicas para la remediación ambiental.

Este artículo describe un método que utiliza ¹⁴contaminantes orgánicos radiomarcados con C para monitorear la absorción, translocación y destino de estos contaminantes de una solución hidropónica por parte de las plantas. Una publicación reciente ha descrito un método similar para rastrear el destino de ¹⁴herbicidas marcados con C tras la aplicación foliar⁸. Sin embargo, el método descrito aquí describe cómo evaluar la eliminación y translocación de contaminantes radiomarcados de la solución hidropónica, con comentarios sobre cómo adaptar este método al uso del suelo.

Protocolo

NOTA: Antes de continuar con este protocolo, es importante consultar las directrices y reglamentos institucionales y nacionales pertinentes sobre seguridad de radioisótopos. En resumen, manipule todo el material radiactivo, o cualquier cosa que pueda haber estado en contacto con radioisótopos, mientras usa guantes dobles, una bata de laboratorio y gafas de seguridad. El procedimiento se realizó en un espacio dedicado en el laboratorio con cinta adhesiva para marcar secciones que contienen radioisótopos. Además, después de todos los procedimientos, limpie la cristalería y los instrumentos inmediatamente, luego limpie y pruebe la presencia de radioisótopos contaminantes a través de recuentos de centelleo. Todos los materiales y líquidos utilizados en estos ensayos también se eliminaron en contenedores dedicados a desechos radiactivos y se eliminaron adecuadamente siguiendo las pautas de la Universidad de Calgary y la Comisión Canadiense de Seguridad Nuclear.

1. Preparación de la solución de Hoagland

1. Prepare una solución de Hoagland 0,5x (concentración media) a partir de una mezcla comercial o haga el medio desde cero, que consta de 0,5 mM NH₄H₂PO₄, 3 mM KNO₃, 2 mM Ca(NO₃)₂, 1 mM MgSO₄, 23 μM H₃BO₃, 5 μM MnCl₂•4H₂O, 400 nM ZnSO₄•7H₂O, 200 nM CuSO₄•5H₂O, 70 nM H₂MnO₄•1H₂O, 45 μM FeSO₄•7H₂O.
2. Añadir MES u otro tampón adecuado para lograr una concentración final de 10 mM.
3. Ajuste el pH al valor deseado (aquí, el pH era 5.0).

2. Preparación de la solución de radiomarcaje

1. Transfiera el volumen requerido de solución Hoagland 0,5x (50 ml por réplica) a un matraz limpio.
2. Agregue 0,1-0,26 kBq / ml del compuesto radiomarcado a la solución de Hoagland.
   NOTA: En este estudio, se utilizó ¹⁴C-AdCA (ácido adamantano-1-carboxílico) disuelto en metanol.
3. Mezclar bien agitando el matraz durante 2-3 min.
4. Alícuota de 50 ml de la solución de radiomarcaje en matraces Erlenmeyer de 125 ml para cada réplica.

3. Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.) Preparación de la planta

NOTA: El protocolo para el cultivo hidropónico de Arabidopsis thaliana se detalla en Conn et al. (2013)⁹.

1. Para cada planta, retire una tapa de un tubo de microfuga estándar de 1,7 ml con unas tijeras y perfore un orificio de 3 mm de diámetro en el centro de la tapa con una perforadora de cuero.
2. Selle temporalmente la parte superior de las tapas con cinta adhesiva y llénelas con medios Hoagland fundidos 0.5x que contengan agar al 0.8%, luego colóquelas en la tapa de una caja de puntas modificada (el tanque de germinación) (Figura 1A).
3. Esterilice la superficie de las semillas de Arabidopsis mediante lavados consecutivos en etanol al 70% durante 10 min, luego 5 min, y séquelas en la campana de flujo sobre papel de filtro estéril.
4. Siembre las semillas en el medio de agar a través del orificio perforado en la parte superior de la tapa de la microcentrífuga.
5. Estratificar las semillas en la rejilla de la punta a 4 °C durante 2-4 días.
6. Mueva el tanque de germinación a una cámara de crecimiento en condiciones de días largos (16 h de luz, 8 h de oscuridad a ~ 150 μmol / m,²s de luz y 22 ° C).
7. Llene las gradillas de puntas con una solución Hoagland 0,5x.
   NOTA: Asegúrese de que la solución toque el agar para evitar que se seque.
8. Cultive plantas durante 2-3 semanas, rellenando la solución según sea necesario (cada 3-4 días) para que el agar permanezca en contacto con la solución hidropónica.
9. Trasplante las tapas y las plántulas en una abertura de 10 mm de diámetro, corte el centro de una tapa de tubo Falcon de 50 ml con un taladro y una broca (Figura 1B).
10. Taladre 12 agujeros en la tapa de plástico de 10 L con una broca de 30 mm de diámetro (el tanque de maduración).
11. Coloque las tapas de los tubos Falcon sobre las aberturas en la parte superior de la bolsa para que las raíces pasen a la bolsa de abajo.
12. Coloque las piedras de aire en el fondo del tanque de maduración y llénelas con una solución de Hoagland hasta que las raíces estén casi sumergidas.
13. Regrese las plantas a la cámara de crecimiento y crezca durante otras 6-8 semanas (16 h de luz, 8 h de oscuridad a ~150 μmol/m,²s de luz y 22 °C), hasta que las rosetas tengan aproximadamente 10 cm de diámetro.

Figura 1: Tanques hidropónicos de germinación y maduración de Arabidopsis y el recipiente de tratamiento ¹⁴C-AdCA. (A) El tanque de germinación utilizado para germinar semillas de Arabidopsis para el crecimiento hidropónico. (B) Plantas de Arabidopsis en el tanque de maduración listas para experimentación. (C) Una planta de Arabidopsis con raíces sumergidas en la solución ^{de 14}C-AdCA durante la experimentación. Los matraces de 50 ml (el recipiente de tratamiento de ¹⁴°C) normalmente se cubren con papel de aluminio (no se muestra) durante la exposición para evitar el crecimiento de algas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Junco báltico (Juncus balticus Willd. ) preparación de la planta

1. Estratificar las semillas entre dos trozos húmedos de papel de filtro en una placa de Petri a 4 °C durante 1-2 semanas.
2. Retire el papel de filtro superior y coloque el plato en una cámara de crecimiento en condiciones de días largos (16 h de luz, 8 h de oscuridad a ~150 μmol/m,²s de luz y 22 °C) durante 1 semana.
3. Trasplante las plántulas en gradillas de puntas modificadas como se describe para Arabidopsis (paso 3.1-3.4).
4. Cultive las plantas durante 2-3 semanas (16 h de luz, 8 h de oscuridad a ~150 μmol/m,²s de luz y 22 °C), o hasta que las raíces alcancen los 3-4 cm de longitud.
5. Trasplante las plantas a un contenedor modificado de 10 L con piedras de aire, llénelo con solución Hoagland hasta que las raíces estén casi sumergidas y crezca durante 6-8 semanas adicionales (16 h de luz, 8 h de oscuridad a ~ 150 μmol / m²s de luz y 22 ° C).

5. Preparación de plántulas de sauce de banco de arena (Salix interior Rowlee)

NOTA: El protocolo para el cultivo de plántulas de sauce Sandbar se describe en Alberts et al. (2021)¹⁰.

1. Cortar esquejes de tallo de 10 cm (5 mm de diámetro) y sumergirlos durante la noche a temperatura ambiente en diH₂O para hidratar y estimular el enraizamiento.
2. Transfiera los esquejes hidratados a tanques hidropónicos aireados con 10 L de solución Hoagland 0,5x y déjelos crecer durante 1 mes (16 h claro, 8 h oscuro a ~150 μmol/m,²s de luz y 22 °C) para establecer el crecimiento de raíces y brotes.
   NOTA: Refresque la solución Hoagland cada 2 semanas para evitar la deficiencia de nutrientes durante el desarrollo de las plántulas.

6. Etiquetado de radioisótopos

1. Después de preparar la solución de radiomarcado, recoja una alícuota de 100 μL de la solución para el recuento de centelleo líquido para determinar la concentración inicial de isótopos.
2. Seque suavemente las raíces de las plantas y transfiera el conjunto de tapones de tubo Falcon a matraces Erlenmeyer de 125 ml (el recipiente de tratamiento de ¹⁴C) que contienen una solución de Hoagland 0,5x con los compuestos orgánicos marcados con ¹⁴C del paso 2.4.
3. Marque el nivel de solución en el matraz para asegurarse de que se pueda rellenar hasta el volumen inicial durante el experimento, teniendo en cuenta la evapotranspiración.
4. Envuelva los matraces en papel de aluminio y agite a 40-60 rpm bajo luces de cultivo durante la duración del ensayo o hasta que las plantas marcadas se transfieran a una solución Hoagland 0.5x sin radiomarcado durante un período de persecución.
5. Rellene el volumen en el matraz cada 1-2 h hasta la línea realizada en el paso 6.3 con la solución de Hoagland sin el radiomarcado antes de recoger alícuotas de 100 μL. Asegúrese de medir el volumen de Hoagland agregado a cada matraz para comparar la tasa de evapotranspiración de cada solución. Después de las primeras 6-8 h, los tiempos de muestreo pueden aumentar a cada 12-24 h.
   NOTA: Este paso puede durar días si es necesario, pero asegúrese de monitorear la radiactividad en las alícuotas diariamente a medida que avanza el experimento.
6. Opcional: Para controlar la exudación durante el período de persecución, transfiera la planta y el conjunto de la tapa del tubo Falcon a un matraz con 50 ml de solución fresca de Hoagland (que no contenga un compuesto marcado con ¹⁴C) y retire una alícuota de 100 μl cada 2 h durante las primeras 6-8 h, luego a intervalos de 24 h desde el inicio del experimento.
   NOTA: Para distinguir entre la exudación pasiva difusa y la exudación activa del compuesto fuera de las raíces de las plantas, se puede agregar un inhibidor del transporte activo como la ciclosporina A a una concentración de 20 μM.
7. Mida los recuentos radiactivos de cada alícuota recolectada entre los pasos 6.1-6.6 usando un contador de centelleo líquido.

7. Imágenes de fósforo de plantas

1. Enjuague las raíces durante 15 min en una solución de Hoagland 0,5x sin el radiomarcado para eliminar el radioisótopo suelto.
2. Recoja 100 μL de la solución de enjuague para los recuentos de centelleo líquido.
3. Pese las plantas o el material vegetal no leñoso para determinar la masa fresca.
4. Seque el material vegetal con un secador de gel sobre un trozo de papel de filtro etiquetado a 50 °C al vacío durante 2 h, luego déjelo secar durante la noche a temperatura ambiente.
   NOTA: Una vez secas, las plantas se pueden almacenar durante períodos prolongados (4-6 meses) y las imágenes pueden ocurrir en una fecha posterior con una caída mínima en la señal radiactiva.
5. Limpie la pantalla de fósforo exponiéndola a mucha luz en un borrador de fósforo durante 15 min.
6. Dispense de 2 a 10 μl de solución radiomarcada con radiactividad conocida en un trozo de papel de filtro y deje que se seque a temperatura ambiente durante la noche.
   NOTA: Aquí se utilizan los estándares con las radiactividades: 67, 33, 17, 8, 4 y 2 Bq, pero esto se puede cambiar para adaptarse a las intensidades de señal de las muestras de la planta.
7. Coloque la pantalla de fósforo encima de las muestras de plantas secas y los patrones radiactivos en la oscuridad o en un recipiente opaco cerrado y expóngalos durante al menos 24 h.
   NOTA: Si la imagen está subexpuesta o sobreexpuesta, ajuste el tiempo de exposición en consecuencia.
8. Visualice las pantallas con un sistema de imágenes de fósforo de escaneo láser a una resolución de 50 μm.
9. Analice las intensidades y distribuciones de la señal de la imagen de fósforo utilizando el software ImageJ¹¹.
   1. Pasos de ImageJ: Abra la imagen seleccionando Archivo > Analizar > Establecer mediciones... Seleccione Área y Valor de gris medio > Aceptar. Elija la herramienta de selección de forma que mejor se adapte al tejido. Haga clic y arrastre en la imagen para resaltar el área de interés. Presione Ctrl + M. Copie el área y el valor de gris medio en una hoja de cálculo.
10. Convierta los valores grises medios a Bq utilizando los estándares radiactivos en una curva estándar.
11. Calcule la actividad total en el tejido vegetal (densidades integradas) con la siguiente ecuación:
    Densidad integrada (Bq) = (Bq media del tejido (Bq/cm²) - Fondo (Bq/cm²)) * Área (cm²)
    1. Opcional: Convierta la imagen en escala de grises a una escala de intensidad de color utilizando el software ImageJ¹¹.

Resultados

El procedimiento de absorción de ^{la etiqueta 14}C es aplicable a una variedad de especies de plantas más allá de Arabidopsis, incluidas Salix interior, Elymus trachycaulus (Enlace) Gould ex Shinners y especies de humedales como Juncus balticus ^10,12. Sin embargo, con fines representativos, presentamos resultados del ecotipo Columbia-7 (Col-7) de Arabidopsis. Anteriormente, demostramos que los c...

Discusión

La fitorremediación ha ganado atención en las últimas décadas como un método pasivo, económico y respetuoso con el medio ambiente para limpiar desechos industriales y sitios contaminados¹. La identificación de especies de plantas con mayor absorción de contaminantes y la comprensión de los procesos moleculares que rigen la absorción de moléculas orgánicas podría mejorar las estrategias de fitorremediación. A diferencia de otros métodos indirectos, la captación de ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Mezcla de sal basal modificada Hoagland	Laboratorios de Fitotecnología	H353	Contiene sulfato ferroso
Agar-agar	BioShop	AGR001
MES (ácido 2-(N-morfolino) etano sulfónico)	BioShop	MES555
Medidor de pH	Mettler Toledo	CincoFácil
Metanol	BioShop	MET302
Ácido carboxílico 12C-Adamantane	Sigma Aldrich	106399
Ácido carboxílico 14C-Adamantane	ViTrax		Síntesis personalizada
Matraces Erlenmeyer de 125 ml	VWR	30623-174
Tubos Falcon de 50 ml	VWR	CA21008-940
Tubos microcentífugos	VWR	87003-294
Cámaras de crecimiento de plantas	Conviron
Cajas de consejos	DiaMed	DIATEC530-8376
Bolso Tote Rubbermaid Roughneck de 3 Gales	Amazona	B0B3345MYH
Papel de filtro	VWR	CA28320-020
Placa de Petri	VWR	11019-566
Coctelera con soportes para matraces	Forma Científica	Modelo 4516
Cóctel de centelleo	Investigación Productos Internacional	111195
Viales de centelleo	VWR	10014-296
Contador de centelleo	Beckman Coulter	LS 6000IC	Los viales utilizados dependerán de su contador de centelleo
Secador de gel	Bio-Rad	Modelo 583
Generador de imágenes de fósforo de escaneo láser	Bio-Rad	Generador de imágenes moleculares FX