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Artículo de método

Preparación de distribuciones de cromosomas meióticos de ovocitos de ratón para la evaluación de la sinapsis y la recombinación

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DOI:

10.3791/68749

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18 de julio de 2025

1Department of Biomedical Sciences, Cornell University, 2Cornell Reproductive Sciences Center, Cornell University

En este artículo

Resumen

Los errores meióticos en las sinapsis y la recombinación son comunes en los ovocitos de mamíferos. El análisis riguroso de las proteínas involucradas en estos procesos es esencial para comprender cómo y por qué la ovogénesis a menudo sale mal. Las técnicas aquí presentadas permiten un seguimiento exhaustivo de la recombinación y las sinapsis para evaluar la calidad de los ovocitos en ratones.

Resumen

Tres procesos críticos e interdependientes definen la profase I meiótica: los cromosomas homólogos deben emparejarse, se forma una estructura proteica llamada complejo sinaptonémico para unir a los homólogos (sinapsis), y los homólogos experimentan una recombinación, intercambiando recíprocamente material genético para formar cruces (CO). Los errores en estos procesos pueden dar lugar a insuficiencia ovárica prematura, aneuploidía y, en última instancia, pérdida del embarazo e infertilidad. La recombinación meiótica es particularmente propensa a errores en los ovocitos, ya que más del 7% de los ovocitos humanos contienen al menos un par de cromosomas sin cruzamiento, y entre el 20% y el 80% de los óvulos frente al 2,5%-7% de los espermatozoides son aneuploides. Sin embargo, no está claro por qué los errores cromosómicos muestran disparidades sexuales tan llamativas. El presente protocolo describe los métodos para la preparación y el análisis de las diseminaciones de los cromosomas de profase I y metafase I de los ovocitos en ratones fetales y juveniles, respectivamente. Para rastrear la dinámica cromosómica crítica a lo largo de la profase I meiótica, este protocolo emplea la tinción por inmunofluorescencia de marcadores comunes para la recombinación meiótica (RAD51 para roturas de doble cadena, MSH4 para intermediarios de CO y MLH1/MLH3 para identificar la mayoría de los CO) y sinapsis (SYCP3 para los ejes cromosómicos, SYCP1 para las regiones sinapsadas y HORMAD1 para las regiones asinapizadas). Además, este protocolo utiliza la maduración in vitro de los ovocitos recolectados para evaluar el número de cromosomas emparejados (bivalentes) y el número total de entrecruzamientos (quiasmas) en la metafase I. Juntas, estas técnicas proporcionan un marco integral y cuantitativo para examinar los mecanismos que regulan la dinámica cromosómica temprana en la meiosis femenina.

Introducción

La meiosis es una división celular especializada esencial para la producción de gametos haploides. Durante la profase I, los cromosomas homólogos (cada uno formado por cromátidas hermanas unidas por cohesina) deben cumplir tres tareas críticas: 1) reconocerse y emparejarse entre sí, 2) unirse formando el complejo sinaptonémico (SC) entre sus ejes laterales, y 3) intercambiar ADN a través de la recombinación homóloga, lo que resulta en cruces (CO) entre cromátidas no hermanas 1,2. La conexión física resultante de la formación de cruzamientos, mantenida por la cohesina, asegura la correcta biorientación y segregación cromosómica durante la metafase I 3,4,5.

La profase I meiótica comprende cinco etapas, cada una definida por el estado de la sinapsis6. En el leptonema (hilo fino en griego), los cromosomas se condensan a medida que el elemento axial (marcado por SYCP3) se forma a lo largo de los ejes cromosómicos. Durante el zygonema (hilos unidos), los homólogos comienzan a hacer sinapsis cuando el elemento transversal del SC (SYCP1) se forma entre los ejes7. En el pachynema (hilo grueso), los cromosomas están sinapsados a lo largo de toda su longitud. Luego, el SC se desmonta durante el diplonema (dos roscas), dejando homólogos conectados solo en los sitios de cruce (quiasmas). Los chiasmas son el producto de la recombinación homóloga, un proceso iniciado con la inducción programada de roturas de doble cadena (DSB) en el ADN. De cientos de DSB, solo ~10% se convierten en CO. En ratones, la mayoría (90%-95%) se forma a través de la vía de CO de clase I facilitada por MutLγ (MLH1-MLH3), y los COs restantes producidos por MUS81-EME1 a través de la vía de CO de clase II 8,9,10,11.

El apareamiento, la sinapsis y la recombinación son procesos altamente regulados e interdependientes. Los errores suelen desencadenar mecanismos de puntos de control, lo que conduce a la muerte de la célula. En las mujeres, la pérdida de células germinales por errores tempranos de la profase I puede causar insuficiencia ovárica prematura12,13, mientras que los errores tardíos (p. ej., homólogos que no forman CO, mala colocación de CO o pérdida prematura de cohesina) pueden conducir a una segregación cromosómica incorrecta y aneuploidía. En los seres humanos, los errores meióticos son una de las principales causas de pérdida del embarazo e infertilidad. La meiosis femenina es particularmente propensa a errores. Alrededor del 20%-80% de los óvulos humanos (frente al 2,5%-7% de los espermatozoides) tienen números cromosómicos anormales, la mayoría como resultado de errores en la primera división meiótica 14,15,16,17. Aunque la edad se ha identificado como la principal causa de aneuploidía materna, la razón por la que los ovocitos son tan susceptibles a los errores sigue sin estar clara.

A pesar de la importancia de comprender los factores que subyacen a las altas tasas de error en los ovocitos, la mayor parte de nuestro conocimiento sobre la regulación de los eventos de profase I proviene de estudios sobre la meiosis masculina. Debido a que un pequeño fragmento de material testicular adulto proporciona suficiente material para evaluar todas las etapas de las células germinales meióticas y postmeióticas, la meiosis masculina ha sido durante mucho tiempo más accesible para los investigadores. Por el contrario, la meiosis femenina se presenta de forma discontinua. En ratones, la profase I progresa de forma semisincrónica en el ovario fetal, comenzando alrededor de 14 días después del coito (dpc; Figura 1A), poco después de la determinación del sexo gonadal 18,19,20. Alrededor del momento del nacimiento, los ovocitos entran en detención de dictiato hasta meses de ovulación (en ratones) o décadas (en humanos) más tarde 21,22,23. En consecuencia, los estadios específicos de la profase I son accesibles solo durante ventanas de desarrollo limitadas (Figura 1A), y los eventos posteriores a la profase I ocurren solo en unos pocos ovocitos a la vez en el juvenil y el adulto. Aunque los avances técnicos han mejorado los estudios de meiosis de ovocitos en mamíferos, estos métodos siguen siendo difíciles y lentos en comparación con técnicas comparables utilizadas en estudios masculinos.

El análisis meiótico femenino se complica aún más por la limitación en la subestadificación de los ovocitos paquiteno, fundamental para estudiar la designación y maduración cruzadas. Los estudios masculinos se benefician de una dinámica de apareamiento de cromosomas sexuales bien caracterizada y de la presencia de la variante de histonas, H1t, que sirven como marcadores de paquinema temprano, medio y tardío 24,25,26. Sin embargo, no se ha formalizado un método fiable para la subestadificación de los ovocitos paquiteno.

Los protocolos presentados aquí facilitan un análisis exhaustivo de la sinapsis y la recombinación en ovocitos de ratón desde la profase I temprana hasta la metafase I. Este trabajo se basa en las técnicas clásicas de dispersión cromosómica desarrolladas por Peters et al.27 y Tarkowski28 y en los refinamientos previos de esos métodos por Hunt29 y Sun y Cohen30. Este protocolo se ha desarrollado para enfatizar: 1) el enriquecimiento e identificación de subetapas específicas de la profase I, 2) la maximización del número de aplicaciones realizadas por par de ovarios fetales, y 3) métricas exhaustivas y accesibles para la evaluación de defectos de sinapsis y recombinación de focos a quiasmas.

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Protocolo

Todo el manejo y los procedimientos de los animales se realizaron después de la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Cornell (IACUC) según el protocolo 2004-0063.

1. Preparación del portaobjetos de propagación del cromosoma de profase I del ovocito

  1. A última hora de la tarde, establezca apareamientos cronometrados de ratones hembra C57BL/6J (de 2 a 6 meses de edad) con machos (de 2 a 12 meses de edad). A partir del día siguiente, revise a las hembras cada mañana (antes de las 9 a.m.) para ver si tienen un tapón copulatorio. El mediodía del día del enchufe se define como 0,5 dpc.
  2. Prepare lo siguiente antes de sacrificar ratones preñados.
    1. Configure una cámara humidificada con temperatura ambiente H2O.
    2. Prepare 10 mL de tampón de extracción hipotónica (HEB; ver Tabla 1) que consiste en 30 mM de Tris-HCl, 50 mM de sacarosa, 17 mM de citrato de sodio, 5 mM de EDTA, 2,5 mM de DTT y 0,5 mM de PMSF en agua Milli-Q. Antes de agregar DTT y PMSF, ajuste el pH a 8.2 - 8.4 usando 50 mM de ácido bórico. Haga HEB fresco y úselo dentro de las 2 horas posteriores a la adición de DTT.
    3. Prepare 100 mM de sacarosa añadiendo 342 mg de sacarosa a 10 mL de H2O. Almacene a 4 °C cuando no esté en uso.
    4. Precalentar H2O ultrapuro en un microondas estándar durante 1 min (hasta 90 - 95 °C). Debajo de una campana extractora, agregue el H2O ultrapuro calentado a 0,5 g de paraformaldehído (PFA). Agregue dos gotas de 1 N NaOH, vórtice para mezclar y deje enfriar a temperatura ambiente. Ajuste el pH a 9,2 - 9,3 con 50 mM de ácido bórico y añada Triton X-100 al 0,15 % (v/v). Añada H2O ultrapuro hasta un volumen final de 50 mL (solución fijadora de PFA al 1%) y vierta el fijador en un frasco de tinción Coplin de vidrio de 50 mL.
      NOTA: Este protocolo se optimizó utilizando agua casi hirviendo para preparar PFA; sin embargo, calentar PFA en solución por encima de 65 °C puede causar degradación y liberación de humos tóxicos. Alternativamente, precaliente el H2O ultrapuro a 60 °C en un baño de agua.
    5. Limpie los portaobjetos de vidrio del microscopio con etanol al 70%. Utilice un bolígrafo PAP de barrera hidrofóbica para dibujar hasta tres cuadrados (aproximadamente 20 x 20 mm; véase la Figura 1E). Un solo par de ovarios proporcionará suficiente material para seis cuadrados (o dos portaobjetos de 3 cuadrados cada uno).
  3. Sacrificio de ratones preñados 14.5 - 18.5 dpc por asfixia por CO2 y luxación cervical de acuerdo con las pautas de IACUC.
    1. Los puntos de tiempo para el enriquecimiento de etapas específicas de la profase I en ratones C57BL/6J se describen en la Figura 1A. Para los puntos temporales de desarrollo dados, el porcentaje aproximado de ovocitos en cada estadio de la profase I se ha proporcionado utilizando datos de Evans et al. (1982)31. En el caso de los ovocitos de cigoteno, recoger en 16,5 dpc; Paquiteno temprano en 17.5 DPC; y paquiteno medio: diploteno a 18,5 dpc.
  4. Use tijeras de disección para abrir la cavidad abdominal y extraer los cuernos uterinos.
  5. Disecciona los ratones fetales del cuerno uterino, el tejido decididual, y el saco vitelino. Coloque los ratones fetales en una placa de Petri de 100 mm con 1x solución salina tampón de fosfato (PBS).
  6. Diseccione los ovarios de un feto femenino a la vez mientras mantiene el resto en 1x PBS. Sacrificar ratones fetales por decapitación de acuerdo con las pautas de la IACUC. Con alfileres de acero inoxidable, asegure la superficie ventral del torso hasta una almohadilla de silicona en un plato de disección.
  7. Use tijeras de microdisección para hacer una incisión abdominal justo debajo del ombligo, teniendo cuidado de evitar cortar las arterias. Use pinzas finas para desplazar el intestino hasta que los cuernos uterinos fetales sean visibles.
  8. Para localizar los ovarios, siga cada cuerno uterino desde la vejiga hacia el riñón. El ovario y el oviducto aparecerán como pequeñas estructuras de glóbulos en el extremo de los cuernos uterinos, ubicados justo debajo del riñón y cerca de la parte posterior de la cavidad peritoneal (Figura 1B).
  9. Use pinzas finas para pellizcar los ovarios y recogerlos en un pequeño vidrio de reloj lleno de 750 μL de 1x PBS.
  10. Diseccionar el ovario de los tejidos circundantes y colocar ambos ovarios en un vidrio de reloj que contenga 750 μL de HEB, teniendo cuidado de asegurarse de que los ovarios estén completamente sumergidos (ver Figuras 1C y 1D). Incubar los ovarios durante 15 min a temperatura ambiente.
  11. Pipetear 35 μL de 100 mM de sacarosa en un portaobjetos de concavidad. Use pinzas finas para transferir ambos ovarios de HEB a sacarosa.
  12. Use una aguja de 25G para asegurar un ovario al portaobjetos mientras usa una segunda aguja, biselada hacia abajo, para presionar los ovocitos del ovario.
    1. Cuando el ovario se vuelva transparente y gelatinoso, retire el ovario del HEB y repita el proceso con el segundo ovario. Pipetear suavemente la solución para dispersar las células.
  13. Sumerja el portaobjetos en el frasco de tinción Coplin de PFA y frote brevemente el borde del portaobjetos contra una toalla de papel. Una vez que el PFA se ha recogido en pequeñas gotas a lo largo del límite hidrofóbico de cada cuadrado (Figura 1E), pipetee 5 μL de la solución de ovocito y sacarosa en cada gota de PFA.
  14. Extienda los ovocitos sobre las secciones cuadradas inclinando suavemente los portaobjetos hacia adelante y hacia atrás. Tenga cuidado de no permitir que la solución de cualquier cuadrado se derrame hacia los cuadrados adyacentes.
  15. Coloque el portaobjetos en una cámara húmeda y continúe haciendo portaobjetos hasta que se agote la solución de ovocitos y sacarosa.
  16. Repita los pasos 1.6 a 1.15 hasta que se hayan utilizado todos los fetos femeninos. Incubar los portaobjetos en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 2 h.
  17. Después de la incubación, abra la cámara húmeda. Como la mayoría (si no todo) el líquido/fijador aún debe estar presente en la superficie del portaobjetos (aproximadamente 10 μL en cada sección cuadrada), transfiera suavemente los portaobjetos a una toalla de papel y deje que los portaobjetos se sequen completamente al aire a temperatura ambiente en una mesa de laboratorio (este proceso suele tardar entre 30 y 60 minutos, dependiendo de la humedad local).
    NOTA: Los portaobjetos también se pueden secar al aire bajo una campana extractora para mitigar la posible exposición a los vapores residuales de PFA. Esto también acortará el secado a aproximadamente 20 a 30 minutos.
  18. Lave los portaobjetos con un agente humectante al 0,4% en H2O ultrapuro durante 2 min. Deje que los portaobjetos se sequen por completo.
    NOTA: En este punto, los portaobjetos pueden almacenarse a -80 °C; sin embargo, ciertos epítopos son inestables (por ejemplo, en nuestra experiencia, MLH1 se tiñe mal y la tinción SYCP3 tiene artefactos significativos después de la congelación). Se recomienda encarecidamente que los portaobjetos se inmunotiñan inmediatamente.

2. Tinción por inmunofluorescencia de dispernaciones del cromosoma de profase I

  1. Prepare 10 tampones de dilución de anticuerpos (ADB; consulte la Tabla 2) que contengan 10 % (v/v) de suero de cabra normal, 3 % (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA) y 0,05 % de Triton X-100 en 1 PBS. Filtre, esterilice con un filtro de 0,45 μm y almacene a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
  2. Lave los portaobjetos en un frasco de tinción Coplin con agente humectante al 0,4% en 1x PBS durante 10 min. Lave los portaobjetos en un frasco de tinción Coplin de Triton X-100 al 0,1% en 1x PBS durante 10 min. Bloquee los portaobjetos en un frasco de tinción Coplin de 1x ADB durante 10 min.
  3. Diluir los anticuerpos primarios seleccionados en 10x ADB (consulte la Tabla de materiales para obtener una lista de anticuerpos y sus respectivas diluciones).
    1. Prepare cuatro combinaciones de anticuerpos para la inmunotinción múltiple: (1) SYCP332,33, SYCP133 HORMAD133; (2) SYCP332,33, RAD5132,33, MLH332; (3) SYCP332,33, MSH432, MLH332; y (4) SYCP334, MLH1 32,33,34, CREST 35.
  4. Retire los portaobjetos del ADB, retire el exceso de líquido y colóquelos en una cámara humidificada con agua a temperatura ambiente. Aplique 30 μL de anticuerpos diluidos por sección cuadrada de cada portaobjetos, teniendo cuidado de que los anticuerpos de un cuadrado no se derramen a los cuadrados adyacentes.
  5. Cierre la cámara humidificada y deje que los portaobjetos se incuben durante la noche a temperatura ambiente.
  6. A la mañana siguiente, abra la cámara húmeda y retire los anticuerpos diluidos de los portaobjetos. Repita el paso 2.2.
  7. Diluir los anticuerpos secundarios seleccionados en 10x ADB (ver Tabla de Materiales).
    NOTA: A partir de este punto, los portaobjetos y los anticuerpos son fotosensibles. Completa todas las incubaciones posteriores en la oscuridad.
  8. Retire los portaobjetos del ADB, retire el exceso de líquido y colóquelos en una cámara humidificada con agua a temperatura ambiente. Aplique 30 μL de anticuerpos diluidos seleccionados por sección cuadrada de cada portaobjetos, teniendo cuidado de que los anticuerpos de un cuadrado no se derramen en los cuadrados adyacentes.
  9. Cierre la cámara humidificada y deje que los portaobjetos se incuben durante 2 h a temperatura ambiente.
  10. Lave los portaobjetos 3 veces durante 5 minutos cada uno en frascos de tinción Coplin con agente humectante al 0,4% en 1x PBS. Lave los portaobjetos durante 5 min en un frasco de tinción Coplin con agente humectante al 0,4% en H2O ultrapuro.
  11. Aplique una pequeña gota (aproximadamente 10 μL) de medio de montaje antidecoloración con tinción de 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) o ácido nucleico equivalente. Coloque un cubreobjetos de vidrio n.º 1,5 de 60 mm x 24 mm en cada portaobjetos y seque con cuidado el exceso de líquido.
    NOTA: Los portaobjetos pueden sellarse con esmalte de uñas transparente o cemento de caucho. Si se utiliza un soporte de curado, no es necesario sellar los portaobjetos. Las diapositivas deben almacenarse en una caja o carpeta de portaobjetos a 4 °C. Aunque se recomienda obtener imágenes de los portaobjetos poco después de la tinción, según nuestra experiencia, los portaobjetos almacenados en la oscuridad a 4 °C pueden conservar la intensidad de la señal durante varios meses o un año. Para el almacenamiento a largo plazo, las correderas de retención se pueden mantener a -20 °C durante varios años sin una pérdida significativa de la calidad de la señal.
  12. Imagen de células a 63x utilizando microscopía de epifluorescencia (ver Tabla de Materiales). Utilice un software de análisis de imágenes (por ejemplo, Zen de ImageJ, consulte la tabla de materiales) para medir la longitud de SC y la intensidad de fluorescencia de todos los canales a lo largo del eje. Traza la longitud de cada eje cromosómico (SYCP3), comenzando en el centrómero (región densa CREST o DAPI).
    1. Para el análisis de HORMAD1 y SYCP1, registre las longitudes de los picos de la señal de fluorescencia. Calcula las longitudes totales de los picos HORMAD1 o SYCP1 y divídelos por la longitud del eje cromosómico.
    2. Para el análisis de MSH4, cuantifique el número de picos de señal de fluorescencia para cada medición de SYCP3. Registre el número total de picos MSH4 por núcleo y el número de picos MSH4 que se superponen a los picos MLH3. Confirme los recuentos de MSH4 comparando los picos con el recuento de focos correspondiente.

3. Preparaciones de diacinesis/prometafase para la observación de quiasmas

  1. Para maximizar el rendimiento de ovocitos meióticamente competentes, utilice ratones hembra juveniles (25 a 28 días de edad).
    NOTA: Se puede realizar la estimulación mediante la inyección intraperitoneal de ratones hembra con 5 UI de gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG) 48 h antes de la recolección de ovocitos para mejorar el rendimiento. Sin embargo, a efectos de los análisis de quiasmas, se pueden recolectar suficientes ovocitos de vesículas germinales (GV) de hembras no estimuladas.
  2. Antes de sacrificar ratones, prepare los siguientes reactivos y soluciones.
    1. Deje que M2 (3 mL por ratón) y KSOM (1 mL por ratón) se equilibren en una incubadora de cultivo celular (37 °C, 5 % CO2) durante al menos 1 h.
      NOTA: Los tubos de alícuotas de medios congelados se pueden colocar en la incubadora con las tapas aflojadas la noche anterior a la recolección de ovocitos, lo que permite aproximadamente 14 h de equilibrio.
    2. Prepare los medios M2 con 2,5 μM de milrinona (un inhibidor de la isoenzima fosfodiesterasa que impide la reanudación meiótica)36. Pipetear cinco gotas de 20 μL de M2 + milrinona en una placa de Petri de 35 mm y recubrir con aceite mineral ligero (Figura 2C).
    3. Pipetear cinco gotas de KSOM de 20 μL en una placa de Petri de 35 mm y recubrir con aceite mineral ligero (Figura 2C).
      PRECAUCIÓN: El control de la temperatura y el pH es fundamental para la maduración in vitro de los ovocitos. La recolección de ovocitos debe realizarse en una mesa caliente (37 °C). Todos los medios deben mantenerse en la incubadora hasta que se utilicen, y los platos de medios deben retirarse de uno en uno para limitar las interrupciones causadas por la exposición al aire ambiente.
    4. Limpie los portaobjetos de vidrio del microscopio con etanol al 70% y déjelos secar al aire. En la parte posterior de los portaobjetos de vidrio del microscopio, marque ligeramente (con un bolígrafo con punta de diamante) o dibuje (con una tinta resistente al agua) una cuadrícula de 5 x 5 de cuadrados de ~ 4 mm x 4 mm (se muestra un ejemplo en la Figura 2B y se puede usar para trazar la cuadrícula).
  3. Recolecta ovocitos de un ratón a la vez. Sacrificar un ratón hembra por asfixia con CO2 y luxación cervical de acuerdo con las directrices de la IACUC.
  4. Use tijeras de disección para abrir la cavidad abdominal. Use pinzas finas para desplazar los intestinos.
  5. Siga cada cuerno uterino desde la vejiga hasta el riñón. Los ovarios y los oviductos se asociarán con una pequeña almohadilla de grasa cerca del riñón.
  6. Use tijeras de microdisección para extraer los ovarios y colóquelos en un medio M2 gaseado con milrinona.
  7. Use tijeras de microdisección para extraer toda la grasa y otros tejidos (incluida la bursa) de los ovarios. Utilice agujas de 25G para romper los folículos antrales.
  8. Utilice una pipeta de transferencia para esparcir los ovocitos en M2 + milrinona en una capa delgada en una placa de Petri de 100 mm, teniendo cuidado de que el medio no toque los lados de la placa (Figura 2C).
  9. Utilice un microscopio de disección (aumento de 25x a 50x) para visualizar los ovocitos GV (Figura 2F). Los ovocitos GV pueden estar asociados con células cúmulos en un complejo cúmulo-ovocito (COC). Retire las células del cúmulo con pipeteo repetido.
  10. Recolectar ovocitos GV con una pipeta de vidrio manual (100 - 150 μm de diámetro; Figura 2A). Transfiera los ovocitos GV a una gota de 20 μL de M2 + milrinona recubierta con aceite mineral ligero (Figura 2C). No ponga más de 30 ovocitos en una sola gota.
  11. Cuando se hayan recogido todos los ovocitos GV, páselos por dos o tres gotas de 20 μL de M2 + milrinona recubiertas de aceite mineral ligero para eliminar las células somáticas.
  12. Transfiera los ovocitos GV (con la menor cantidad de medios posible) a una gota de 30 μL de KSOM. Lavar la milrinona haciendo pasar los ovocitos a través de cinco gotas de KSOM (Figura 2C).
  13. Transfiera todos los ovocitos GV a gotas de 20 μL de KSOM recubiertas con aceite mineral ligero, un máximo de 30 ovocitos por gota de KSOM (Figura 2C). Colocar los ovocitos en una incubadora de cultivo celular (37 °C, 5 % CO2).
  14. Incubar los ovocitos durante aproximadamente 5 h.
    NOTA: Ruptura de GV (marcando la desaparición de la envoltura nuclear y la reanudación meiótica; Figura 2G) Por lo general, ocurre después de 2 h en cultivo, pero la tasa de maduración de los ovocitos puede variar según la cepa del ratón o la estimulación hormonal. En nuestra experiencia, un total de 5 h en cultivo optimiza mejor la propagación de quiasmas en la mayoría de las cepas de ratón. Si se deja madurar demasiado tiempo, puede producirse la primera división meiótica y la extrusión del cuerpo polar (Figura 2H).
  15. Transfiera de 5 a 10 ovocitos (con la menor cantidad posible de KSOM) a una gota de 30 μL de solución hipotónica (citrato de sodio al 0,9 % en H2O ultrapuro). Incubar los ovocitos en la solución hipotónica durante 5 a 10 min.
  16. Pipetear una pequeña gota (~ 1 μL) de agua acidificada (8 gotas de ácido acético glacial en 50 mL de H2O ultrapuro) en uno de los cuadrados de los portaobjetos preparados (Figura 2B).
  17. Utilice una pipeta de vidrio bucal de 100 a 150 μm de diámetro para transferir rápidamente un ovocito de la gota de agua acidificada a la gota de agua. Transfiera la menor cantidad posible de solución hipotónica con el ovocito. Utilice la misma pipeta para eliminar parte del líquido hasta que el ovocito se adhiera al portaobjetos.
    NOTA: El volumen de líquido alrededor del ovocito es crítico. Debe haber suficiente líquido para que el ovocito no se seque antes de la fijación, pero no tanto como para que el ovocito no pueda adherirse al portaobjetos.
  18. Cambie rápidamente a una punta de pipeta de vidrio de 150 μm de diámetro. Añade una gota de fijador fresco de Carnoy (tres partes de metanol absoluto por una parte de ácido acético glacial) al ovocito. Deje que el fijador se disperse sobre el portaobjetos. El ovocito debe parecer que se vuelve menos distintivo y se derrite a medida que el ácido del fijador disuelve la zona pelúcida y las células estallan.
  19. A medida que la parte delantera del fijador comience a contraerse, agregue rápidamente de 2 a 3 gotas más de fijador. Sople suavemente en el portaobjetos para acelerar el secado.
  20. Repita los pasos 3.16 a 3.19 con ovocitos adicionales de la solución hipotónica.
  21. Repita los pasos 3.15 a 3.20 hasta que se hayan fijado todos los ovocitos. Compruebe la dispersión de los cromosomas con un microscopio de contraste de fase.
  22. Cuando el portaobjetos se haya secado completamente al aire, colóquelo en un frasco de tinción Coplin con 50 mL de Giemsa al 4% (v/v) en ddH2O. Portaobjetos de tinción en Giemsa durante 6 min a temperatura ambiente.
  23. Lave los portaobjetos 3 veces durante 3 minutos cada uno en ddH2O a temperatura ambiente. Deje que los portaobjetos se sequen por completo.
  24. Aplique una capa delgada (~60 μL) de Permount sobre un cubreobjetos de vidrio n.º 1,5 de 60 mm x 24 mm. Monte los portaobjetos invirtiéndolos en los cubreobjetos y secando cuidadosamente el exceso de líquido. Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche antes de obtener imágenes a 63x en campo claro.

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Resultados

Evaluación de defectos de sinapsis en células similares al paquiteno
En este experimento se evalúan los defectos de sinapsis en ovocitos de paquiteno y se monitoriza la progresión de la profase I (Figura 3A). La inmunotinción para SYCP3 (elementos SC axiales/laterales), SYCP1 (elemento SC central) y HORMAD1 (ejes cromosómicos no sinapsados/desinapsados) permite la estadificación y la evaluación de la sinap...

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Discusión

Los ovocitos de mamíferos son particularmente propensos a errores en comparación con los espermatocitos. Mientras que el punto de control de ensamblaje del huso (SAC) menos eficiente del ovocito contribuye a esta vulnerabilidad 14,52,53, Hassold y Hunt proponen que los impactos múltiples conducen a la aneuploidía, siendo la recombinación defectuosa un factor primario 54. ...

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Divulgaciones

El autor no tiene conflictos que revelar.

Agradecimientos

El financiamiento para este proyecto fue proporcionado por un premio K99 del Instituto Nacional Eunice Kennedy Shriver para la Salud y el Desarrollo Infantil (HD112986 a TH).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,45 & mu; Filtro de jeringuilla mMillipore SigmaSLHAR33SBpara fabricar una pipeta de operación bucal
0,5 M EDTA, pH 8,0Corning46-034-CI para HEB
Jeringuilla estéril de 1 mL con aguja calibre 25, 16 mmFisher Scientific14-817-125 para la ruptura de ovarios
Placa de Petri de 100 x 15 mmVWR25384-302 
Pipetas Pasteur desechables de vidrio borosilicato de 14,6 cmFisher Scientific13-678-20B para fabricar una pipeta de operación bucal
Placa de Petri de 35 x 10 mmCorning351008
Pines de acero inoxidable #3 de 40 mm x 0,45 mm para entomologíaAmazonB0CSSPW5S7para inmovilizar ratones fetales para disección
Ácido acético, glaciarFisher ScientificA38-212para el fijador de Carnoy
Conjuntos de tubos aspiradores para microcapilares calibradosMillipore SigmaA5177-5EApara fabricar una pipeta de operación bucal
Reloj de B.P.I.NDS Technologies 1580-00Alternativamente, utiliza una placa embrionaria de 30 mm de diámetro x 12 mm de profundidad (Electron Microscopy Sciences SKU: 70543-30)
Ácido bóricoFisher ScientificBP168-1para ajustar el pH de HEB, PFA
Albúmina sérica bovinaMillipore SigmaA7906-100Gpara ADB
Tanque de CO2para incubadora
Portaobjetos de microscopio de CorningMillipore SigmaCLS294875X25L x An 75 mm x 25 mm, esmerilado en un lado
Portaobjetos de microscopio Corning, esmerilado en un lado y en un extremoVWR294875X25
Cubre el cristal rectangular. 60 x 24 mm, #1.5VWR48393-251
Plato DiseccionadorCiencias de la Microscopía Electrónica70540
Microscopio de disecciónCualquier modelo estándar
Tijeras de disección, punta afilada, 4,5"VWR82027-578
Pinzas extra finas y afiladasVWR76548-836
Giemsa StainMillipore SigmaGS500-500para teñir los diseminados de los chiasmatas
Pluma PAP de barrera hidrofóbica ImmEdgeLaboratorios VectorH-4000
IncubadoraCualquier modelo estándar con tecnología de CO2 y chaqueta de agua
Estación de trabajo FIVK-SystemsCualquier modelo con una mesa calefactada
Solución Kodak Photo-Flo 200BH Photo & Vídeo1464510para lavados deslizantes
MetanolFisher ScientificA412-4para el fijador de Carnoy
Tarro de tinción Coplin de MP BiomedicalsFisher ScientificICN17006201
Suero normal para cabraGibco16210-072para ADB
Paraformaldehído, grado electromagnético, prill purificadoCiencias de la Microscopía Electrónica19200
PermountFisher ScientificSP15-100for  Correderas de montaje para extensiones de chiasmata
Montaje antifade de vidrio ProLong con tinte NucBlueTermo CientíficaP36985para montar portaobjetos inmunotintidos
Tubo de silicona, diámetro interior: 0,125", diámetro exterior: 0,25"VWR89068-474para fabricar una pipeta de operación bucal
Dihidrato de citrato de sodioFisher ScientificS279-500para HEB, solución hipotónica
Sistema de tinción por deslizamiento StainTrayCiencias de la Microscopía Electrónica71396-BPara usarse como cámara humidificada. Hay que usar la tapa negra para la tinción por inmunofluorescencia. Alternativamente, puede forrar el fondo de una caja opaca de deslizantes o cubiertos con toallas de papel húmedas para usarlas como cámara humidificada...
Consejos para stripper - 100Cooper SurgicalMXL3-100para pipeta de operación bucal
Puntas para stripper - 150Cooper SurgicalMXL3-150para pipeta de operación bucal
SacarosaMillipore SigmaS-8501para HEB, solución hipotónica de sacarosa
Tris BaseFisher ScientificBP152-5para HEB
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100 para PFA, ADB y Triton-PBS
Tarro de tinción Coplin de United ScientificFisher ScientificS17495APlástico blanco opaco para lavados y portaobjetos de bloqueo tras la adición de anticuerpos secundarios fotosensibles
Portaobjetos de concavidad de vidrio de United ScientificFisher ScientificS1395331,3 mm de grosor, 2 pozos
Tijeras Vannas Microdissection 5mm rectasVWR76457-358
Zeiss Axio Imager.Z2, Colibri 7Carl Zeiss000000-2624-307
Zen Blue 3.11 SoftwareCarl ZeissSoftware de adquisición y análisis de imágenes
Anticuerpos
¿Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')? Fragmento Goat Anti-Mouse IgG, fragmento específico de FcJackson InmunoResearch Laboratories Inc.115-546-071Dilución usada 1:1.000
¿Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')? Fragmento Goat Anti-Rabbit IgG, fragmento específico de FcJackson InmunoResearch Laboratories Inc.111-546-046Dilución usada 1:1.000
¿Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')? Fragmento de cabra anti-humano IgG, Fcγ Específico de fragmentosJackson InmunoResearch Laboratories Inc.109-606-170Dilución usada 1:1.000
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Guinea Pig IgG, Fc fragmento especificadoJackson InmunoResearch Laboratories Inc.106-605-008Dilución usada 1:1.000
Cavillo anti-MLH3 pAbHecho a medida con Thermo-Fisher, con dilución 1:500
Cavillo anti-SYCP1 pAbde Christer Hö ö g (Kouznetsova et al. 2005), utilizó dilución 1:200
Proteína anti-centrómero humana pAbAntibodies Inc.15-234Dilución usada 1:1.000
Mouse anti-MLH1 mAbBD Biociencias550838Dilución 1:100 usada
Anti-SYCP3 de ratón mAbAbcamab97672Dilución usada 1:1.000
Rabbit anti-HORMAD1 pAbProteintech13917-1-APDilución usada 1:500
Rabbit anti-MSH4 pAbAbclonalA8556Dilución 1:100 usada
Rabbit anti-RAD51 pAbMilliporePC130Dilución usada 1:500
Rabbit anti-SYCP3 pAbAbcamab15093Dilución usada 1:1.000
¿Rhodamine Red-X (RRX) AffiniPure F(ab')? Fragmento Goat Anti-Mouse IgG, fragmento específico de FcJackson InmunoResearch Laboratories Inc.115-296-071Dilución usada 1:1.000
¿Rhodamine Red-X (RRX) AffiniPure F(ab')? Fragmento Goat Anti-Rabbit IgG, fragmento específico de FcJackson InmunoResearch Laboratories Inc.111-296-046Dilución usada 1:1.000

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