Artículo de método

Reprogramación intratable in vivo de células tumorales a células dendríticas convencionales tipo 1

DOI:

10.3791/68739

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1 de agosto de 2025

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1Molecular Medicine and Gene Therapy, Science for Life Laboratory, Lund Stem Cell Centre, Lund University, 2Wallenberg Centre for Molecular Medicine, Lund University, 3Centre for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Este protocolo describe la reprogramación in vivo de células cancerosas de ratón en células dendríticas tipo 1 dentro del microambiente tumoral a través de la expresión forzada de los factores de transcripción PU.1, IRF8 y BATF3.

Resumen

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La eficacia de la inmunoterapia contra el cáncer se basa en el reclutamiento y la activación de respuestas de células T citotóxicas contra tumores sólidos por células dendríticas convencionales tipo 1 (cDC1). Sin embargo, la generación de cDC1 para la inmunoterapia contra el cáncer enfrenta limitaciones significativas, incluido el bajo rendimiento celular, la heterogeneidad funcional y la susceptibilidad a la inmunosupresión en el microambiente tumoral (TME). Recientemente desarrollamos una modalidad de inmunoterapia basada en la reprogramación in vivo de células cancerosas en células inmunogénicas similares a cDC1, lo que permitió a las células cancerosas presentar antígenos tumorales como cDC1 y provocó respuestas de células T citotóxicas policlonales e inmunidad antitumoral sistémica duradera. Aquí, describimos un protocolo manejable para generar células similares a cDC1 dentro del TME mediante la sobreexpresión de la red reguladora de genes específica de cDC1 mínima: PU.1, IRF8 y BATF3 (denominados colectivamente PIB), en células cancerosas, seguido de la implantación subcutánea de una mezcla de células transducidas y parentales. La sobreexpresión de PIB impulsa la adquisición gradual del marcador hematopoyético CD45 y el complejo de presentación de antígenos profesional MHC clase II en células tumorales, sirviendo como lecturas de la superficie celular para la reprogramación in vivo de cDC1. En comparación con el proceso de reprogramación in vitro, la reprogramación del modelo de melanoma de ratón YUMM1.7 in vivo demostró una cinética más rápida y una mayor eficiencia. Las células similares a cDC1 indujeron una rápida remodelación del TME al reclutar células inmunes del huésped dentro de los primeros 3 días y conducir a la formación de una estructura linfoide terciaria en el día 9. Las células reprogramadas similares a cDC1 persistieron en los tumores durante al menos 9 días, pero no se detectaron en el día 15. El protocolo de reprogramación in vivo cDC1 descrito aquí proporciona un método manejable y robusto para transformar eficazmente los tumores "inmune-fríos" en "inmune-calientes". En general, ofrece una plataforma poderosa para estudiar los mecanismos subyacentes a la inmunidad antitumoral mediada por cDC1 y descubrir combinaciones sinérgicas con otras modalidades de inmunoterapia contra el cáncer.

Introducción

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Los avances recientes en las modalidades de inmunoterapia contra el cáncer, incluido el bloqueo de puntos de control inmunitario (ICB), la terapia celular adoptiva (ACT) y las vacunas, han cambiado el panorama del tratamiento del cáncer1. En el melanoma, las tasas de respuesta a la inhibición de la proteína 1 de muerte celular programada (PD-1) y la proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) pueden alcanzar hasta el 60%2. Sin embargo, más del 40% de los pacientes con melanoma no responden al ICB, y las tasas de respuesta en cánceres menos inmunogénicos, como el cáncer de mama, el cáncer colorrectal estable a microsatélites y el glioblastoma, permanecen por debajo del 5%, lo que destaca las brechas clínicas 3,4,5. Una barrera importante para el éxito clínico general es la pobre activación de las respuestas de las células T citotóxicas, que dependen de la presentación eficiente del antígeno dentro del microambiente tumoral (TME)6.

Las células dendríticas tipo 1 convencionales (cDC1) son raras, pero indispensables para el inicio de la inmunidad específica del tumor, ya que ofrecen tres señales clave para preparar las respuestas de las células T: (1) procesamiento profesional y presentación de antígenos en los principales complejos de histocompatibilidad (MHC) de clase I y II, (2) coestimulación a través de CD80 y CD86, y (3) señalización de citoquinas proinflamatorias, incluida la IL-12 7,8. Entre los subconjuntos de células dendríticas (DC), las cDC1 sobresalen en la presentación cruzada de antígenos asociados a células tumorales para preparar células T CD8+ vírgenes o reactivar la memoria o impulsar la diferenciación de células T CD4+ a células T auxiliares tipo 1 (TH1)9. Además, los cDC1 son los principales productores de quimiocinas, ligandos de quimiocinas con motivo C-X-C 9 y 10 (CXCL9/10), que median el reclutamiento de células T al tejido tumoral 10,11,12,13. En los últimos años, numerosos estudios han puesto de manifiesto que el rechazo tumoral y las respuestas efectivas a ICB o ACT se correlacionan fuertemente con la presencia de cDC1 intratumorales12,13. Por lo tanto, los cDC1 se han desarrollado como un objetivo atractivo para la inmunoterapia contra el cáncer y aprovechar con éxito sus características únicas puede tener un potencial traslacional significativo.

Los métodos actuales para generar cDC1 se basan en el aislamiento o diferenciación de sangre de progenitores CD34+ o células madre pluripotentes 14,15,16. Las estrategias clínicas predominantes se basan en aislar una mezcla de subconjuntos de DC autólogos de la sangre y estimularlos ex vivo con agonistas del receptor tipo toll o citocinas proinflamatorias para inducir un programa inmunológico maduro antes de la reinfusión16. Sin embargo, estas estrategias están limitadas por la maduración celular deficiente, las barreras inmunosupresoras en el TME y la heterogeneidad de subconjuntos en la mezcla de CD infundida, donde solo está presente una pequeña proporción de cDC17. Además, aislar solo cDC1 para inmunoterapia o vacunación contra el cáncer es un desafío debido a su abundancia extremadamente baja en sangre periférica (<0,3%)16. Además, los cDC1 se pueden producir a partir de células progenitoras CD34+ o células madre pluripotentes inducidas utilizando citocinas y señalización NOTCH. Sin embargo, estos métodos requieren protocolos complejos y largos y producen números bajos y poblaciones heterogéneas de los subconjuntos de DC 17,18,19.

Para abordar estas limitaciones, la reprogramación in vivo proporciona una estrategia adecuada para que la inmunoterapia contra el cáncer genere células similares a cDC1, que se asemejan a las propiedades fenotípicas, transcripcionales y funcionales de cDC120. A través de la sobreexpresión de la red reguladora mínima de genes específica de cDC1 (PU.1, IRF8 y BATF3 (denominados colectivamente PIB), los fibroblastos, las células estromales y las células cancerosas se han reprogramado gradualmente en células similares a cDC1, lo que permite el procesamiento y la presentación de antígenos tumorales en MHC clase I y II, señalización coestimulatoria a través de CD80 y CD86, y secreción de citoquinas / quimiocinas, incluidas CXCL9 / 10 e IL-1220, 21,22,23. La reprogramación de cDC1 progresó de manera más rápida y eficiente a través de xenoinjertos humanos in vivo e independientemente de la inmunosupresión, generando células similares a cDC1 con una firma inmunogénica madura20. En los tumores de melanoma singénicos, observamos que las células similares a cDC1 remodelaron su TME, indujeron la formación de estructura linfoide terciaria (TLS) y reclutaron y expandieron células TH1 policlonales y T de memoria citotóxica, lo que condujo a la inmunidad sistémica a largo plazo20. Finalmente, desarrollamos una nueva modalidad de inmunoterapia contra el cáncer basada en la reprogramación in situ de células cancerosas en células similares a cDC1 mediante inyección intratumoral de vectores adenovirales20. Estos hallazgos allanan el camino para la traducción clínica de la reprogramación de cDC1 como una nueva modalidad de inmunoterapia contra el cáncer que puede aprovechar las propiedades funcionales de los cDC1.

Aquí, presentamos un protocolo manejable para generar células similares a cDC1 dentro del TME basado en la reprogramación de cDC1 in vivo . La administración lentiviral de PIB a las células cancerosas y su posterior implantación como una mezcla definida de células cancerosas transducidas con células cancerosas parentales no transducidas permite la reprogramación in vivo de una fracción controlada de células cancerosas dentro del TME. Además, este método no está limitado por la eficiencia de entrega in situ de vectores virales20. Describimos los pasos para la producción eficiente de vectores lentivirales, la titulación funcional y la reprogramación in vivo de cDC1 utilizando el modelo de melanoma singénico, YUMM1.7, como ejemplo. Detallamos la configuración experimental y la estrategia de activación para analizar células similares a cDC1 reprogramadas in vivo mediante citometría de flujo después de la disociación tumoral. También proporcionamos los pasos para evaluar los cambios en el TME mediante la realización de criopreservación, corte y tinción de inmunofluorescencia de secciones tumorales, seguida de microscopía confocal. Finalmente, abordamos cómo monitorear la inmunidad inducida por cDC1 midiendo el crecimiento y la supervivencia del tumor. Este enfoque manejable y escalable ofrece a los investigadores una herramienta valiosa para evaluar estrategias de tratamiento combinatorio con reprogramación in vivo de cDC1, para caracterizar cambios en la neogénesis de TME y TLS en modelos de cáncer o realizar grandes pantallas que modifican la expresión de varias vías inmunitarias, por ejemplo, la presentación de antígenos o la secreción de citoquinas / quimiocinas, y desentrañar su impacto en la inmunidad antitumoral.

Protocolo

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Los procedimientos experimentales con animales se realizaron de acuerdo con las regulaciones suecas después de la aprobación de la Junta de Agricultura de Suecia.

1. Preparación de reactivos

  1. Para preparar el medio completo modificado Eagle's medium (DMEM) de Dulbecco, agregue 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS), 1 mM de piruvato de sodio, 100 U/mL de penicilina (Pen), 2 mM de sustituto de glutamina y 100 mg/mL de estreptomicina (Strep).
  2. Para preparar el medio completo RPMI 1640, agregue 10% (v/v) de FBS, 2 mM de sustituto de glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 50 mM de 2-mercaptoetanol, 100 U/mL de Pen y 100 mg/mL de estreptococo.
  3. Para preparar el medio completo DMEM/F12, agregue 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS), 1 mM de piruvato de sodio, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales y 100 U/mL de pluma y 100 mg/mL de estreptococo.
  4. Para preparar 1 mg/ml de polietilenimina (PEI), disuelva 100 mg de polvo de PEI en 100 ml de agua desionizada estéril en un vaso de precipitados de vidrio o en un tubo cónico. Coloque el vaso de precipitados en un agitador magnético y revuelva a temperatura ambiente (RT) para crear un vórtice hasta que se disuelva por completo. Ajuste el pH a 6,9-7,1, añadiendo ácido clorhídrico (HCl)/hidróxido de sodio (NaOH) gota a gota, y filtre la solución a través de un filtro de membrana de PES de 0,22 μm.
  5. Para preparar 1 mM de butirato de sodio, disuelva 1,10 mg en 10 ml de agua desionizada estéril.
  6. Para preparar 8 mg/ml de Polybrene, disuelva 80 mg de polvo de Polybrene en 10 ml de agua desionizada estéril.
  7. Para preparar el tampón FACS, agregue FBS al 2% y EDTA 1 mM a la solución salina tamponada con fosfato (PBS).

2. Producción de lentivirus

  1. Descongele las células HEK 293T agregando 1 ml de células a 9 ml de medio completo DMEM precalentado y centrifugue las células a 350 × g durante 5 min. Vuelva a suspender el sedimento celular en 20 ml de medio completo de DMEM y cultive las células en una placa de 150 mm a 37 °C con 5% de CO2.
  2. Expanda y divida las células HEK 293T cuando alcancen una confluencia del 80-90%. Para dividir las células, lavar una vez con PBS, añadir 5 ml de tripsina para disociarlas de la placa e incubar 5-10 min a 37 °C con un 5% de CO2.
  3. Recoger las células con 5 ml de medio completo DMEM, centrifugarlas a 350 × g durante 5 min y dividirlas 1:6 en nuevas placas de 150 mm, 48 h antes de la transfección.
    NOTA: La calidad de la línea celular productora de lentivirus es crucial para producir títulos altos. No permita que las células excedan el 95% de confluencia y evite sembrarlas al <30% de confluencia.
  4. Después de 48 h, o cuando las células alcancen una confluencia del 70-80%, prepare la mezcla de transfección en un tubo cónico de 50 ml. Utilice el siguiente plásmido de transferencia: 1) SFFV-PIB-IRES-eGFP-un vector lentiviral policistrónico que contiene los factores de transcripción PU.1, IRF8, BATF3, un sitio de entrada ribosómica interno (IRES) y una proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) como reportero de transducción fluorescente; o 2) SFFV-eGFP, un vector lentiviral de control con un sitio de clonación múltiple y eGFP; o 3) SFFV-mCherry, un vector lentiviral que expresa mCherry. Agregue 10 μg de plásmido de transferencia, 7,5 μg de plásmido de embalaje psPAX2 y 2,5 μg de plásmido de envoltura pMD2.G. Rellene el tubo con Opti-MEM para alcanzar un volumen total de 2 ml. Finalmente, agregue 60 μL del reactivo de transfección PEI (del stock de 1 mg/mL) a la mezcla de transfección.
    NOTA: El vector lentiviral SFFV-eGFP se utiliza como control de transducción para experimentos de reprogramación para tener en cuenta la inmunogenicidad mediada por lentivirus, mientras que SFFV-mCherry se utiliza para generar líneas celulares cancerosas marcadas con fluorescencia.
  5. Agite la transfección se mezcla bien durante 1 min e incube durante 15 min a RT para permitir la formación de complejos ADN-lípidos.
    NOTA: La confluencia influye significativamente en los títulos virales. La transfección de células con menos del 70% de confluencia dará como resultado títulos virales más bajos debido a que menos células reciben los plásmidos.
  6. Aspire el medio de las células HEK 293T y agregue 10 ml de DMEM sin pluma/paso y con un 10% de FBS filtrado estéril.
  7. Añadir la mezcla de transfección gota a gota a las placas de 150 mm e incubar durante 16 h a 37 °C con un 5% de CO2.
  8. Después de la transfección, reemplace el medio con 20 ml de medio completo de DMEM suplementado con butirato de sodio 1 mM e incube las células durante 24 h a 37 °C con 5% de CO2.
    NOTA: El butirato de sodio es un inhibidor de la histona desacetilasa de clase 1 (HDAC) y puede mejorar la expresión génica en las células HEK 293T al inducir la hiperacetilación de histonas, lo que abre la estructura de la cromatina y facilita la transcripción del empaquetamiento viral y la transferencia de plásmidos. La eficiencia de la transfección se puede evaluar verificando la expresión de eGFP utilizando un microscopio de fluorescencia.
  9. Recoja el sobrenadante que contiene lentivirus 48 h y 60 h después de la transfección en tubos cónicos de 50 ml. Después de la primera recolección, agregue 12 ml de medio completo DMEM precalentado por placa de 150 mm para la segunda recolección. Almacene las colecciones a 4 °C, fíltrelas a través de un filtro PES de baja unión a proteínas de 0,45 μm y combínelas.
  10. Para concentrar el virus, pipetee 37 g de medio que contenga lentivirus en tubos de polipropileno de pared delgada de 38,5 ml de parte superior. Mida el peso de los tubos con una báscula de sobremesa.
    NOTA: Mida el peso del medio que contiene lentivirus en lugar de su volumen, ya que el peso proporciona una mayor precisión para el equilibrio. El peso de los tubos debe estar bien equilibrado para evitar dañar la ultracentrífuga.
  11. Coloque los tubos en los cubos de ultracentrifugación, cierre las tapas y coloque los cubos en un rotor de cubo oscilante. Centrifugar a 25.000 × g durante 90 min a 4 °C.
  12. Después de la centrifugación, retire los tubos de los cubos y aspire el sobrenadante.
    NOTA: Los mismos tubos se pueden llenar repetidamente y usar para un número total de tres rondas de centrifugación para producir un gránulo de lentivirus más grande por tubo.
  13. Coloque los tubos de polipropileno de pared delgada de parte superior abierta boca abajo durante 5 minutos sobre una toallita de laboratorio o material absorbente similar para permitir que el exceso de líquido drene y seque el gránulo.
  14. Agregue 200 μL de DMEM helado suplementado con HEPES o PBS a cada gránulo. Coloque los tubos de microcentrífuga en tubos cónicos de 50 ml y cierre la tapa para mantener la esterilidad.
  15. Incubar el pellet durante la noche a 4 °C para permitir la resuspensión.
  16. Combine los gránulos resuspendidos, alícuotas, y guárdelos a -80 °C hasta por un año.
    NOTA: Para evitar la pérdida de título por rondas repetidas de congelación-descongelación, utilice volúmenes de alícuotas más pequeños (por ejemplo, 50-200 μL).

3. Titulación funcional del virus

NOTA: Este paso debe repetirse para cada lote de lentivirus para determinar la dosis viral óptima requerida para lograr una proporción de 1:1 de células transducidas (eGFP+) a no transducidas (eGFP-).

  1. Descongele y expanda las células cancerosas en medios de cultivo apropiados (por ejemplo, la línea celular de melanoma murino YUMM1.7 en medio completo DMEM/F12).
    NOTA: Las células deben someterse al menos a una ronda de división antes de un experimento de reprogramación. Los pasajes de células deben ser similares entre experimentos.
  2. Un día antes del establecimiento del tumor, eleve las células cancerosas aspirando sus medios de cultivo, lavándolas una vez con PBS y agregando 2 ml o 5 ml de tripsina por placa de 100 mm o placa de 150 mm. Incubar durante 5-10 min a 37 °C con 5% de CO2 y recoger las células añadiendo 8 ml o 5 ml de medios completos por placa de 100 mm o 150 mm, respectivamente, en tubos cónicos de 50 ml.
  3. Centrifugar las células a 350 × g durante 5 min para eliminar la tripsina y volver a suspender en medio completo.
  4. Tome una alícuota de 10 μL de células, agregue 10 μL de azul de tripano y cuente las células viables con un hemocitómetro.
  5. Transfiera 6 × 105 células a un nuevo tubo cónico de 50 ml que contenga 12 ml de medio completo y agregue 12 μl de 8 mg / ml de polibreno a la suspensión celular para alcanzar una concentración de trabajo de 8 μg / ml.
  6. Pipetee 2 ml de la suspensión celular en cada pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos.
    NOTA: Si es necesario, aumente el número de celdas a 1.2-1.8 x 106 por placa de 6 pocillos.
  7. Agregue volúmenes crecientes de lentivirus a cada pocillo para determinar el volumen óptimo necesario para lograr una proporción de 1:1 de células transducidas (eGFP+) a no transducidas (eGFP-).
    NOTA: Agregue los volúmenes recomendados de lentivirus de lentivirus de 1, 2, 4, 8, 16 y 32 μL por triplicado. Realice la titulación funcional para el vector lentiviral de control vacío SFFV-eGFP y SFFV-mCherry.
  8. Incubar las células durante 24 h a 37 °C con un 5% de CO2.
  9. El día 0, retire el medio que contiene lentivirus, reemplácelo con medio nuevo e incube durante 72 h a 37 °C con 5% de CO2.
  10. El día 3, verifique la expresión de eGFP en las células bajo un microscopio de fluorescencia.
    NOTA: Este paso proporciona una verificación rápida de la transducción celular, pero no reemplaza el análisis realizado por citometría de flujo en el paso 3.14 para determinar la proporción exacta de células eGFP+ a eGFP- .
    En algunas células cancerosas (por ejemplo, células de melanoma de ratón B16) la señal de eGFP puede ser baja y difícil de detectar con un microscopio de fluorescencia. Se recomienda proceder directamente a la citometría de flujo.
  11. Aspire el medio, lave las células una vez con PBS y agregue 500 μL de tripsina por pocillo. Incubar durante 5-10 min a 37 °C con un 5% de CO2.
  12. Eleve las células de cada pocillo con 1,5 ml de tampón FACS y pipetee la suspensión celular en tubos de poliestireno de 5 ml. Tome una alícuota y cuente las células viables con un hemocitómetro y tinción con azul de tripano.
  13. Centrifugar la suspensión celular a 350 × g durante 5 min, volver a suspender el sedimento en 100 μL de tampón FACS y proceder al análisis de citometría de flujo.
  14. Cuantifique la proporción precisa de células transducidas (eGFP+) a no transducidas (eGFP-) mediante citometría de flujo. Para las pruebas in vivo , use el volumen de lentivirus que produzca la proporción más cercana a 1: 1.
    NOTA: Para determinar con precisión la proporción de células eGFP+ a eGFP- , incluya células cancerosas no transducidas como controles negativos para la compuerta.

4. Establecimiento de tumores subcutáneos para reprogramación in vivo

  1. Descongele y expanda las células cancerosas en su medio de cultivo apropiado para generar células que expresan mCherry.
    NOTA: La expresión de mCherry facilita la distinción de las células cancerosas durante el análisis de citometría de flujo de otras poblaciones en el tumor, por ejemplo, células estromales endógenas e inmunes.
  2. Realice los pasos 3.2-3.4 y vuelva a suspender las células en medios completos a una concentración de 105 células por ml.
  3. Agregue 8 μg / ml de polibeno y el volumen determinado de SFFV-mCherry lentivirus a la suspensión celular para alcanzar una eficiencia de transducción del >90%.
    NOTA: Alternativamente, si lograr una transducción del >90% compromete la viabilidad celular, clasifique las células mCherry+ mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) 72 h después de la transducción y expanda las células clasificadas en cultivo.
  4. Placa 5 mL de la suspensión celular (que contiene 5 × 105 células) por placa de 100 mm e incubar las células a 37 °C con 5% de CO2 durante 24 h.
  5. Después de 24 h, reemplace el medio con 10 ml de medio completo y expanda las células cultivándolas a 37 ° C con 5% de CO2 durante al menos 7 días antes de comenzar los experimentos de reprogramación.
  6. Después de la expansión, siga los pasos 3.2-3.4 para preparar las suspensiones celulares para la transducción posterior con el volumen previamente determinado de SFFV-PIB-IRES-eGFP, lo que da como resultado la relación 1:1 más cercana de células transducidas (eGFP+) a no transducidas (eGFP-) en el día 3.
  7. Agregue 8 μg / ml de polibreno a la suspensión celular, junto con el volumen previamente determinado de lentivirus a la suspensión celular en tubos cónicos de 50 ml. Mezclar bien sin crear burbujas.
  8. Pipetear 2 ml de la suspensión celular (que contiene 105 células) por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos e incubar durante 24 h a 37 °C con 5% de CO2.
    NOTA: Alternativamente, coloque las células en placas de 5 ml de medios de transducción en placas de cultivo de tejidos de 100 mm. Sin embargo, tenga en cuenta que la eficiencia de la transducción puede reducirse en volúmenes mayores y debe determinarse empíricamente como se describe en los pasos 3.1-3.13.
    Se recomienda transducir al menos un 10% más de células para compensar la posible pérdida de células durante el proceso de transducción y para garantizar un volumen suficiente para el pipeteo o la inyección durante el establecimiento del tumor.
  9. Después de 24 h, retire el medio que contiene lentivirus, lave dos veces con PBS, agregue 500 μL de tripsina a cada pocillo e incube durante 5-10 min a 37 °C con 5% de CO2.
  10. Verifique bajo un microscopio óptico si las células se disociaron completamente de las placas y luego recójalas con medios completos en tubos cónicos de 50 ml.
  11. Peletizar las células centrifugándolas durante 5 min a 350 × g, lavar el pellet con PBS y centrifugar nuevamente durante 5 min a 350 × g. Tome una alícuota y cuente las células viables con un hemocitómetro y tinción con azul de tripano.
  12. Vuelva a suspender el gránulo en PBS helado para alcanzar una concentración de 2-4 × 107 células por ml, lo que corresponde a 1-2 × 106 células en 50 μl de volumen de inyección por tumor.
    NOTA: Es importante destacar que estos números se han validado para que los tumores de melanoma YUMM1.7 aíslen células similares a cDC1 reprogramadas in vivo para el análisis de citometría de flujo. Para otras líneas celulares y para otras lecturas experimentales, como experimentos de crecimiento y supervivencia de tumores, los números deben probarse empíricamente. Para los experimentos de crecimiento y supervivencia tumoral, se recomienda un número más bajo de células, que oscila entre 100.000 y 250.000 células por tumor.
  13. Reubicarse en el área de trabajo donde se realizan los experimentos con animales y mantener las celdas en hielo.
    NOTA: Después de la preparación celular, realice inyecciones celulares lo más rápido posible, ya que la viabilidad celular se reduce con el tiempo.
  14. Prepare la solución de anestesia que contiene 3 μL de xilacina (20 mg/mL), 27 μL de ketamina (100 mg/mL) y 30 μL de PBS por ratón.
  15. Anestesiar ratones CD45.1 inyectando 60 μL de anestésico por vía intraperitoneal. Aleatoriza a los ratones y mantenlos en una almohadilla térmica para evitar una caída en la temperatura corporal. Aplique crema para los ojos en los ojos para prevenir la deshidratación ocular durante la anestesia.
    NOTA: Es fundamental utilizar ratones CD45.1 para permitir la distinción entre células similares a cDC1 reprogramadas in vivo que expresan el alelo CD45.2 de tipo salvaje y células inmunitarias endógenas. Si la línea celular es CD45.1, se pueden usar ratones C57BL/6 (CD45.2) como receptores. Los ratones deben ser emparejados por sexo y edad entre los grupos experimentales y aleatorizados antes del establecimiento del tumor.
  16. Espere de 5 a 10 minutos hasta que todos los ratones estén completamente anestesiados.
  17. Afeitar el flanco derecho de los ratones con una navaja; Opcionalmente, márquelos con un cortaúñas. Desinfecte el área y deslice el cabello restante con etanol al 70%.
  18. Resuspenda las células cancerosas pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P1000. Cargue la suspensión celular en una jeringa de 0,5 ml de 30 G.
  19. Levante suavemente la piel del flanco afeitado del ratón con dos dedos e inserte la punta de la aguja donde la piel forma un pliegue.
    NOTA: Tenga cuidado de no pincharse los dedos con la aguja.
  20. Suelte la piel, sostenga la jeringa en su lugar con una mano y use dos dedos de la otra mano para estirar la piel del ratón.
  21. Inyecte lentamente 50 μL de la suspensión de células cancerosas para crear una protuberancia ovalada (hinchazón subcutánea) en el lugar de la inyección.
    NOTA: Si no se forma una protuberancia, es posible que la suspensión se haya filtrado al tejido subcutáneo circundante, lo que puede conducir a la formación de tumores inconsistentes o fallidos.
  22. Después del procedimiento, monitoree el despertar de todos los ratones para garantizar la supervivencia después de la anestesia.
  23. Mantenga a los ratones en un entorno de temperatura controlada con 23 ± 2 °C y un ciclo fijo de luz/oscuridad de 12 h y libre acceso a alimentos y agua.
    NOTA: Si desea controlar el crecimiento del tumor, continúe con los pasos 4.24-4.26. De lo contrario, omita estos pasos y continúe directamente con las siguientes secciones.
  24. Para controlar el crecimiento del tumor, sujete suavemente al ratón con una mano, lo que permite una visualización clara del tumor.
  25. Con un calibrador electrónico, mida la longitud (l), el ancho (w) y la altura (h) del tumor. Calcule el volumen tumoral (V) usando la fórmula: V = (l x w x h) / 2.
  26. Mida las dimensiones del tumor cada dos o tres días. Cuando el tumor alcanza un volumen que cumple con el criterio de criterio de valoración humanitario (por ejemplo, 1,500 mm³), eutanasia al animal de acuerdo con las pautas éticas e institucionales.

5. Aislamiento tumoral para análisis de citometría de flujo

  1. Prepare tijeras, fórceps, tampón FACS y placas de cultivo sin tejidos de 12 pocillos con medio completo RPMI helado para la recolección de muestras tumorales.
  2. Preparar la solución de digestión tumoral mezclando 30 μL de 100 mg/mL de colagenasa D y 3 μL de 10 mg/mL de ADNasa I en 3 mL de medio completo RPMI por tumor (para alcanzar una concentración de trabajo de 1 mg/mL de colagenasa D y de 10 μg/mL de ADNasa I).
    NOTA: Si la eficiencia de la digestión no es óptima, agregue 2-5 mM de CaCl2 para apoyar la actividad de la colagenasa.
  3. Eutanasia a los ratones por luxación cervical o asfixia por CO2 el día del aislamiento.
  4. Extirpe los tumores subcutáneos con tijeras y fórceps y coloque cada tumor en un pocillo de la placa de cultivo no tisular de 12 pocillos con RPMI helada. Trate de minimizar la escisión del tejido no tumoral.
  5. Corte las muestras de tumores en trozos de1-2 mm y 3 con unas tijeras, recoja los trozos en tubos cónicos de 50 ml que contengan 3 ml de solución de digestión e incube a 37 °C mientras agita a 200-250 rpm durante 30-45 min.
    NOTA: Vórtice o pipeta cada 15 min para facilitar el proceso de digestión.
  6. Después de la digestión, pipetee vigorosamente la mezcla durante 1 min con una pipeta serológica de 5 ml. Filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de 70 μm en un nuevo tubo cónico de 50 ml.
  7. Use el émbolo de una jeringa de 10 ml para aplastar piezas no digeridas contra el filtro celular de 70 μm y enjuague el filtro con 10 ml de medio completo RPMI.
  8. Centrifugar la suspensión celular a 350 × g durante 5 min a 4 °C, volver a suspender en 1 ml de tampón FACS y contar las células viables.
  9. Transfiera la suspensión celular a tubos de poliestireno de 5 ml, celdas de pellets a 350 × g durante 5 min y vuelva a suspender 106 células viables por 100 μL de tampón FACS.
  10. Celdas separadas para controles de un solo color (SC) y FMO en tubos de poliestireno separados.
  11. Prepare una mezcla maestra de tinción de anticuerpos que contenga suero de rata (1:100) para bloquear la unión inespecífica; un colorante de viabilidad fijable (1:100) para excluir las células muertas en el análisis; y anticuerpos anti-CD45.1, anti-CD45.2 y anti-MHC-II marcados con fluorescencia en su concentración óptima. Añadir 100 μL de la mezcla maestra a cada muestra e incubar durante 20 min a 4 °C en la oscuridad.
  12. Lave las muestras 2 veces con 2 ml de tampón FACS y proceda con el análisis de citometría de flujo.
  13. Cuantifique los porcentajes de células similares a cDC1 que expresan CD45.2 y/o MHC-II, mediante la activación en células cancerosas transducidas (eGFP+) (CD45.1-mCherry+).
    NOTA: Este protocolo se puede utilizar para realizar inmunofenotipado de tumores después de la reprogramación in vivo de cDC1 complementando el panel de tinción con anticuerpos contra poblaciones de células inmunitarias linfoides y/o mieloides endógenas.

6. Congelación y corte de tumores para análisis de microscopía confocal

  1. Prepárese para el aislamiento del tumor siguiendo los pasos 5.1 y 5.3. Extirpar tumores subcutáneos con tijeras y fórceps.
  2. Fije los tumores en paraformaldehído (PFA) al 4% recién preparado en PBS a 4 °C con agitación suave. Ajustar el tiempo de fijación según el tamaño del tumor, utilizando 1 h por mm³ de tejido como guía.
  3. Transfiera los tumores a sacarosa al 15% en PBS e incube a 4 ° C mientras agita suavemente los tejidos hasta que se hundan hasta el fondo del tubo. Luego, muévalos al 20% de sacarosa en PBS en las mismas condiciones.
  4. Una vez que los tumores se hayan asentado en el fondo del tubo, incubarlos en una mezcla 1:1 de sacarosa al 20% en PBS y compuesto OCT durante 30 min a 4 °C con agitación.
  5. Retirar la mezcla, incrustar los tejidos en un criomold con OCT 100% y congelar rápidamente con nitrógeno líquido.
    NOTA: Siempre use el equipo de protección personal adecuado (crioguantes, protector facial y bata de laboratorio) para evitar quemaduras por frío o lesiones por la rápida expansión de vapor. Trabaje en un área bien ventilada para evitar el riesgo de asfixia.
    1. Almacene los bloques a -80 °C en recipientes cerrados para evitar la deshidratación.

7. Tinción de inmunofluorescencia de secciones tumorales

  1. Con un criostato, corte los tumores en secciones de aproximadamente 8 μm de grosor y móntelos en portaobjetos de vidrio de microscopio. Si es necesario, almacene los portaobjetos a -80 °C.
    NOTA: Para preservar la integridad del tejido, mantenga los bloques y portaobjetos con cortes tumorales montados en hielo seco durante el transporte hacia y desde el criostato. Asegúrese de que el criostato se mantenga a -20 °C durante el corte.
  2. Descongele los portaobjetos en PBS durante 5 min y fíjelos en una solución de PFA al 4% durante 10 min a temperatura ambiente.
  3. Después de la fijación, lave los portaobjetos en PBS durante 5 min.
    NOTA: Asegúrese de que los tejidos permanezcan hidratados; Manténgalos siempre en líquido durante todos los pasos posteriores de tinción. Si es necesario pausar el experimento, los portaobjetos se pueden almacenar en PBS a RT durante un máximo de 3 horas. Evite almacenar los portaobjetos en PBS durante la noche.
  4. Para la recuperación de antígenos, llene una vaporera con agua y enciéndala. Coloque un frasco que contenga agua desionizada y un frasco que contenga 10 mM de citrato de sodio (pH 6) en la vaporera y cubra la abertura con papel de aluminio. Sin quitar la tapa, inserte un termómetro a través de las rejillas de ventilación de la tapa del vaporizador, perfore el papel de aluminio y controle la temperatura, asegurándose de que las soluciones alcancen ~ 99 ° C.
  5. Cuando los tampones alcancen ~99 °C, sumerja los portaobjetos en agua desionizada durante 10 s y luego transfiéralos rápidamente a la solución de recuperación de antígenos.
  6. Incubar los portaobjetos a ~99 °C durante 15 min.
  7. Lave los portaobjetos en 1x PBS durante 3 x 5 min.
  8. Use un bolígrafo de Papanicolaou de barrera hidrofóbica para delinear cada sección de tejido, formando un perímetro hidrofóbico que evite que se filtre cualquier líquido agregado a los tejidos.
    NOTA: Los lavados posteriores de PBS pueden alterar el perímetro hidrofóbico que rodea los tejidos y requerir renovación. Dibújalo de nuevo según sea necesario.
  9. Bloquee y permeabilice los tejidos con 150 μL de tampón de bloqueo (5% de suero y 0,5% de Triton X-100 en 1x PBS) durante 60 min a RT. Para todos los pasos de tinción, utilice suero de la misma especie que el huésped del anticuerpo secundario.
  10. Lave los portaobjetos en 1x PBS durante 3 x 5 min.
  11. Incubar tejidos con 20 μg/ml del anticuerpo primario anti-CD45 en tampón de bloqueo (5% de suero y 0,5% de Triton X-100 en 1X PBS) durante la noche a 4 °C.
    NOTA: Para usar otros anticuerpos, valide empíricamente la concentración de anticuerpos.
  12. Lave los portaobjetos en 1x PBS durante 3 x 5 min.
  13. Incube las secciones de tejido con el anticuerpo secundario anti-rata de cabra conjugado con AlexaFluor-647 a una dilución de 1:250 en tampón de bloqueo (suero al 5%) durante 2 h en la oscuridad a RT.
    NOTA Después de agregar el anticuerpo secundario, realice todos los pasos posteriores en la oscuridad para evitar el fotoblanqueo de los fluoróforos.
  14. Lave los portaobjetos en 1x PBS durante 3 x 5 min.
  15. Incube tejidos con 1 μg/mL de DAPI y 20 μg/mL de anticuerpos conjugados AlexaFluor-594 en tampón de bloqueo (suero al 5%) durante 1 h en la oscuridad a RT.
  16. Lave los portaobjetos en 1x PBS durante 3 x 5 min.
  17. Agregue una gota de solución de montaje en cada sección del tumor, luego aplique unas gotas de medio de montaje al cubreobjetos. Invierta rápidamente el cubreobjetos en el portaobjetos para montarlo y asegurarse de que no haya burbujas cerca de los tumores.
  18. Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche y obtenga imágenes de ellos mediante microscopía confocal.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En la Figura 1 se presenta una descripción esquemática del protocolo de reprogramación in vivo manejable. Primero, producimos el vector lentiviral policistrónico SFFV-PIB-IRES-eGFP (PIB-eGFP), que codifica para los factores de reprogramación de instrucción cDC1 PU.1, IRF8, BATF3, seguido de un sitio de entrada ribosómica interno (IRES) y una proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) en la línea celular de empaquetado HEK 293T. Para controlar la inmunogenicidad mediada por lentivirus, producimos un vector SFFV-MCS-eGFP vacío (eGFP), que contenía un sitio de clonación múltiple (MCS) e IRES-eGFP, pero excluyendo los factores de reprogramación. Después de la producción viral, cosechamos el sobrenadante que contenía lentivirus y lo concentramos por ultracentrifugación. Titulamos funcionalmente el virus para determinar la cantidad requerida para lograr una proporción de 1:1 de células transducidas (eGFP+) a no transducidas (eGFP-), que evaluamos el día 3 después de la transducción. Luego, usamos la cantidad de virus resultante para transducir la línea celular cancerosa seleccionada el día -1. Después de 24 h, recolectamos las células y las implantamos por vía subcutánea para establecer tumores. Esta estrategia aseguró que las células transducidas se reprogramaran en células similares a cDC1 in vivo, dentro del TME. En los puntos de tiempo indicados después del injerto, extirpamos y procesamos tumores para análisis posteriores, incluida la citometría de flujo de células tumorales disociadas, para cuantificar la eficiencia de reprogramación in vivo, o la tinción de inmunofluorescencia de secciones tumorales criopreservadas para caracterizar cambios en el TME.

En primer lugar, para garantizar la producción de altos títulos lentivirales, monitorizamos las células HEK 293T antes de la transfección, con el objetivo de alcanzar el 70-80% de confluencia y 24 h después, evaluamos la eficiencia de la transfección a través de la expresión de eGFP por microscopía de fluorescencia (Figura 2A). A continuación, recolectamos el medio que contenía virus 48 h y 60 h después de la transfección, lo ultracentrifugamos y lo almacenamos en alícuotas a -80 °C (Figura 2B). Luego, determinamos la cantidad viral óptima requerida para lograr una proporción de 1: 1 de células eGFP + a eGFP - en células de melanoma YUMM1.7. Sembramos 10 5células YUMM1.7 por pocillo en una placa de 6 pocillos, transducimos las células con volúmenes crecientes de lentivirus y reemplazamos el sobrenadante que contenía virus con medios completos frescos de DMEM / F12 después de 24 h (Figura 2C). El día 3, evaluamos la expresión de eGFP mediante microscopía de fluorescencia, antes de proceder a cuantificar los porcentajes precisos de células eGFP+ mediante citometría de flujo (Figura 2C). Para cuantificar la proporción de células eGFP+ a eGFP-, controlamos las células vivas individuales para excluir las células muertas y los dobletes (Figura 2D). El volumen óptimo del lote de lentivirus producido se determinó tanto para PIB-eGFP como para el virus eGFP de control como 2 μL por 10 5células YUMM1.7, lo que resultó en 50.0 ± 0.3% y 63.0 ± 0.9% de células eGFP+, respectivamente (Figura 2E).

A continuación, para evaluar la eficiencia de la reprogramación in vivo, generamos una línea celular de cáncer marcada con fluorescencia (mCherry +) (YUMM1.7-mCherry). Esto aseguró que pudiéramos discriminar entre células cancerosas y células estromales o inmunes mediante la activación de células mCherry + vivas en el análisis de citometría de flujo (Figura 3A, B). Luego transducimos células YUMM1.7-mCherry con 2 μL de PIB-eGFP o virus eGFP de control por 105 células para lograr una proporción de eGFP+ a eGFP- de 1: 1. Implantamos subcutáneamente 1,6 × 106 células por tumor en ratones CD45.1 y mantuvimos una alícuota de células para cultivar in vitro para comparar. Evaluamos la eficiencia de reprogramación mediante citometría de flujo, activando células vivas mCherry + eGFP + y CD45.1- para excluir las células inmunes del huésped que han engullido eGFP o mCherry (Figura 3B). De los días 1 a 9, observamos la adquisición gradual de la expresión de CD45.2 y/o MHC-II, marcando células similares a cDC1 parcialmente reprogramadas (CD45.2+ MHC-II- o CD45.2- MHC-II+) y células similares a cDC1 completamente reprogramadas (CD45+ MHC-II+) (Figura 3C). Validamos que la reprogramación de células cancerosas de ratón in vivo dio como resultado porcentajes más altos de células similares a cDC1 en el día 9 en comparación con las condiciones in vitro (9,54 ± 1,54% CD45+ MHC-II+ in vivo frente a 4,72 ± 1,1% CD45+ MHC-II+ in vitro, P = 0,018). La cinética de la reprogramación también se aceleró ya que observamos un mayor porcentaje de células similares a cDC1 ya en el día 4 (8,7 ± 3,3% CD45+ MHC-II+ in vivo vs. 0,3 ± 0,1% CD45+ MHC-II+ in vitro, P = 0,05), lo que indica que la presencia de señales ambientales promueve una reprogramación más rápida y eficiente hacia células similares a cDC119. Mientras que las células similares a cDC1 reprogramadas in vitro estuvieron presentes hasta el día 15, las células similares a cDC1 in vivo persistieron durante 9 días, pero no se detectaron el día 15, lo que sugiere el agotamiento del TME por parte del sistema inmunológico del huésped (Figura 3C). 

Por último, nuestro objetivo fue caracterizar los cambios tempranos del TME como resultado de la reprogramación in vivo de cDC1 en los primeros 9 días. Realizamos tinción de inmunofluorescencia de tejidos tumorales criopreservados y seccionados de tumores eGFP y PIB-eGFP después de 3 y 9 días de reprogramación in vivo , centrándonos en la infiltración de células inmunes marcadas por el marcador panhematopoyético CD45. En particular, las células similares a cDC1 reclutaron significativamente más células CD45 para el TME fácilmente el día 3, en comparación con los tumores eGFP (49,6 ± 17,0 frente a 8,0 ± 5,8 eGFP intensidad de fluorescencia media de la tinción CD45 por área tumoral; Figura 4A, B). Curiosamente, detectamos TLS dentro del TME de tumores después de 9 días de reprogramación in vivo . Esto sugiere que las células similares a cDC1 pueden remodelar rápidamente el TME de un ambiente "inmunofrío" a un ambiente "inmune-caliente" en 3 días, lo que posteriormente conduce a la formación de TLS en el día 9.

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Figura 1: Descripción general del protocolo para generar células similares a cDC1 mediante la reprogramación in vivo de células cancerosas. Los vectores lentivirales que codifican PU.1, IRF8 y BATF3 en un casete policistrónico bajo el control del promotor del virus formador de focos del bazo (SFFV) y eGFP después de un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) para rastrear células transducidas mediante citometría de flujo y microscopía de fluorescencia, se producen en la línea celular de empaquetado HEK 293T. Luego, los vectores lentivirales se ultracentrifugan y se titulan funcionalmente para determinar la cantidad de virus necesaria para transducir las células cancerosas en una proporción de eGFP+ transducida 1:1 a células eGFP- no transducidas. Para experimentos de reprogramación in vivo , las células cancerosas se siembran con la cantidad óptima de lentivirus en el día -1. Al día siguiente, esta mezcla 1:1 de células GFP+ transducidas y GFP- no transducidas se lava y se recolecta para el establecimiento de tumores subcutáneos en ratones. Se mantienen cultivos in vitro paralelos para validar la transducción en el día 3 mediante citometría de flujo. Los animales son monitoreados cada 2-3 días para determinar el crecimiento y la supervivencia del tumor. Los tumores se recolectan en puntos temporales definidos, se disocian y se tiñen para la expresión de marcadores de superficie para el análisis de citometría de flujo. Alternativamente, los tejidos completos se fijan, se criopreservan y se seccionan para la tinción de inmunofluorescencia y el análisis de microscopía confocal. La eficiencia de la reprogramación in vivo se evalúa mediante análisis de citometría de flujo, mientras que los cambios en el microambiente tumoral se caracterizan mediante imágenes confocales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Producción y titulación funcional de lentivirus para la reprogramación in vivo de cDC1. (A) Cuando las células HEK 293T alcanzan una confluencia de ~70-80%, se transfectan con una mezcla que contiene 10 μg de plásmido de transferencia SFFV-PIB-eGFP (PIB-eGFP) o SFFV-eGFP de control de vectores lentivirales vacíos (eGFP), junto con 7,5 μg de psPAX2 y 2,5 μg de mPD2.G y 60 μL de 1 mg/mL de PEI. Imágenes de microscopía de campo claro y fluorescencia de células HEK 293T que muestran la expresión de eGFP 24 h después de la transfección, lo que indica una administración exitosa del plásmido. Barras de escala = 200 μm. (B) Representación esquemática del flujo de trabajo de ultracentrifugación para concentrar lentivirus. El sobrenadante que contiene lentivirus de células HEK 293T se recolecta 48 h y 60 h después de la transfección, se filtra a través de un filtro PES de baja unión a proteínas de 0,45 μm y se pesan 37 g en tubos de polipropileno de pared delgada de parte superior abierta utilizando una báscula de sobremesa. Los tubos se ultracentrifugan en un rotor de cubeta oscilante, se aspira el sobrenadante y se seca el pellet durante 5 min. Luego, los gránulos se resuspenden en DMEM helado que contiene HEPES y se incuban durante la noche antes de alícuotas y almacenamiento a -80 ° C. (C) Estrategia experimental de la titulación funcional para determinar la dosis viral óptima para lograr una proporción de 1: 1 de GFP + a células GFP-. Imágenes de microscopía de campo claro y fluorescencia que muestran la expresión de eGFP en células de melanoma YUMM1.7, 72 h después de la transducción, lo que indica la administración exitosa de los factores de reprogramación y eGFP. Barras de escala = 100 μm. (D) Gráficos representativos de citometría de flujo que muestran la estrategia de activación para cuantificar la proporción de células eGFP+ . Las células vivas se cerraron para la población negativa de colorante de viabilidad (DAPI) seguida de la exclusión del doblete. (E) Cuantificación por citometría de flujo de la eficiencia de la transducción con dosis virales crecientes para determinar el volumen óptimo para lograr células GFP+/GFP- 1:1. Tanto para el lentivirus PIB-eGFP como para el eGFP, un volumen de 2 μL por 105 células logró la proporción deseada. Abreviaturas: cDC1s = células dendríticas convencionales tipo 1; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; PIB = PU.1, IRF8 y BATF3; PEI = polietilenimina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Evaluación de la eficiencia de reprogramación de cDC1 in vivo. (A) Representación esquemática del flujo de trabajo experimental para evaluar la eficiencia de reprogramación de cDC1 in vivo. Las células cancerosas se transducen inicialmente con un lentivirus que expresa mCherry para generar una línea celular marcada con fluorescencia (YUMM1.7-mCherry), seguida de la transducción con la dosis optimizada de lentivirus PIB-eGFP en el día -1. Luego, las células se inyectan por vía subcutánea con una proporción de 1: 1 de células eGFP + / eGFP - en el día 0 para establecer tumores en ratones CD45.1 y permitir que las células transducidas por PIB se reprogramen en células similares a cDC1 dentro del TME. Luego, los tumores se aíslan en los puntos de tiempo indicados, se disocian y se tiñen para CD45.1, CD45.2 y MHC-II mediante citometría de flujo. Esto permite la exclusión de las células inmunitarias del huésped CD45.1 para cuantificar la eficiencia de reprogramación de cDC1 in vivo mediante la expresión de CD45.2 y MHC-II. Los cultivos in vitro paralelos se mantienen a lo largo de los puntos de tiempo como una comparación con la reprogramación in vivo. (B) Gráficos representativos de citometría de flujo que ilustran la estrategia de activación en el día 9. Las células se cerraron en mCherry + y GFP + para identificar células cancerosas transducidas con éxito. Las células inmunitarias del huésped se excluyeron mediante la eliminación de las células CD45.1+. (C) Cuantificación de la eficiencia de reprogramación in vivo (izquierda) de células YUMM1.7-mCherry mediante citometría de flujo como el porcentaje de células CD45+ MHC-II+ (completamente reprogramadas) y células CD45.2+ HLA-DR- o CD45.2- HLA-DR+ similares a cDC1 (parcialmente reprogramadas) activadas dentro de eGFP+ mCherry+ células. Gráficos representativos de citometría de flujo (derecha) que muestran la adquisición gradual de la expresión de CD45.2 y MHC-II en células YUMM1.7-mCherry transducidas por PIB-eGFP a lo largo de los puntos de tiempo indicados. Se utilizaron células YUMM1.7-mCherry transducidas por eGFP como control y se utilizaron células similares a cDC1 reprogramadas in vitro para la comparación. Los datos en (C) indican la media ± DE de 3-5 experimentos biológicos replicados. El análisis estadístico en (C) se realizó para las células CD45+ MHC-II+ utilizando la prueba de Mann-Whitney. *P < 0,05. Abreviaturas: cDC1s = células dendríticas convencionales tipo 1; PIB = PU.1, IRF8 y BATF3; TME = microambiente tumoral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Análisis de la infiltración inmune en el microambiente tumoral después de la reprogramación in vivo de cDC1. (A) Imágenes confocales representativas que muestran células CD45+ en tumores YUMM1.7 después de la implantación subcutánea de células transducidas por PIB-eGFP o eGFP de control (proporción 1:1 de células transducidas a células parentales) en los días 3 y 9. Barras de escala = 500 μm. (B) Cuantificación del MFI para la tinción de CD45 en tumores YUMM1.7 tratados con PIB y transducidos por eGFP en los días 3 y 9. Los datos en (B) indican la media ± DE de 3-6 experimentos biológicos replicados. El análisis estadístico en (B) se realizó mediante la prueba de Mann-Whitney. *P < 0,05 y ***P < 0,001. Abreviaturas: cDC1s = células dendríticas convencionales tipo 1; PIB = PU.1, IRF8 y BATF3; MFI = intensidad media de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este protocolo, describimos un método manejable para generar células similares a cDC1 basado en la reprogramación in vivo de células cancerosas de tumores sólidos. Nuestros resultados demuestran que la sobreexpresión de PU.1, IRF8 y BATF3 impulsa la adquisición gradual de un fenotipo cDC1 en el TME hasta el día 9, después de lo cual las células similares a cDC1 se agotan de los tumores. En última instancia, esto conduce a un aumento en la infiltración de células CD45 en el TME para el día 3, lo que hace que la remodelación de un TME "inmuno-frío" se convierta en "inmuno-caliente".

Los protocolos actuales para generar cDC1 incluyen el enriquecimiento de CD autólogas de sangre periférica, la diferenciación de células progenitoras hematopoyéticas CD34+ o la diferenciación de células madre pluripotentes 14,15,16,17,18,19. Sin embargo, estos métodos presentan factores limitantes: maduración insuficiente, reducción de la presentación de antígenos y de la capacidad de producción de citoquinas/quimiocinas in vivo, susceptibilidad a la inmunosupresión, alta heterogeneidad de la CD y bajo número de células generadas7. Aquí, proporcionamos un protocolo que permite la generación escalable de células similares a cDC1 in vivo para estudios funcionales y mecanicistas.

Con este método, probamos si la expresión de la combinación de factores de transcripción PU.1, IRF8 y BATF3 era suficiente para impulsar la reprogramación in vivo . Este protocolo permite un control preciso sobre la eficiencia de la administración, ya que variar la dosis de células modificadas genéticamente implantadas influye directamente en la eficacia del tratamiento. Hemos demostrado previamente que el 2% de las células transducidas, que corresponden al 0,15% de células CD45+ y MHC-II+ similares a cDC1, son suficientes para provocar inmunidad antitumoral20. Además, la rápida infiltración inmune observada en el día 3 sugiere que las células similares a cDC1 parcialmente reprogramadas son funcionalmente activas in vivo, ya que no hay un aumento sustancial en las células similares a cDC1 completamente reprogramadas en este punto de tiempo. En el futuro, será interesante desentrañar el papel funcional de las células similares a cDC1 parcialmente reprogramadas versus totalmente reprogramadas en la eficacia antitumoral utilizando vectores modificados que contienen un gen suicida para inducir la muerte celular en poblaciones celulares seleccionadas en puntos de tiempo definidos24. Este protocolo se puede utilizar además para explorar la combinación con adyuvantes epigenéticos, lo que puede aumentar la eficiencia de la reprogramación25. Finalmente, este método también podría adaptarse para generar otros subtipos de DC in vivo, lanzando diferentes tipos de respuestas inmunes, por ejemplo, respuestas antivirales o tolerogénicas14. Además, podemos aprovechar la reprogramación in vivo como plataforma para realizar pantallas con códigos de barras para combinaciones de factores de transcripción para generar diversos tipos de células inmunitarias. Esta posibilidad podría aumentar la flexibilidad de los tratamientos al aprovechar diversas propiedades funcionales de subconjuntos inmunes específicos.

En nuestro estudio anterior, demostramos que el entorno inmunosupresor in vivo no obstaculiza la reprogramación de células cancerosas humanas en cDC1 inmunogénicos20. En este artículo, mostramos que en ratones, la reprogramación es más rápida y eficiente in vivo que in vitro, lo que sugiere que la reprogramación mejorada observada in vivo es un fenómeno conservado en ambas especies. Sin embargo, una de las limitaciones de este método es la falta del entorno in vivo durante la entrega inicial del vector; por lo tanto, no puede discernir si las señales ambientales afectan la eficiencia de la entrega in vivo. Esto debe determinarse in situ comparando diferentes mitades. Los vectores adenovirales, que hemos identificado como más eficientes que los vectores lentivirales para la administración in situ 20 , podrían compararse con restos no virales como ARN lineales, circulares y autoamplificadores o cócteles de moléculas pequeñas2 6,27.

Hemos demostrado previamente que la reprogramación de cDC1 dota a las células cancerosas de citoquinas proinflamatorias y secreción de quimiocinas reclutadoras de linfocitos y procesamiento profesional de antígenos y presentación de MHC-I y MHC-II en modelos de melanoma23,28. Esto da como resultado la remodelación del TME de un estado "inmunofrío" a un estado "inmune-caliente" al inducir la formación de TLS, lo que aumenta la infiltración de células T efectoras citotóxicas, células NK y células B, y reduce las poblaciones inmunosupresoras como las células T reguladoras y agotadas20. En los pacientes, las respuestas positivas a la inmunoterapia se han relacionado con la presencia de TLS dentro de los tumores, donde el cebado sostenido de células T y B contra antígenos tumorales genera respuestas de anticuerpos específicos del tumor29,30. En el futuro, prevemos emplear este protocolo de reprogramación de cDC1 in vivo manejable para desentrañar los mecanismos de la neogénesis inducida de TLS, la remodelación de TME y la inmunidad antitumoral en diferentes tipos de cáncer y caracterizar si se estimula la producción de anticuerpos específicos del tumor.

Previamente hemos observado sinergia entre la reprogramación in vivo de cDC1 y el ICB con anti-PD-1 o anti-CTLA-420. Esto sugiere que el TME "inmune-caliente" creado por la reprogramación de cDC1 podría proporcionar un entorno favorable para posibles combinaciones con otras inmunoterapias como ACT, incluidas las células T receptoras de células T (TCR), las células T receptoras de antígeno quimérico (CAR) o los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL). Otra ventaja de este método es la posibilidad de realizar grandes cribados combinatorios o CRISPR imparciales, en los que los receptores inmunológicos, las citocinas, las quimiocinas o las linfotoxinas podrían sobreexpresarse o agotarse en células similares a cDC1 en tipos de tumores resistentes, desentrañando así el papel de distintas vías en la mejora de la inmunidad mediada por cDC1. En conclusión, el protocolo actual proporciona un recurso valioso para una amplia comunidad científica, ya que la reprogramación in vivo de cDC1 es una plataforma flexible y poderosa para estudios mecanicistas e innovación terapéutica en inmunoterapia contra el cáncer.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.-F.P. tiene participación accionaria y ocupa puestos directivos en Asgard Therapeutics AB, que desarrolla inmunoterapias contra el cáncer basadas en tecnologías de reprogramación de DC in vivo. C.-F.P es un inventor de patentes concedidas US 11,345,891, JP 7303743 y CN ZL201880005047.3 y solicitudes de patentes WO 2018/185709 y WO 2022/243448 (junto con E.A.) en poder de Asgard Therapeutics, que cubren el enfoque de reprogramación celular descrito aquí.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Mariana Lopes y Camille Chatelain, miembros del Laboratorio de Reprogramación Celular en Hematopoyesis e Inmunidad, por editar y corregir el manuscrito.

Este estudio se realizó en el contexto de la Escuela Nacional de Investigación ATMP financiada por el Consejo de Investigación Sueco. Los proyectos que se debaten aquí fueron cofinanciados por el Consejo Europeo de Investigación en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (866448-TrojanDC y 101189370), Novo Nordisk Fonden (NNF22C0079466), el Consejo Europeo de Innovación (101130218-RESYNC), Cancerfonden (23 2932 Pj), el Consejo Sueco de Investigación (2020-00615), la Agencia Sueca de Innovación (2024-02178), ALF (44410), FCT (2022.02338.PTDC) y el Plano de Recuperação e Resiliência de Portugal pelo fundo NextGenerationEU (C644865576-00000005). La Fundación Knut y Alice Wallenberg, la Facultad de Medicina de la Universidad de Lund y la Región de Skåne son reconocidas por su generoso apoyo financiero.

Disponibilidad de materiales:

Las construcciones y vectores utilizados para la reprogramación están disponibles en Asgard Therapeutics en virtud de un acuerdo de transferencia de material con la empresa. Todos los demás datos necesarios para evaluar las conclusiones del artículo están presentes en el texto principal o en los materiales complementarios.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.45 μ m filtro de baja unión a proteínas, filtro de vacío con tapa de botella de 150 mlFisher científico15983297
2-Mercaptoetanol 50 mMThermoFisher Scientific31350010
Anticuerpo monoclonal CD45 anti-ratón (clon: 30-F11), IgG2b de rata, κThermoFisher Scientific14-0451-82
B6. SJL-PtprcaPepcb/BoyCrl (CD45.1)El laboratorio Jackson002014
Jeringas de insulina BD Micro-Fine U-100 (0,5 ml)Fisher Scientific11395751
Ratones C57BL/6JEl laboratorio Jackson000664
Colagenasa DSigma Aldrich11088882001
Colador de células Corning Falcon para usar con tubos cónicos de 50 mlSigma AldrichCLS352340
Cubreobjetos Corning 24 x 50 mm Sigma AldrichCLS2975245
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato)ThermoFisher ScientificD1306
ADNasa ISigma Aldrich10104159001
eBioscience Tinte de viabilidad fijable eFluor 450Invitrogen65-0863-14
eBioscience Solución de recuperación de antígeno IHC - pH bajo (10x)ThermoFisher Scientific00-4955-58
Suero fetal bovino (FBS)ThermoFisher ScientificA5256701
Medio de montaje Fluoromount-GThermoFisher Scientific00-4958-02
Anticuerpo GFP [Alexa Fluor 594]Novus BiologicalsNB600-308AF594
Mezcla de DMEM/nutrientes F-12 de Gibco (DMEM/F-12)ThermoFisher Scientific31331028
Solución de aminoácidos no esenciales Gibco MEM (100x)ThermoFisher Scientific11140035
Gibco Opti-MEM IThermoFisher Scientific11058021
Gibco Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 MediumThermoFisher Scientific52400025
Gibco Piruvato de Sodio (100 mM)ThermoFisher Scientific11360070
Solución de azul de tripano Gibco, 0,4%ThermoFisher Scientific15250061
Suplemento GlutaMAX ThermoFisher Scientific35050061
Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H+L) anti-rata de cabra, policlonal, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-11006
Células HEK 293TATTCCRL-11268
Bromuro de hexadimetrina (polibreno)Sigma AldrichH9268
HyClone Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con glucosa altaCytivaSH30243.01
Solución de estreptomicina de penicilina HyClone 100x (pluma/estreptococo)CytivaSV30010
Solución salina tamponada con fosfato HyClone (PBS)CytivaSH30028.02
Veterinario de ketaminol. Solución inyectable 100 mg/mlMSD Salud Animal SueciaQN01AX03
Hoja de micrótomo - C35PFM Médico207500005
Ratón anti-CD45.2 (104), Superficie, APC, MonoclonalBioleyenda109814
Anti-MHCII de ratón (M5/114.15.2), superficie, PE-Cy7, monoclonalBioleyenda107630
Suero de cabra normalAbcamab7481
Suero de rata normal (estéril)AbcamAB7488
Tubos de polipropileno de pared delgada abiertosCiencias de la vida de Beckman Coulter326823
Paraformaldehído, 16% p/v aq. soln., libre de metanolThermoFisher ScientificModelo 043368.9M
pFUW-tetO-Batf3, un ratón monocistrónico que codifica casetes Batf3Addgene139837
pFUW-tetO-Irf8, un ratón monocistrónico que codifica casetes Irf8Addgene139838
pFUW-tetO-Pu.1, un casete monocistrónico que codifica Pu.1 de ratónAddgene139839
Plásmido pMD2.GAddgene12259
Plásmido psPAX2Addgene12260
Plásmido SFFV-eGFP (eGFP)Clonación interna-
Plásmido SFFV-mCherry (mCherry)Clonación interna-
Plásmido SFFV-PIB-eGFP,  un casete policistrónico que codifica el ratón PU.1, IRF8 y BATF3 (PIB) Clonación interna-Las construcciones y vectores utilizados para la reprogramación están disponibles en Asgard Therapeutics en virtud de un acuerdo de transferencia de material con la empresa
Polietilenimina (PEI), lineal, MW 25000, grado de transfecciónPoliciencias23966
ReadyProbes Pluma de Papanicolaou de barrera hidrofóbicaThermoFisher ScientificR3777
Butirato de sodioSigma Aldrich303410
SacarosaSigma-AldrichS7903
Portaobjetos de microscopio de adhesión SuperFrost PlusEprediaJ1800AMNZ
Compuesto Tissue-Tek O.C.T.Sakura Finetek4583
TrypLE Express Enzyme (1x) sin rojo de fenolThermoFisher Scientific12604021
TT Cryomold Intermedio, cuadrado (15 x 15 x 5 mm)Sakura Finetek4566
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020
Veterinario de Xysol. Solución inyectable 20 mg/mlVM PharmaQN05CM92
Celdas YUMM1.7Antineo

Referencias

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  1. Oliveira, G., Wu, C. J. Dynamics and specificities of T cells in cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 23 (5), 295-316 (2023).
  2. Larkin, J., et al. Five-year survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma. N Engl J Med. 381 (16), 1535-1546 (2019).
  3. Adams, S., et al. Pembrolizumab monotherapy for previously untreated, PD-L1-positive, metastatic triple-negative breast cancer: cohort B of the phase II KEYNOTE-086 study. Ann Oncol. 30 (3), 405-411 (2019).
  4. Patel, M. R., Falchook, G. S., Hamada, K., Makris, L., Bendell, J. C. A phase 2 trial of trifluridine/tipiracil plus nivolumab in patients with heavily pretreated microsatellite-stable metastatic colorectal cancer. Cancer Med. 10 (4), 1183-1190 (2021).
  5. Reardon, D. A., et al. Randomized phase 3 study evaluating the efficacy and safety of nivolumab vs bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: CheckMate 143. Neuro Oncol. 19 (suppl_3), iii21-iii21 (2017).
  6. Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy. Cell. 168 (4), 707-723 (2017).
  7. Heras-Murillo, I., Adán-Barrientos, I., Galán, M., Wculek, S. K., Sancho, D. Dendritic cells as orchestrators of anticancer immunity and immunotherapy. Nat Rev Clin Oncol. 21 (4), 257-277 (2024).
  8. Heras-Murillo, I., et al. Immunotherapy with conventional type-1 dendritic cells induces immune memory and limits tumor relapse. Nat Commun. 16 (1), 3369(2025).
  9. Theisen, D. J., et al. WDFY4 is required for cross-presentation in response to viral and tumor antigens. Science. 362 (6415), 694-699 (2018).
  10. Meiser, P., et al. A distinct stimulatory cDC1 subpopulation amplifies CD8+ T cell responses in tumors for protective anti-cancer immunity. Cancer Cell. 41 (8), 1498-1515.e10 (2023).
  11. Spranger, S., Dai, D., Horton, B., Gajewski, T. F. Tumor-residing Batf3 dendritic cells are required for effector T cell trafficking and adoptive T cell therapy. Cancer Cell. 31 (5), 711-723.e4 (2017).
  12. Hubert, M., et al. IFN-III is selectively produced by cDC1 and predicts good clinical outcome in breast cancer. Sci Immunol. 5 (46), eaav3942(2020).
  13. Mahadevan, K. K., et al. Type I conventional dendritic cells facilitate immunotherapy in pancreatic cancer. Science. 384 (6703), eadh4567(2024).
  14. Ascic, E., Pereira, C. -F. Transcription factor-mediated reprogramming to antigen-presenting cells. Curr Opin Genet Dev. 90, 102300(2025).
  15. Silk, K. M., et al. Cross-presentation of tumour antigens by human induced pluripotent stem cell-derived CD141+ XCR1+ dendritic cells. Gene Ther. 19 (10), 1035-1040 (2012).
  16. Nair, S., Archer, G. E., Tedder, T. F. Isolation and generation of human dendritic cells. Curr Protoc Immunol. Chapter 7, 7.32.1-7.32.23 (2012).
  17. Makino, K., et al. Generation of cDC-like cells from human induced pluripotent stem cells via Notch signaling. J Immunother Cancer. 10 (1), e003827(2022).
  18. Balan, S., et al. Large-scale human dendritic cell differentiation revealing Notch-dependent lineage bifurcation and heterogeneity. Cell Rep. 24 (7), 1902-1915.e6 (2018).
  19. Kirkling, M. E., et al. Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells. Cell Rep. 23 (12), 3658-3672.e6 (2018).
  20. Ascic, E., et al. In vivo dendritic cell reprogramming for cancer immunotherapy. Science. 386 (6719), eadn9083(2024).
  21. Rosa, F. F., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into antigen-presenting dendritic cells. Sci Immunol. 3 (30), 1-16 (2018).
  22. Rosa, F. F., et al. Single-cell transcriptional profiling informs efficient reprogramming of human somatic cells to cross-presenting dendritic cells. Sci Immunol. 7 (69), eabg5539(2022).
  23. Zimmermannova, O., et al. Restoring tumor immunogenicity with dendritic cell reprogramming. Sci Immunol. 8 (85), eadd4817(2023).
  24. Bouquet, L., et al. RapaCaspase-9-based suicide gene applied to the safety of IL-1RAP CAR-T cells. Gene Ther. 30 (9), 706-713 (2023).
  25. Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2. Nat Biotechnol. 26 (11), 1269-1275 (2008).
  26. Rojas, L. A., et al. Personalized RNA neoantigen vaccines stimulate T cells in pancreatic cancer. Nature. 618 (7963), 144-150 (2023).
  27. Guan, J., et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).
  28. Ferreira, A. G., Zimmermannova, O., Kurochkin, I., Ascic, E., Åkerström, F., Pereira, C. F. Reprogramming cancer cells to antigen-presenting cells. Bio Protoc. 13 (22), 1-25 (2023).
  29. Cabrita, R., et al. Tertiary lymphoid structures improve immunotherapy and survival in melanoma. Nature. 577 (7791), 561-565 (2020).
  30. Ng, K. W., et al. Antibodies against endogenous retroviruses promote lung cancer immunotherapy. Nature. 616 (7957), 563-573 (2023).

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