Flujo de trabajo de caracterización de neuropéptidos desde el muestreo hasta la espectrometría de masas de adquisición independiente de datos

Summary

Este protocolo describe un flujo de trabajo neuropeptidómico integral en tejido cerebral de rata que combina la espectrometría de masas de adquisición dependiente de datos, acumulación paralela y fragmentación en serie (DDA-PASEF) y adquisición independiente de datos (DIA).

Abstract

Los neuropéptidos endógenos son moduladores clave de la función cerebral, desempeñando un papel crítico en el comportamiento, el estrés, el dolor y la regulación homeostática, pero su análisis sigue siendo difícil. Biológicamente, son bajos en abundancia, se degradan rápidamente y se procesan de manera variable a partir de proteínas precursoras, con expresión limitada a poblaciones celulares pequeñas y localizadas. Técnicamente, su detección se complica por un amplio rango dinámico, diversas modificaciones postraduccionales y señales escasas en conjuntos de datos de espectrometría de masas. Este protocolo describe un flujo de trabajo integral para el análisis de neuropéptidos en tejido cerebral de Rattus norvegicus utilizando espectrometría de masas (MS) de adquisición dependiente de datos (DDA) y adquisición independiente de datos (DIA) en una plataforma timsTOF. Después de la preparación optimizada de la muestra cerebral, incluida la disección, la extracción de péptidos y la limpieza, se realiza nanocromatografía líquida (LC)-MS con fraccionamiento en fase gaseosa de movilidad iónica para mejorar la sensibilidad y precisión de la detección. La biblioteca espectral generada por DDA admite la cuantificación basada en DIA en Skyline, lo que permite mediciones de nivel MS2 de alta confianza. Este flujo de trabajo integrado aumenta la cobertura de neuropéptidos y mejora la reproducibilidad cuantitativa, proporcionando una plataforma sólida para estudiar neuropéptidos en tejido cerebral complejo.

Introduction

Los neuropéptidos son una clase funcionalmente diversa de moléculas de señalización endógenas que sirven como moduladores críticos de la comunicación neuronal, las funciones del sistema nervioso y neuroendocrino. Actuando como neuromoduladores, hormonas o cotransmisores, influyen en una amplia gama de procesos fisiológicos, incluida la modulación del dolor, la respuesta al estrés, la regulación circadiana y el control del apetito. A diferencia de los neurotransmisores clásicos, que se sintetizan como moléculas pequeñas, los neuropéptidos están codificados dentro de grandes proteínas precursoras que se sintetizan mediante la traducción del ARNm. Las proteínas precursoras, o prohormonas, luego se someten a un procesamiento proteolítico para liberar los péptidos activos, que se empaquetan en vesículas de núcleo denso (DCV). Tras la estimulación, los neuropéptidos se liberan para ejercer efectos moduladores, generalmente más lentos y prolongados a través de interacciones con receptores acoplados a proteínas G. Su importancia en el mantenimiento de la función del sistema nervioso central y periférico los ha convertido en un área de intenso interés biológico y clínico 1,2,3,4,5.

A pesar de su relevancia, los neuropéptidos siguen siendo analíticamente difíciles de caracterizar. Sus estructuras altamente heterogéneas, que van desde secuencias cortas a extendidas, que a menudo llevan diversas modificaciones postraduccionales (PTM) como amidación, acetilación, fosforilación, isomerización de aminoácidos o truncamiento, conducen a la variabilidad en los comportamientos de ionización y fragmentación en espectrometría de masas (MS)1,6,7,8 . Además, suelen estar presentes en bajas concentraciones en relación con los componentes de la matriz biológica, se degradan fácilmente y se localizan de manera espacialmente restringida dentro del tejido complejo del sistema nervioso. Estas características complican tanto la identificación como la cuantificación, particularmente cuando se utilizan enfoques proteómicos tradicionales que se basan en una digestión enzimática predecible y propiedades peptídicas uniformes ^9,10,11.

Aquí, presentamos una estrategia integral para la identificación y cuantificación de péptidos endógenos en el cerebro de Rattus norvegicus, con un énfasis específico en los neuropéptidos. El flujo de trabajo aquí comienza con procedimientos optimizados de muestreo cerebral, seguidos de extensas separaciones de cromatografía líquida (LC), y concluye con un análisis de MS de alta resolución utilizando fragmentación en serie de acumulación paralela (PASEF) en una plataforma de espectrometría de movilidad de iones atrapados (TIMS) 12,13,14,15,16. Al incorporar el fraccionamiento en fase gaseosa de movilidad iónica (IM-GPF) antes de la selección de precursores, el enfoque de adquisición dependiente de datos (DDA-PASEF) permite mejorar la separación de precursores y mejorar la detección de neuropéptidos de baja abundancia, muchos de los cuales de otro modo se perderían en los flujos de trabajo unidimensionales de DDA¹⁷.

Si bien el DDA sigue siendo la estrategia más utilizada en la identificación de péptidos debido a sus espectros MS/MS de alta calidad, está intrínsecamente limitada por su dependencia de la selección de iones precursores por intensidad, lo que sesga contra las especies de baja abundancia 18,19,20. Además, su muestreo semiestocástico conduce a valores faltantes en las réplicas, lo que dificulta la cuantificación reproducible. Para superar estas limitaciones, construimos una biblioteca espectral robusta utilizando nuestros datos DDA-PASEF, que posteriormente se pueden emplear para el análisis de adquisición independiente de datos (DIA). A diferencia de DDA, DIA muestrea todos los iones precursores dentro de ventanas m/z definidas, lo que garantiza un muestreo consistente de péptidos abundantes y raros, y cuando se combina con la biblioteca espectral y el análisis dirigido en Skyline, permite una cuantificación sensible y reproducible a nivel MS2 21,22,23,24.

Este enfoque integrador, que abarca la extracción de péptidos cerebrales, la separación cromatográfica, la adquisición de MS mejorada por movilidad iónica y la cuantificación híbrida basada en DDA / DIA, se desarrolló teniendo en cuenta la complejidad de los neuropéptidos. Maximiza la cobertura de péptidos al tiempo que minimiza la pérdida de datos, abordando las limitaciones clave de una peptidomía impulsada por DDA más simple. Como tal, presentamos una plataforma flexible y poderosa para explorar el panorama de los neuropéptidos en el cerebro de los mamíferos, que se puede adaptar fácilmente a una amplia gama de preguntas experimentales y muestras de tejido.

Protocol

Todos los experimentos con animales en este estudio se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo de uso de animales aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Illinois (23228) con estricto cumplimiento de los estándares nacionales y ARRIVE para el tratamiento y cuidado ético de los animales.

1. Disección de animales y aislamiento cerebral

1. Realice una perfusión salina fría seguida inmediatamente de una congelación instantánea de tejido para preservar la integridad de los neuropéptidos, minimizar los artefactos de degradación y mejorar la calidad de los datos para el análisis peptidómico posterior.
2. Eutanasia a la rata utilizando el método CO₂ siguiendo las pautas institucionales de cuidado animal. Confirmar la muerte por ausencia de latidos cardíacos y falta de reflejos.
3. Coloque la rata en decúbito supino; Hacer una incisión para exponer la cavidad torácica.
4. Hacer una pequeña incisión en el ventrículo izquierdo del corazón.
5. Haga una pequeña incisión en la aurícula derecha para permitir la salida de sangre y solución de perfusión.
6. Inserte una punta de pipeta de plástico cortada a medida unida a una jeringa de 60 ml llena con 50 ml de solución fisiológica helada (p. ej., solución salina al 0,9% o mGBSS) en el ventrículo izquierdo.
7. Perfunde el cuerpo del animal con la solución. Decapita a la rata con unas tijeras afiladas o una guillotina.
8. Retire la piel y el cráneo que recubren el cerebro con rongeurs o tijeras finas.
9. Levante con cuidado el cerebro de la cavidad craneal, cortando los nervios craneales según sea necesario.
10. Congele inmediatamente el cerebro en hielo seco o congele rápidamente en isopentano enfriado en hielo seco.
11. Transfiera a crioviales o papel de aluminio etiquetados, luego guárdelo a -80 ° C.

2. Extracción de péptidos del tejido cerebral de rata

1. Para muestras de cerebro completo, pese cada tejido congelado rápidamente con una balanza analítica. Homogeneice el tejido con una solución de grado LC-MS que contenga un 10% de ácido acético glacial y un 1% de agua en metanol, utilizando una proporción de disolvente-tejido de 10:1 (v/p).
2. Incubar las muestras homogeneizadas en hielo durante 20 min.
3. Centrifugar las muestras a 16.000 × g durante 20 min a 4 °C. Recoja con cuidado el sobrenadante sin alterar el gránulo.
4. Vuelva a suspender el gránulo en agua de grado LC-MS, utilizando una proporción de disolvente a tejido de 10:1 (v/p), y repita la incubación en hielo durante 20 min.
5. Centrifugar de nuevo en las mismas condiciones (16.000 × g, 20 min, 4 °C) y recoger el segundo sobrenadante.
6. Combine ambos sobrenadantes y transfiera 1/10 del volumen total a un nuevo tubo para su procesamiento posterior. Seque esta alícuota con un concentrador de vacío hasta que esté completamente seca. Almacene el extracto restante a -80 °C para su uso futuro.

3. Extracción en fase sólida (SPE) mediante columnas de centrifugación C18

NOTA: Todos los disolventes deben ser de grado LC-MS. A menos que se indique lo contrario, los pasos de centrifugación se realizan a 1.500 × g a temperatura ambiente utilizando una centrífuga de sobremesa.

1. Preparación de reactivos
   1. Preparar la solución de activación (A): acetonitrilo al 50%/ácido fórmico al 50% al 0,1% en agua.
   2. Preparar la solución de equilibrio y lavado (B): ácido fórmico al 0,1% en agua.
   3. Preparar solución de elución (C): acetonitrilo al 50%/50% ácido fórmico al 0,1% en agua.
2. Preparación de muestras
   1. Reconstituir el extracto peptídico seco en 200 μL de solución (B).
   2. Centrifugar la muestra a 16.000 × g durante 10 min a 4 °C.
   3. Recoja con cuidado el sobrenadante para SPE.
3. Acondicionamiento y equilibrio de columnas
   1. Agregue 150 μL de solución (A) a la columna de centrifugación C18.
   2. Centrifugar durante 1 min a 1.500 × g.
   3. Repita los pasos 3.3.1 y 3.3.2 dos veces para garantizar una activación completa.
   4. Añadir 150 μL de solución (B).
   5. Centrifugar durante 1 min.
   6. Repita los pasos 3.3.4 y 3.3.5 dos veces.
4. Carga y lavado de muestras
   1. Cargue 200 μL de la solución de muestra preparada en la columna.
   2. Centrifugar durante 1 min.
   3. Vuelva a cargar el flujo en la columna tres veces para maximizar la retención de péptidos.
   4. Añadir 150 μL de solución (B).
   5. Centrifugar durante 1 min.
   6. Repita los pasos 3.4.4 y 3.4.5 tres veces para eliminar los contaminantes no retenidos.
5. Elución peptídica
   1. Añadir 150 μL de solución de elución (C) a la columna.
   2. Centrifugar durante 1 min.
   3. Repita los pasos de elución 3.5.1-3.5.2 una vez más.
   4. Combine ambos eluidos y guárdelos en hielo o proceda a secar al vacío.

4. Análisis LC-MS/MS

1. Preparar la solución (A): ácido fórmico al 0,1% en agua, solución; (B): 0,1% de ácido fórmico en acetonitrilo, solución; (C): 25 fmol/μL de tiempo de retención estándar (iRT) de ácido fórmico al 0,1% en agua.
2. Vuelva a suspender las muestras en una solución de 20 μl (C) antes de la inyección de LC-MS.
   NOTA: Se analizaron dos muestras biológicas y cada una se inyectó cinco veces para las ejecuciones de DDA y DIA, lo que resultó en cinco réplicas técnicas por método por muestra.
3. Realice la separación de péptidos utilizando un sistema de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), con la fase móvil A que consiste en la solución (A) y la fase móvil B que consiste en la solución (B).
4. Cargue 1 μl de muestras en una columna analítica de veinticinco C18 (150 μm × 250 mm, partículas de 1,9 μm, tamaño de poro de 120 Å) y manténgalas a 40 °C durante todo el proceso.
5. Realice la separación de LC a un caudal de 600 nL/min utilizando el siguiente perfil de gradiente: 0-5 min: 2-10% B; 5-85 min: 10-45% B; 85-87 min: 45-50% B; seguido de un alto lavado orgánico y reequilibrio.
   NOTA: El LC se acopló directamente a una MS timsTOF a través de una fuente de iones.
6. Para el análisis DDA, utilice el método de aplicación predeterminado DDA PASEF-standard_1.1sec_cycletime en timsTOF MS.
   1. Brevemente, opere el espectrómetro de masas en modo PASEF con la exclusión dinámica habilitada. Configure cada ciclo para que conste de 10 escaneos PASEF MS/MS durante un ciclo de trabajo de 1,1 s.
   2. Establezca el rango de masa en m / z 100-1700 y el rango de movilidad iónica de 0,60 a 1,60 V · s / cm², utilizando un tiempo de rampa de 100,0 ms. Aumente la energía de colisión de 20.0 a 59.0 eV en función de la movilidad iónica.
7. Fraccionamiento en fase gaseosa de movilidad iónica (IM-GPF)
   1. Segmente el rango de movilidad iónica de 0,6-1,6 V·s/cm² en tres ventanas superpuestas: 0,6-1,0, 0,9-1,3 y 1,2-1,6 V·s/cm².
   2. Para hacer esto, cambie los valores de inicio y finalización de movilidad en el toque de configuración TIMS de timsControl o timsControl editor a los valores de ventana correspondientes.
   3. Adquiera datos para cada ventana. Para todas las ventanas de adquisición de movilidad iónica, utilice una acumulación constante y un tiempo de rampa de 100 ms.
   4. Adquiera datos en modo DDA-PASEF utilizando los mismos parámetros detallados en el paso 4.6.
8. Para el análisis DIA, emplee un ancho de ventana de aislamiento de 25 m/z en el rango de masa de 400-1200 m/z. Emplee la misma configuración experimental de movilidad iónica (IMEX) utilizada en el método DDA.
   1. Los ajustes adicionales de DIA incluyen una rampa MS1 seguida de 16 rampas MS/MS por ciclo, lo que produce un tiempo de ciclo total de 1,8 s.
   2. Utilice el método proteómico predeterminado DIA-PASEF como plantilla para el desarrollo del método DIA. Después de crear el método DIA, cárguelo en la pestaña de métodos de Hystar. No se requiere la activación del modo DIA.
      NOTA: El método DIA se registrará automáticamente una vez que se cargue correctamente.

5. Tratamiento de datos

NOTA: Después de la adquisición de datos, la identificación de péptidos debe realizarse utilizando herramientas bioinformáticas como PEAKS Online, PEAKS Studio, MSFragger, Maxquant o plataformas similares. Este estudio utilizó Peaks Online, capaz de trabajar con datos sin procesar en formato .d.

1. Búsqueda en bases de datos
   1. Utilice una base de datos de referencia adecuada para las búsquedas de péptidos, como una base de datos de péptidos de señalización de ratas seleccionada, un proteoma de rata o el proteoma humano, o una base de datos de péptidos de señalización seleccionada basada en la fuente de la muestra.
      NOTA: Estas bases de datos se pueden obtener de fuentes confiables como NCBI o UniProt (https://www.uniprot.org/). Tenga en cuenta que solo se identificarán proteínas o péptidos en la base de datos. Los datos de señal de rata se seleccionaron filtrando el proteoma de rata por la anotación "Péptido señal" en UniProt. En términos de Uniprot, filtrar por "péptido señal" significa reducir el proteoma a proteínas involucradas en la secreción, la localización de la membrana o el tráfico compartimental. Esta base de datos personalizada contiene 5630 proteínas. Limitar el tamaño de la base de datos de proteínas de 50.000 a 5.000 ofrece varias ventajas. En primer lugar, mejora la confianza en la identificación al reducir la probabilidad de coincidencias aleatorias de espectro peptídico, lo que aumenta la precisión de las asignaciones de péptidos. En segundo lugar, una base de datos más pequeña mejora la eficiencia computacional, lo que permite tiempos de procesamiento más rápidos y una menor demanda de recursos computacionales. En tercer lugar, una base de datos más concisa puede conducir a un mejor control de la tasa de descubrimiento falso (FDR), lo que resulta en identificaciones de proteínas más confiables y estadísticamente sólidas. Sin embargo, la base de datos debe ser relativamente grande para evitar la inflación artificial de los puntajes de confianza y la estimación inexacta de FDR.
   2. Configure la búsqueda en la base de datos en la GUI del programa con los siguientes parámetros recomendados: Tolerancia a errores de masa precursora: 10-25 ppm; tolerancia al error de masa del fragmento: 0,01-0,05 Da; especificidad enzimática: ninguna (digestión inespecífica); Rango de longitud de péptidos: 4-45 aminoácidos.
   3. Defina el conjunto de PTM que se incluirán en la búsqueda.
   4. Después de completar la búsqueda en la base de datos, exporte los archivos pepxml y mzXML (o MGF) correspondientes a cada ventana de movilidad de iones, incluido el rango de movilidad completo estándar (0,6-1,6 V·s/cm²).
2. Construcción de la biblioteca Skyline
   1. Abra Skyline y cree un nuevo documento, asegúrese de que la interfaz de proteómica esté seleccionada y use la configuración predeterminada a menos que se especifique lo contrario.
   2. Vaya a Archivo > Importar > búsqueda de péptidos.
   3. En el Asistente para la importación de péptidos , seleccione Compilar y agregue los archivos pepxml relevantes (asegúrese de que los archivos mzXML o MGF correspondientes estén en el mismo directorio).
   4. Establezca los péptidos estándar de iRT en Automático, elija DIA como flujo de trabajo y, a continuación, haga clic en Siguiente.
   5. Después de la construcción de la biblioteca, elija aproximadamente 10-15 péptidos como estándares iRT para la alineación entre réplicas. Si se le solicita que vuelva a calibrar iRT, haga clic en Aceptar para continuar.
   6. En la página Extraer cromatogramas , haga clic en Examinar para seleccionar e importar todos los archivos DIA RAW y, a continuación, haga clic en continuar.
   7. En la ventana Configuración de transición , establezca el rango de cargas precursoras en 1-5, el rango de cargas del producto en 1-3, los tipos de iones en ,p,y,b y defina la selección de iones del producto Desde el ion 2 hasta el último ion. Otras configuraciones recomendadas: tolerancia de coincidencia de iones: 0.05 Da, picos para elegir: 5.
   8. En la ventana Configuración de péptidos , establezca modificaciones que coincidan con la configuración de búsqueda de picos descrita en 4.1.3.
   9. En la página Esquema de aislamiento , escriba un nombre para el aislamiento y el esquema y seleccione Ventanas de aislamiento preespecificadas. Haga clic en importar y cargue uno de los archivos DIA para importar automáticamente la configuración de la ventana de aislamiento del experimento.
   10. Establezca la configuración de adquisición de análisis completo con los siguientes parámetros. Método de adquisición: DIA; Analizador de masa de producto: Centroidado; Esquema de aislamiento: Utilice el definido anteriormente; Precisión de masa: 10-20 ppm; Poder de resolución de movilidad: 30-50; Habilite Usar solo escaneos dentro de los 5 minutos posteriores a la RT prevista; Opcionalmente, modifique el filtrado MS1 si es necesario importar cromatogramas MS1. Seleccione un analizador de masas y una resolución adecuados para una extracción óptima del cromatograma MS1.
   11. Importar FASTA y generar señuelos. Establecer método de generación de señuelos: Secuencia aleatoria.
   12. Enzima selecta: la digestión es inespecífica en el análisis de péptidos endógenos. Edite la enzima seleccionando agregar en el menú desplegable de enzimas. Establezca el nombre de la enzima, Tipo en ambos, escinda c-terminal en KR y escinda el N-terminal en KR, permita la semiescisión y haga clic en Aceptar. Establezca los escotes perdidos en 3.
   13. Importe el archivo FASTA de destino y, a continuación, haga clic en Finalizar. Confirme la página de proteínas asociadas si se le solicita.
   14. Asegúrese de que la biblioteca espectral se haya creado correctamente y de que se hayan importado los datos DIA. Inspeccione manualmente la lista de péptidos identificados y proceda con el análisis cuantitativo y cualitativo posterior.
3. Mediciones cualitativas y cuantitativas
   NOTA: Los análisis cualitativos y cuantitativos se realizan en Skyline. Para obtener detalles sobre el análisis de los datos de DIA en Skyline, visite https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorial_dia_swath.
   1. Si se cargan datos DDA, seleccione Configuración > Configuración de transición en el menú, elija DDA en Método de adquisición; en Configuración > Configuración de péptidos, elija Nivel MS 1 para la cuantificación.
   2. Si se cargan datos DIA, Configuración > Configuración de transición, elija DIA en Método de adquisición; En Configuración > Configuración de péptidos, elija Nivel MS 2 para la cuantificación.
   3. En Ver cuadrícula > documento, seleccione Cuantificación de péptidos y, a continuación, Exportar la hoja de cálculo. Combine las hojas de cálculo de los resultados de DDA y los resultados de DIA.
      NOTA: La hoja de cálculo resume las áreas de pico de todos los péptidos de la biblioteca en todas las muestras. En este experimento, las áreas de pico de péptido se normalizaron al péptido estándar de tiempo de retención GISNEGQNASIK, que es parte de la mezcla de tiempo de retención de Pierce. La normalización se realizó calculando la relación entre el área del pico de cada péptido y la del estándar.

Results

En la Figura 1 se muestra un esquema experimental representativo. El análisis de los datos DDA-PASEF (Figura 2) adquiridos utilizando tanto el rango de movilidad iónica estándar como IM-GPF reveló una cobertura peptídica sustancialmente mayor para el enfoque IM-GPF (Figura 2B). En particular, la mayoría de los péptidos identificados utilizando el método estándar DDA-PASEF se superpusieron con los encontrados en el conjunto de datos IM-GPF. Para maximizar la cobertura de identificación de péptidos, se generó una biblioteca espectral completa mediante la integración de identificaciones de ambos enfoques.

Un análisis adicional de la base de datos de conjuntos de datos replicados adquiridos a través de DDA- y DIA-PASEF (Figura 3), utilizando una base de datos de péptidos de señalización de ratas seleccionada, reveló 217 proteínas comunes a ambos métodos. Además, 115 proteínas fueron identificadas de forma única por DIA-PASEF, mientras que 69 eran exclusivas de DDA-PASEF. Los análisis exploratorios que utilizan bibliotecas espectrales derivadas de datos DDA e IM-GPF demostraron que DIA-PASEF permitió la detección confiable de neuropéptidos como NPAFLFQPQRF (neuropéptido SF) e YGGFMRRVGRPEWWMDYQ (derivado de proencefalina). Estos neuropéptidos no se detectaron de manera confiable en los conjuntos de datos DDA-PASEF correspondientes debido a una mala asignación de picos (Figura 3B, C).

Desde una perspectiva cuantitativa, el diagrama de dispersión de la Figura 4A revela una correlación positiva moderada entre la intensidad del precursor de DDA y la intensidad de iones del fragmento de DIA, como se esperaba dado que ambos enfoques cuantifican los mismos péptidos pero capturan diferentes tipos de iones. Los diagramas de caja para péptidos seleccionados que se muestran en la Figura 4B ilustran aún más la reproducibilidad de las mediciones cuantitativas obtenidas por ambos enfoques. Los diagramas de caja muestran las áreas de pico relativas para cada péptido medido por DIA y DDA, con barras de error que representan la variabilidad de la medición entre réplicas técnicas. Los péptidos seleccionados se derivan de prohormonas opioides, incluidas la proencefalina (PENK) y la prodinorfina (PDYN), las cuales desempeñan un papel central en la modulación del dolor y la analgesia.

Figura 1: Descripción general del flujo de trabajo de peptidómica para la identificación y cuantificación de péptidos endógenos del tejido cerebral de rata. El flujo de trabajo incluye disección de tejidos, extracción y purificación de péptidos, adquisición de datos de movilidad de iones LC-MS (LC-IM-MS) mediante fraccionamiento en fase gaseosa (IM-GPF) y procesamiento de datos para generar bibliotecas espectrales y realizar análisis cuantitativos. Partes de la figura se crearon en BioRender. Tan, Y. (2025) https://BioRender.com/vrejrsk. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Identificación de péptidos y proteínas de la base de datos. (A) Gráfico de barras que compara el número total de precursores, coincidencias de espectro peptídico (PSM) y péptidos únicos identificados en diferentes ventanas de movilidad iónica. (B) Gráfico circular que ilustra la proporción de péptidos comúnmente identificados en todas las ventanas de movilidad y los detectados de forma única dentro de las ventanas individuales. (C, C) Mapas de calor que representan la distribución de señales iónicas en las dimensiones m/z y de movilidad iónica para el rango de movilidad completo (0,6-1,6 V·s/cm²) (C) y la ventana de movilidad restringida (0,6-1,0 V·s/cm²) (D). (E) Gráfico alterado que muestra el número de proteínas identificadas en conjuntos de datos adquiridos utilizando métodos DDA y DIA, destacando identificaciones de proteínas compartidas y únicas. (F) Mapa de calor que representa péptidos derivados del precursor de proencefalina identificado en réplicas adquiridas por DIA (panel superior) y réplicas adquiridas por DDA (panel inferior). No se detectó leuencefalina en dos de las cuatro réplicas de DDA, lo que indica posibles valores faltantes en la adquisición basada en DDA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Análisis comparativo y exploratorio de los datos de DDA-PASEF y DIA-PASEF utilizando bibliotecas espectrales. (A) Alineación del tiempo de retención del neuropéptido SF a través de réplicas DIA y DDA-PASEF. (B) EIC de PENK (212-229) fragmenta iones de conjuntos de datos DIA (arriba) y DDA (abajo). (C) Cromatogramas de iones de fragmentos de neuropéptido SF de réplicas DIA que demuestran alta coelución y calidad espectral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Comparación de mediciones cuantitativas entre DIA-PASEF (nivel MS2) y DDA-PASEF (nivel MS1). (A) Este diagrama de dispersión compara las intensidades de señal peptídica obtenidas utilizando los modos DIA y DDA. Específicamente, el eje x representa el área del pico precursor transformado en log₁₀ de DDA, mientras que el eje y muestra el área de pico del fragmento transformado en log₁₀ de DIA para cada péptido. (B) Los diagramas de caja representan las áreas de pico relativas de cuatro péptidos representativos, PENK 107-133, PENK 188-195, PDYN 221-233 y PDYN 235-248. Las barras de error representan la variabilidad entre las réplicas técnicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

En peptidomica, particularmente cuando se analizan péptidos endógenos, preservar el perfil de péptidos nativos es esencial para la integridad de los datos y la interpretación biológica. La perfusión salina fría no solo elimina la sangre, sino que también enfría el cerebro, lo que reduce significativamente la degradación proteolítica postmortem que ocurre rápidamente debido a la actividad de las proteasas endógenas. Al reducir la temperatura cerebral, la actividad enzimática se ralentiza y las proteasas circulantes se eliminan de la vasculatura, al tiempo que se reducen los cambios metabólicos postmortem^25,26. La perfusión con solución salina helada también elimina la sangre de la vasculatura del cerebro. Este paso es especialmente importante, ya que la sangre contiene proteínas de alta abundancia (como albúmina y globulinas) y proteasas circulantes que pueden interferir con la detección de neuropéptidos. La degradación postmortem de abundantes proteínas sanguíneas puede aumentar la complejidad de los extractos de neuropéptidos y enmascarar señales de baja abundancia, comprometiendo en última instancia tanto la identificación como la cuantificación 25,26,27. La congelación inmediata del tejido cerebral, ya sea en hielo seco o mediante congelación instantánea en isopentano refrigerado, detiene los procesos enzimáticos casi instantáneamente. Esta preservación es especialmente importante para detectar neuropéptidos maduros de baja abundancia y longitud completa y garantizar una cuantificación confiable. Sin estos pasos, la degradación de los péptidos puede conducir a una mayor variabilidad y artefactos que comprometen tanto la identificación como la cuantificación. Por lo tanto, la extracción de sangre, la perfusión en frío y el enfriamiento rápido del cerebro son técnicas fundamentales que afectan directamente la calidad, sensibilidad y reproducibilidad de los datos peptidómicos antes de las mediciones.

El análisis de péptidos extraídos del cerebro de rata reveló la presencia de dos plumas de movilidad iónica distintas (Figura 2C, D). Este fenómeno puede atribuirse a diferentes clases moleculares o a diferentes estados de carga de los péptidos. Si las plumas corresponden a distintas clases moleculares, las especies no peptídicas coeluyentes pueden competir con los péptidos por la selección y fragmentación. Además, si la separación surge de diferencias en los estados de carga, se esperaría que la pluma que contiene péptidos altamente cargados produzca espectros MS / MS de mayor calidad, lo que facilita una identificación de péptidos más confiable.

Para investigar esto, implementamos una estrategia de fraccionamiento de movilidad iónica, adquiriendo datos a través de tres ventanas de movilidad discretas: 0.6-1.0, 0.9-1.3 y 1.2-1.6 V·s / cm². Estas ventanas abarcan colectivamente el rango completo de movilidad iónica que normalmente se analiza en los experimentos estándar DDA-PASEF para péptidos. Como se ilustra en la Figura 2, aunque el número total de precursores detectados fue más alto en el rango de exploración completo (0,6-1,6 V·s/cm²), se observó un número significativamente mayor de coincidencias de espectro peptídico (PSM) dentro de la ventana de 0,6-1,0 V·s/cm² . Este hallazgo sugiere que la presencia de dos penachos puede deberse a la interferencia de otras moléculas.

El fraccionamiento de precursores basado en la movilidad iónica dio como resultado un aumento del 30% en la cobertura de péptidos en comparación con el método convencional de escaneo completo. Aproximadamente el 82% de los péptidos identificados en el conjunto de datos de escaneo completo se superpusieron con los péptidos identificados mediante fraccionamiento (Figura 2B), lo que destaca la consistencia y robustez de la estrategia de fraccionamiento. Sobre la base de estas observaciones, empleamos el fraccionamiento de la movilidad iónica y los datos de escaneo completo para construir bibliotecas espectrales para el análisis cuantitativo de péptidos neuroendocrinos utilizando DIA-PASEF.

El análisis de la base de datos de conjuntos de datos replicados adquiridos a través de DDA y DIA reveló un mayor número de identificaciones de péptidos y proteínas en los datos de DIA, incluidas 115 proteínas identificadas de forma única por DIA (Figura 2E). Estos incluyeron neuropéptidos como los péptidos FF y FV relacionados con Pro-FMRFamida. Por el contrario, 69 proteínas fueron identificadas exclusivamente por DDA, muchas de las cuales están asociadas con la adhesión celular y el desarrollo neuronal. Estos hallazgos sugieren que las metodologías DDA y DIA se pueden aplicar de manera complementaria para lograr una cobertura peptídica más amplia.

Un análisis adicional demostró que la adquisición de DIA aborda eficazmente algunos de los problemas de valor faltante que se encuentran con frecuencia en el análisis de péptidos endógenos utilizando DDA. Por ejemplo, la leuencefalina se detectó en solo dos de cada cuatro réplicas de DDA (Figura 2F, panel inferior), mientras que se identificó consistentemente en las cuatro réplicas de DIA (Figura 3F, panel superior).

Skyline, una plataforma ampliamente utilizada para la proteómica cuantitativa, se utilizó para analizar los conjuntos de datos DDA y DIA-PASEF²⁸. El software facilita la identificación de péptidos a través de la coincidencia de bibliotecas espectrales, la coelución de iones de fragmentos y la alineación del tiempo de retención. Para evaluar la capacidad de DIA-PASEF para reducir la identificación faltante, realizamos una evaluación cualitativa de los péptidos detectados exclusivamente en el conjunto de datos DIA.

Como se muestra en la Figura 3D, el neuropéptido SF se detectó consistentemente en todas las réplicas de DIA dentro de la misma ventana de tiempo de retención. La detección en las réplicas de DDA mostró una variabilidad considerable, con tiempos de retención que oscilaron entre 25 min y 45 min (Figura 3A). Las inconsistencias observadas, incluidas las asignaciones erróneas de picos con puntajes de confianza bajos, probablemente se debieron a una cobertura de iones de fragmentos limitada o de baja calidad, como se muestra en la Figura 3B. Por el contrario, la Figura 3C muestra que los iones de fragmento correspondientes al neuropéptido SF estaban bien alineados en todas las réplicas de DIA, lo que respalda una identificación automatizada confiable.

Una comparación de la calidad espectral MS/MS para el péptido PENK (212-229), derivado de la proencefalina, demostró aún más las ventajas de DIA-PASEF. Los espectros obtenidos de DIA exhibieron una mayor intensidad y una mejor calidad de iones de fragmentos en relación con DDA (Figura 3), lo que es particularmente beneficioso para detectar péptidos endógenos de baja abundancia.

El análisis cuantitativo confirmó que DIA-PASEF produjo mediciones consistentes y reproducibles en réplicas biológicas, con un rendimiento comparable al DDA (Figura 4). Además, DIA permitió la cuantificación a nivel de MS2, ofreciendo especificidad a nivel de iones de fragmentos y una mayor confianza en la identificación de péptidos en relación con el DDA basado en MS1. Estos hallazgos respaldan el uso de DIA-PASEF como un enfoque confiable y eficiente para la cuantificación de neuropéptidos dirigidos en matrices biológicas complejas, particularmente cuando la integridad y la reproducibilidad de los datos son críticas.

Este protocolo describe una estrategia integral para el análisis y la cuantificación de neuropéptidos. El enfoque IM-GPF facilita la construcción de bibliotecas espectrales de alta calidad. Si bien DIA-PASEF ofrece una reproducibilidad mejorada y una mayor cobertura de péptidos en comparación con DDA-PASEF, también mejora la cuantificación basada en MS2. La combinación de ambas estrategias de adquisición aumenta la cobertura general de péptidos, ya que cada método contribuye de manera única a la identificación de péptidos distintos (Figura 2E). La limitación de este protocolo es el requisito de un amplio material de muestra para soportar tanto la generación de bibliotecas espectrales como la adquisición de datos a través de los métodos DDA y DIA-PASEF.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% de ácido fórmico en agua	Fisher Scientific	LS118-500	de grado LC/MS
	Fisher Scientific	A11350	Acetonitrilo de grado LC/MS
	Fisher Scientific	AA47138K7	de grado LC/MS
	Fisher Scientific	PI28905	de grado LC/MS
	Fisher Scientific	AA47192K7
nanoELute2	Bruker	N/A
Pierce C18	Fisher Scientific
Mezcla de calibración de tiempo de retención de péptidos Pierce	Thermo Fisher	A11351	SpeedVac de grado LC/MS
	Genevac	https://scientificproducts.com/product_cat/benchtop-solvent-evaporators/	El modelo específico utilizado en este estudio ya no está disponible en el fabricante. Se proporciona un enlace al modelo equivalente actual para
tiempos de referencia Pro2	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-pro-2.html
Water	Fisher Scientific	AA47146M6	grado LC/MS