Artículo de método

SCAnED - Una macro de segmentación de la piel de código abierto para la detección semiautomatizada de células y núcleos en compartimentos epidérmicos y dérmicos de la piel

DOI:

10.3791/68746

⸱

8 de agosto de 2025

 ,  , 
1Department of Dermatology, Medical University of Vienna

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un protocolo semiautomatizado para identificar y cuantificar células inmunes y no inmunes en secciones de piel utilizando SCAnED, una macro gratuita basada en ImageJ para la segmentación de la piel.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La distribución espacial de las células inmunitarias y no inmunitarias dentro de los tejidos y la expresión de marcadores específicos de células proporciona información esencial sobre la función celular in situ. La piel humana es un órgano altamente complejo con compartimentos definidos que comprenden diferentes células con diversos fenotipos. Mediante el uso de etiquetado de fluorescencia múltiple, se pueden determinar y caracterizar aún más distintas poblaciones de células de la piel. Sin embargo, actualmente, la disponibilidad de herramientas no comerciales para el análisis de imágenes de muestras de piel que permiten la segmentación in silico de células específicamente dentro de la epidermis o la dermis a una resolución unicelular es limitada. Aquí proporcionamos un protocolo paso a paso para la tinción de inmunofluorescencia de secciones de piel, microscopía confocal y análisis de imágenes utilizando nuestra herramienta disponible gratuitamente SCAnED (Skin C ompartment Analysis of Epidermis and Dermis). El macro SCAnED permite la identificación y clasificación precisas de células y núcleos en los compartimentos epidérmicos y dérmicos de la piel humana. Proporcionamos pautas sobre cómo determinar los niveles de intensidad promedio de la expresión de maker en diferentes células y compartimentos celulares, como el citoplasma y el núcleo, y cómo cuantificar las células que expresan cantidades variables de estos marcadores con una canalización de Python adjunta proporcionada como un cuaderno de Jupyter listo para usar ejecutado en Google Colab. Este protocolo permitirá a los usuarios sin experiencia determinar los perfiles de expresión específicos de las células dentro del tejido cutáneo y proporcionar información sobre la distribución espacial de las células dentro de los compartimentos epidérmicos y dérmicos, lo que permitirá una comprensión más profunda de la intrincada estructura tisular y la composición celular de la piel humana.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Comprender los tejidos de la piel a nivel celular y discernir los fenotipos celulares, la morfología y su localización dentro de los compartimentos epidérmico y dérmico son fundamentales en la investigación dermatológica y la histopatología 1,2. La composición celular dentro de la epidermis, que abarca queratinocitos, melanocitos y células de Langerhans en condiciones saludables, se desequilibra enormemente en las enfermedades inflamatorias de la piel y el cáncer. Además, el fenotipo y la localización de las células dentro de la dermis, situadas debajo de la epidermis y que albergan fibroblastos y la mayoría de las células inmunitarias, pueden cambiar significativamente en la enfermedad. Por lo tanto, la segmentación celular y de los núcleos es imperativa para evaluar los atributos celulares, como el número de células, la expresión de proteínas, la morfología y la organización espacial, y las características del núcleo, como el tamaño, la forma y la expresión del factor de transcripción, lo que ayuda a comprender la homeostasis y las enfermedades de la piel 3,4,5.

A pesar de la disponibilidad de plataformas de análisis de imágenes de uso general como QuPath6, CellProfiler7 e ilastik8, estas herramientas a menudo requieren una amplia personalización y secuencias de comandos para adaptarse a la complejidad estructural y la morfología celular heterogénea del tejido cutáneo. Pocas herramientas se han diseñado específicamente para la segmentación automatizada de los compartimentos epidérmicos y dérmicos, y muchas soluciones disponibles son comerciales y no son de libre acceso. Estas limitaciones dificultan que los no expertos implementen canalizaciones eficientes para el análisis específico de la piel.

Aquí, presentamos un protocolo completo para el análisis de células y núcleos dentro del tejido de la piel y sus compartimentos, que cubre todos los pasos vitales, desde la tinción de tejidos hasta el análisis de imágenes, utilizando nuestra línea de análisis de imágenes semiautomatizada. Comenzamos con información detallada sobre la tinción de inmunofluorescencia del tejido cutáneo, incluida la tinción con E-cadherina para la segmentación de la epidermis/dermis y 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para la detección de células/núcleos. Se incluyeron dos marcadores de interés, Vimentin (VIM) y CD90, para fines de validación. Recomendamos usar anticuerpos en concentraciones optimizadas (ver Tabla 1) y capturar imágenes usando microscopía confocal con configuraciones consistentes para la intensidad del láser, el tiempo de exposición y la resolución para garantizar la reproducibilidad.

Además, presentamos nuestro macro SCAnED ImageJ9 diseñado a medida, que significa Skin Compartment Analysis de Epidermis y Dermis, y proporcionamos todos los pasos necesarios para la segmentación in silico y la detección de núcleos y células tanto dentro de la epidermis como en la dermis. Los usuarios pueden elegir entre dos métodos diferentes de detección de núcleos, ya sea utilizando umbrales simples y rápidos o la herramienta de aprendizaje profundo StarDist10 y nuestro modelo de piel entrenado, antes de continuar con el protocolo SCAnED. A diferencia de las herramientas generales, SCAnED se desarrolló específicamente para la histología de la piel y las supera al permitir la compartimentación automática de las regiones epidérmicas y dérmicas y la cuantificación integrada de múltiples marcadores en ambas regiones. Esto es particularmente útil para los investigadores que carecen de experiencia en programación o aprendizaje profundo, ya que ofrece una herramienta lista para usar diseñada para el análisis de imágenes de la piel.

Además, mostramos cómo se extraen los niveles medios de intensidad por célula a partir de imágenes de inmunofluorescencia de hasta cinco marcadores distintos de interés. Finalmente, proporcionamos un código Python para el análisis estadístico de los datos unicelulares obtenidos escritos y ejecutados en Google Colab11 y compartidos como un cuaderno de Jupyter. Nuestro protocolo y la macro SCAnED tienen como objetivo proporcionar a los investigadores de la piel sin experiencia avanzada en inmunofluorescencia e informática una herramienta práctica para etiquetar y cuantificar de forma semiautomática las células y la expresión de marcadores en la piel humana, centrándose en los compartimentos epidérmicos y dérmicos.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Marcaje de inmunofluorescencia de E-cadherina, VIM y CD90 y tinción nuclear con DAPI en secciones de piel incluidas en parafina

NOTA: El protocolo muestra los pasos para las secciones incluidas en parafina. Para muestras de tejido fresco y congelado, fije las secciones de tejido y continúe con el paso 1.3 del protocolo.

  1. Derrita la parafina con un ventilador o un horno.
  2. Rehidratar secciones pasando a través de alcoholes clasificados con contenido de agua creciente (p. ej., xileno → etanol al 100% → etanol al 85% → etanol al 70% → agua).
  3. Realice los pasos de recuperación de antígenos según corresponda para los antígenos.
  4. Permeabilizar secciones de tejido con Tritón X al 0,3% en PBS (3 x 20 min) (ver Tabla 2).
  5. Lave los portaobjetos con PBS (1 x 5 min).
  6. Rodee cada muestra con un rotulador hidrofóbico para evitar derrames de líquidos y minimizar el volumen de reactivos y dejar secar.
  7. Aplicar anticuerpos primarios (tampón para Abs: PBS + 2% BSA) (ver Tabla 1 y Tabla 2). Coloque los portaobjetos en una caja de cámara humidificada (caja húmeda) e incube durante la noche.
  8. Lave los portaobjetos con Triton X al 0,3% en PBS (3 x 5 min).
  9. Elimine el exceso de detergente lavando los portaobjetos con PBS (1 x 5 min).
  10. Aplicar anticuerpos secundarios y suero de cabra (ver Tabla 1). Incube los portaobjetos en un lugar oscuro durante 1 h.
  11. Lave los portaobjetos con Triton X al 0,3% en PBS (3 x 5 min).
  12. Elimine el exceso de detergente lavando los portaobjetos con PBS (1 x 5 min).
  13. Agregue DAPI para la tinción de núcleos (consulte la Tabla 1). Incube los portaobjetos en un lugar oscuro durante 30 min.
  14. Lave los portaobjetos con Triton X al 0,3% en PBS (3 x 5 min).
  15. Lave los portaobjetos con PBS (1 x 5 min).
  16. Aplique 1 gota (~5-15 μL) de medio de montaje de fluorescencia sobre cada muestra y coloque cuidadosamente los cubreobjetos (elimine las burbujas si es necesario). Deje que los portaobjetos se sequen en la oscuridad.
Anticuerpos y coloranteConcentración de trabajoDilución
anticuerpo anti-vimentina0,8 μg/ml1:50
anticuerpo anti-E-cadherina1 μg/ml1:333
anticuerpo anti-CD901:1000
AF488 anti-ratón1:500
AF568 anti-conejo1:500
AF647 anti-ratón1:500
DAPI1 μg/ml

Tabla 1: Anticuerpos y colorante.

1. Tampón de tinción
ReactivoConcentración finalImporte
BSA2%1 gramo
PBS1x50 ml
TotalN/A50 ml
2. Tampón de permeabilización
ReactivoConcentración finalImporte
Tritón X0.30%300 μL
PBS1x100 ml
TotalN/A100 ml

Tabla 2: Recetas para soluciones.

2. Imágenes confocales

NOTA: Para este protocolo, se utilizó un microscopio de barrido láser confocal, equipado con un objetivo de 10x (NA 0,4) y 4 líneas láser (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).

  1. Adquiera imágenes con un microscopio de fluorescencia (vea la imagen de ejemplo en la Figura 1).
  2. Utilice el siguiente parámetro de tamaño de escaneo para crear la macro, entrenar el modelo StarDist e idealmente para la adquisición de imágenes: Tamaño de imagen = 4.096 x 4.096 píxeles (o 1.273 x 1.273 micras), profundidad de bits = 16 bits, tamaño mínimo de píxel = 0,3 micras, relación señal-ruido (SNR) = mínimo de 3.

figure-protocol-1
Figura 1: Tinción de inmunofluorescencia de la sección de piel. DAPI: marca núcleos, CD90: marcador de fibroblastos, E-cadherina: se usa para marcar la epidermis, VIM: células que expresan VIM, Fusión: Fusión de tinción DAPI (magenta), CD90 (azul), E-cadherina (amarillo) y VIM (verde). Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Análisis de imágenes utilizando la macro SCAnED (Archivo complementario 1, Vídeo complementario S1 y Vídeo complementario S2)

  1. Inicie la macro (SCAnED.mp4 película).
    1. Abra imágenes de inmunofluorescencia en Fiji/ImageJ utilizando bioformatos con la configuración predeterminada.
      NOTA: No divida los canales en este paso.
    2. Descargue y ejecute la macro SCAnED navegando a Plugins | Macros | Ejecute y seleccione el script de macro SCAnED (archivo complementario 1).
    3. Siga las instrucciones paso a paso en pantalla proporcionadas por la macro.
  2. Segmentación in silico de la epidermis y la dermis mediante el macro SCAnED.
    1. Seleccione el canal E-cadherin cuando se le solicite.
    2. Ajuste el umbral manualmente navegando a Imagen | Ajustar | Umbral y haga clic en Aceptar para que el canal de E-cadherina capture completamente la región epidérmica.
    3. Si es necesario, confirme el paso Relleno de inundación para cerrar los huecos en la máscara de E-cadherina seleccionando el icono de la herramienta Relleno de inundación en ImageJ, haciendo clic en la parte superior de la epidermis y haciendo clic en Aceptar (Figura complementaria S1A-E y consejos para la resolución de problemas en la sección de discusión).
    4. Si la máscara está invertida, seleccione Sí y Aceptar cuando se le pida que invierta la selección; de lo contrario, seleccione No y Aceptar (consulte la Figura complementaria S1F, G y sugerencias de solución de problemas en la sección de discusión).
    5. Seleccione el canal DAPI cuando se le solicite. Las imágenes de los núcleos antes y después de la segmentación epidérmico-dérmica se muestran en la Figura 2.
  3. Segmentación de núcleos mediante la función de umbral
    1. Definir automáticamente los niveles de intensidad.
  4. Segmentación de núcleos usando StarDist
    1. Abra StarDist en ImageJ (Figura 3).
    2. Cargue el modelo de detección de núcleos (archivo complementario 2) en la GUI de StarDist (Figura 4). El par de entrenamiento correspondiente para crear el modelo StarDist se muestra en la Figura complementaria S2.
      NOTA: Tensor Flow versión 1.15 debe usarse para este modelo si se produce un error StarDist (consulte la Figura complementaria S3).
    3. Haga clic primero en el canal de núcleos.
    4. Ajuste la configuración de los mosaicos en consecuencia (asegúrese de que el número de mosaicos coincida con el tamaño de parche esperado (256 x 256 px) (consulte la Figura 3 y la Figura 4).
      NOTA: La segmentación de StarDist puede llevar tiempo dependiendo del número de núcleos.
  5. Medición de intensidad y cuantificación de proteínas nucleares
    NOTA: Antes de ejecutar SCAnED, vaya a Analizar | Establezca Mediciones y configure los parámetros para garantizar una salida de datos precisa y relevante (Figura 5).
    1. Cuando se le solicite, seleccione Sí para medir la intensidad del marcador en los núcleos.
    2. Elija el canal de marcador adecuado (hasta cinco posibles).
    3. Guarde los resultados como archivos CSV según las instrucciones de la macro.
    4. Repita para cada canal.
    5. Después de procesar todos los canales, guarde los resultados como archivos CSV según las instrucciones de la macro.
      NOTA: Para una mejor visualización, incluimos una vista ampliada de una región específica de la piel para el resto del análisis (Figura 6).
  6. Segmentación celular (región citoplasmática)
    NOTA: La segmentación celular se basa en la expansión del ROI nuclear y, por lo tanto, debe iniciarse después de la segmentación de los núcleos.
    1. Cuando se haya utilizado la función de umbral para la segmentación de núcleos, aplique dilatación binaria.
    2. Cuando se ha utilizado StarDist para la segmentación de núcleos, use la expansión de ampliación, que tiene un tiempo de procesamiento más largo (consulte la Figura complementaria S4).
  7. Medición de intensidad y cuantificación de proteínas citoplasmáticas
    1. Seleccione Sí para medir la intensidad del marcador en celdas completas.
    2. Guarde los archivos CSV resultantes según las instrucciones de la macro.
    3. Repita para cada canal de marcador en orden.
    4. Mantenga el mismo orden de canales para las mediciones de núcleos y células para mantener la coherencia en los datos de salida.
    5. Elija Descartar siempre que la macro lo solicite, para evitar mezclar datos de núcleos entre la epidermis y la dermis. La figura 7 ilustra todos los pasos de la segmentación basada en umbrales.

figure-protocol-2
Figura 2: Análisis y separación de núcleos específicos de canal en núcleos epidérmicos y dérmicos. La tinción de inmunofluorescencia de DAPI demuestra la morfología y la distribución espacial de los núcleos en toda la piel (imagen de la izquierda). Representación del canal de núcleos de núcleos epidérmicos teñidos con DAPI, lo que proporciona información sobre la distribución de los núcleos dentro del compartimento epidérmico (imagen central). Representación del canal de núcleos de núcleos dérmicos teñidos con DAPI, que ofrece visualización de la distribución de los núcleos dentro del compartimento dérmico (imagen derecha). Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-protocol-3
Figura 3: Utilización de la opción "StarDist". Captura de pantalla que resalta la ubicación de la opción "StarDist 2D" dentro del menú/Plugins/StarDist/StarDist 2D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-protocol-4
Figura 4: Instrucciones para usar el modelo de detección de núcleos. Descargue el archivo "nuclei_detection_model.zip" y proporcione su ruta de acceso en la sección Examinar . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-protocol-5
Figura 5: Configuración de los ajustes de medición. (A) Captura de pantalla que resalta la ubicación de la opción Establecer medidas dentro del menú, lo que permite la personalización de los parámetros de medición para su posterior análisis. (B) Cuadro Establecer medidas que muestra la interfaz para ajustar la configuración de medición, lo que permite a los usuarios especificar parámetros para la recopilación y el análisis de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-protocol-6
Figura 6: Vista ampliada de una región específica. (A) Fusión de tinción DAPI (magenta) y VIM (verde). (B) Vista ampliada de una región específica desde A, que proporciona una visualización detallada de la expresión de VIM dentro del tejido de la piel. Tenga en cuenta la diferente morfología de los núcleos dentro de la epidermis y la dermis. Barras de escala = 100 μm (A), 20 μm (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-protocol-7
Figura 7: Segmentación SCAnED en epidermis y dermis para núcleos y células mediante el uso de umbral. (A) Imagen completa: Fusión de tinción DAPI (magenta) y VIM (verde). Parte superior: (B) Fusión de núcleos epidérmicos teñidos con DAPI y VIM después de la separación. (C) Máscara de núcleos epidérmicos mediante el uso de umbral. (D) Segmentación de núcleos epidérmicos superpuestos a la fusión de DAPI y VIM, lo que ayuda en la visualización de la distribución de núcleos dentro del compartimento epidérmico. (E) Segmentación celular de núcleos epidérmicos superpuestos a la fusión de DAPI y VIM, lo que ayuda en la visualización de la distribución de núcleos dentro del compartimento epidérmico mediante el uso de umbral y dilatación, ya que muestra que la región de selección es más grande que los núcleos. Parte inferior: (F) Fusión de núcleos dérmicos teñidos con DAPI y VIM después de la separación. (G) Máscara de núcleos dérmicos mediante el uso de umbral. (H) Segmentación de núcleos dérmicos superpuestos a la fusión de DAPI y VIM, lo que ayuda en la visualización de la distribución de núcleos dentro del compartimento dérmico. (I) Segmentación celular de núcleos dérmicos superpuestos a la fusión de DAPI y VIM, lo que ayuda en la visualización de la distribución de núcleos dentro del compartimento dérmico. Barras de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Clasificación y visualización de datos extraídos de una sola célula (Video complementario S3)

NOTA: Cada marcador de inmunofluorescencia genera dos archivos CSV: uno para el compartimento epidérmico y otro para el compartimento dérmico.

  1. Establecer umbrales de intensidad específicos de marcadores utilizando muestras de control de isotipos.
    1. Importe los archivos de salida CSV generados por la macro SCAnED en Google Colab mediante el Jupyter Notebook proporcionado. Al principio, descargue el Jupyter Notebook apropiado (por ejemplo, Archivo complementario 3 o Archivo complementario 4), vaya a Google Colab (https://colab.research.google.com/), haga clic en Archivo, abra el cuaderno, seleccione el archivo, ejecute las celdas de código una por una. Cuando se le solicite Elegir archivos, haga clic en el botón y cargue el archivo .csv.
    2. Para cada anticuerpo, calcule la intensidad media de fluorescencia de los controles de isotipo. Para determinar el punto de corte de cada anticuerpo, abra el bloc de notas de DotPlot (archivo complementario 4), cargue el archivo de control de isotipo correspondiente y ejecute el código.
    3. En función de la distribución de puntos en el control de isotipo y los gráficos de anticuerpos específicos, elija un umbral de intensidad adecuado para separar el fondo (control de isotipo) de la señal (tinción específica). Utilice estos valores como valores de corte para clasificar las celdas individuales como positivas o negativas para la expresión del marcador.
  2. Compare las intensidades de los marcadores en muestras experimentales con los umbrales calculados.
    1. Clasifique las celdas con umbral de intensidad ≥ como positivas.
    2. Clasifique las celdas con umbral de intensidad < como negativas.
    3. Clasifique las subpoblaciones en función de combinaciones de expresión de marcadores, por ejemplo, identifique poblaciones celulares positivas simples, dobles positivas o triplemente positivas.
  3. Visualice la distribución y las relaciones de la expresión de marcadores utilizando dos tipos de gráficos:
    1. Cree histogramas y superponga histogramas para comparar la distribución de intensidad entre condiciones (por ejemplo, piel de control frente a piel enferma) ejecutando el código del histograma (descargue el archivo complementario 3, vaya a Google Colab (https://colab.research.google.com/), haga clic en Archivo, abra el cuaderno, seleccione el archivo, ejecute el código) (Figura 8).
    2. Cree diagramas de puntos para simular diagramas de dispersión de estilo de citometría de flujo para evaluar patrones de coexpresión ejecutando el código de DotPlot (descargue el archivo complementario 4, vaya a Google Colab (https://colab.research.google.com/), haga clic en Archivo, abra el cuaderno, seleccione el archivo, ejecute el código) (Figura 9).
    3. Exporte datos procesados para análisis adicionales y evaluación de diferencias significativas mediante pruebas estadísticas.

figure-protocol-8
Figura 8: Histograma de superposición que compara la intensidad media de las células positivas para VIM. Superposición de histograma que compara la intensidad media de las células VIM en muestras sanas (H) en azul y muestras de psoriasis (P) en naranja dentro de la dermis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-protocol-9
Figura 9: Señales dobles positivas en un diagrama de puntos. Una demostración del diagrama de puntos de doble tinción que puede ayudar a una mejor visualización de poblaciones positivas simples, dobles positivas y dobles negativas. Este ejemplo muestra la doble tinción de CD90 y VIM en la dermis de (A) piel sana y (B) psoriasis, y en la epidermis de (C) muestras de piel sana y (D) psoriasis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En un estudio anterior, utilizamos con éxito SCAnED para detectar y cuantificar células y niveles de expresión de lisil oxidasa (LOX), una proteína citoplasmática, y el factor de transcripción factor 1 inducible por hipoxia (HIF-1) en células dentro de la dermis de la piel humana12 , destacando la aplicabilidad de esta herramienta para la investigación de la piel.

Para evaluar aún más la precisión de nuestra macro segmentación de la piel en la identificación de células ...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo SCAnED es un método semiautomatizado para el análisis de compartimentos específicos de células inmunes y no inmunes en tejido de piel humana. El flujo de trabajo integra un protocolo de tinción basado en E-cadherina para permitir la segmentación de la epidermis y la dermis, la detección de núcleos y células basada en DAPI, seguida de la cuantificación de la expresión de marcadores en núcleos y células utilizando nuestra macro basada en ImageJ. Además, guiamos a los usuarios ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El desarrollo de esta línea de análisis de imágenes fue financiado por el Land Niederösterreich como parte del Grupo de Investigación de la Alergia del Danubio y por el Fellinger Krebsforschung.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,3% Triton X Sigma-AldrichT9284
BSA (albúmina sérica bovina)Sigma Aldrich
CD90Señalización celularD3V8A
DAPI Roche10236276001
Agua desionizada
E-cadherina Abcamab1416
Medio de montaje por fluorescencia  DakoS3023
Anticuerpo secundario anti-ratón IgG1 adsorbido cruzadamente, Alexa Fluor 488  (AF 488 anti-ratón)Thermo Fisher ScientificA-21121
Anticuerpo secundario anti-ratón IgG2a adsorbido cruzadamente, Alexa Fluor 647 (AF 647 anti-ratón)Thermo Fisher ScientificA-21241
Anticuerpo secundario adsorbido cruzado anti-conejo IgG (H+L), Alexa Fluor 568 (AF 568 anti-conejo)Thermo Fisher ScientificA-11011
Suero de cabra Agilent Technologies & Ouml; sterreich GmbH, DakoX0907
PBS Gibco14190-094
Vimentin DakoM7020
Materiales
Caja de cámara (caja húmeda)
Portadas y boletos de portada;Thermo Fisher
Rotulador deslizante repelente de líquidos para teñir (hidrofóbico) y nbsp;Daido SangyoZ37782124x50mm
Soluciones
Buffer de permeabilización (0,3% Tritón X en PBS) & nbsp;Consulte la Tabla 2
Amortiguador de tinción (2% BSA en PBS) y nbsp;Consulte la Tabla 2
software y conjuntos de datos
microscopio láser de barrido confocal  OlimpoFV3000 basado en el IX83 invertidoequipado con un objetivo de 10x (NA 0,4), 4 líneas láser (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm, Coherente)
Fiyi (ImageJ) V1.54h
Google ColabGoogle
GraphPad Prism GraphPad Software Inc.Prisma 10para un análisis estadístico adicional
HALOIndica Labs
Programa en PythonPython 3.11.12
QuPathsoftware abierto (Bankhead, P. et al, https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5)v0.5.1
StarDistInstalar la versión de CPU de TF1.15.0

Referencias

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