Desarrollo de líneas de organoides derivados de ratones a partir de células epiteliales de trompas de Falopio para el modelado de carcinoma de ovario seroso de alto grado

Resumen

Este protocolo detalla el desarrollo de modelos de ratón de carcinoma de ovario seroso de alto grado (HGSOC) in vitro e in vivo. A partir de la derivación de organoides de trompas de Falopio murinos, su modificación genética para recapitular la genética HGSOC humana y su introducción en la bolsa ovárica de ratones singénicos para el desarrollo in vivo de tumores.

Resumen

El modelado efectivo de enfermedades en entornos realistas es crucial para mejorar nuestra comprensión de diversas patologías. En este aspecto, los organoides ofrecen un entorno más fiel que sus homólogos bidimensionales clásicos in vitro. Del mismo modo, los modelos murinos singénicos también permiten a los investigadores investigar interacciones tumor-huésped más completas, como con el sistema inmunológico, in vivo. Aquí presentamos un protocolo completo sobre la extracción de células epiteliales de las trompas de Falopio, la célula de origen de los carcinomas de ovario serosos de alto grado (HGSOC), de un ratón y derivarlas como cultivos de organoides primarios, así como su cultivo y mantenimiento in vitro . A continuación, describimos cómo utilizar técnicas de ingeniería genética, como la sobreexpresión de genes lentivirales o retrovirales, así como la deleción del gen CRISPR-Cas9, para modificar estas líneas y transformarlas en tumoroides precancerosos. También informamos cómo usarlos para la validación in vitro , mediante la extracción de materiales genéticos y la tinción de inmunofluorescencia. Finalmente, indicamos cómo inyectar eficazmente estos tumoroides en la bolsa ovárica, el sitio autóctono del HGSOC, para el inicio del tumor.

Introducción

El carcinoma de ovario seroso de alto grado (HGSOC) sigue siendo una enfermedad poco conocida y altamente letal. Históricamente, la falta de modelos in vitro e in vivo fieles que representen la biología del HGSOC y la respuesta a la terapia ha sido una barrera importante para el progreso. Por ejemplo, múltiples (si no la mayoría) de los estudios han utilizado líneas celulares que no comparten características genómicas / genéticas clave de HGSOC, lo que hace cuestionable la relevancia de sus hallazgos 1,2,3,4. Por ejemplo, el modelo de ratón singénico ID8 común se deriva del epitelio de la superficie ovárica (OSE) y es Trp53-wild tipo⁵. Por el contrario, la mayoría, si no todo, el HGSOC surge en el epitelio de la trompa de Falopio (FTE)⁶, y el HGSOC es casi universalmente mutante o silenciado en TP53⁷. Desde entonces, los investigadores han tratado de rectificar esta línea integrando mutaciones de Trp53 en ella⁵, pero dado que la mutación de Trp53 es un evento temprano en la patogénesis del HGSOC, esta modificación se produce posiblemente demasiado tarde en la transformación de esta línea celular y probablemente no representa el desarrollo normal del HGSOC.

Durante la última década, se han hecho intentos de rectificar este estado de cosas generando modelos más realistas de HGSOC. Por ejemplo, los modelos de ratón modificados genéticamente (GEMM) que albergan mutaciones relevantes en las células del linaje del tracto mülleriano, a menudo bajo un sistema Cre-recombinasa para controlar la patogénesis, permiten a los investigadores imitar mejor la enfermedad in vivo ^8,9,10. Desafortunadamente, estos modelos a menudo son complicados de generar y pueden tener otros problemas como fugas de Cre, efecto Cre o "efectos de campo"11,12,13. En este sentido, los modelos de organoides singénicos parecen ser un compromiso sólido para los investigadores que desean imitar mejor la enfermedad tanto in vitro como in vivo 14,15,16,17,18,19. De hecho, si bien la mayoría de los modelos HGSOC disponibles y utilizados en este momento son modelos bidimensionales, desafortunadamente no pueden simular adecuadamente la complejidad de la matriz extracelular (ECM), un elemento crucial que afecta a la biología celular. Los organoides son tejidos 3D autoorganizados, a menudo generados a partir de células madre, que pueden recrear la complejidad estructural y funcional temprana de un órgano en la placa de Petri²⁰. Su generación generalmente funciona suspendiendo células individuales, que son pluripotentes, en una matriz de membrana basal (BMM), como Matrigel²¹. In vitro, estos modelos son comparativamente más precisos para recapitular condiciones in vivo que los modelos 2D. Asimismo, debido a su naturaleza singénica, estos modelos son capaces de ser trasplantados a un ratón con un sistema inmunológico en pleno funcionamiento, lo que permite una reconstrucción más fiel de la patogénesis y el desarrollo^14,15. Esta es una clara ventaja sobre los xenoinjertos derivados de pacientes, que, si bien tienen la genética tumoral más realista, requieren injerto en modelos de ratón inmunocomprometidos.

En este protocolo, describimos cómo desarrollar modelos de organoides HGSOC singénicos. Desde la generación del cultivo original de organoides FTE de tipo salvaje extraído de un ratón, su ingeniería genética para generar genotipos informados por la enfermedad, hasta finalmente su trasplante de nuevo a la bolsa ovárica para generar tumores completamente desarrollados. También incluimos algunos protocolos adicionales para ayudar con experimentos comunes, como la tinción de inmunofluorescencia (IF) de organoides in vitro y la conversión 2D de líneas celulares para la producción a gran escala de células, como para inyecciones. Este protocolo está dirigido a investigadores que quieran desarrollar modelos singénicos organoides de HGSOC con control sobre su composición genética, con la intención particular de estudiar la biología del HGSOC en condiciones in vitro más realistas, así como las interacciones presentes en el microambiente tumoral in vivo.

Protocolo

Toda la recolección y los procedimientos de tejido animal se realizaron de manera ética bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Centro de Ciencias de la Vida de Alexandria y el Centro de Cáncer Perlmutter en NYU Langone Health, Nueva York, Nueva York.

1. Preparación de materiales

1. Preparación de medios organoides murinos (MOM)
   1. Prepare el medio basal combinando los elementos de la Tabla 1.
      NOTA: El medio es estable hasta por un mes a 4 °C.
2. Preparación de medios 2D
   1. Combine EGF murino recombinante 50 ng/mL, Insulina-Transferrina-Selenio (concentraciones finales 10 mg/L Insulina, 5,5 mg/L Transferina, 6,7 μg/L), suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) al 3% y Penicilina-Estreptomicina (100 U/mL), en DMEM (con piruvato y glucosa alta).
3. Preparación de la mezcla de digestión
   1. Combine colagenasa / hialuronidasa (3000 U / ml de colagenasa, 1000 U / ml de hialuronidasa) con DMEM (con piruvato y glucosa alta) en una proporción de 1:10. Prepare alícuotas de 1 ml en microtubos de 1,5 ml. Almacenar las alícuotas a -20 °C y descongelar en hielo.
   2. Prepare alícuotas de un solo uso de ADNasa I (10,000 U/mL) y Dispasa (5 U/mL).
   3. Una vez que se descongela una alícuota de colagenasa/hialuronidasa en DMEM, agregue DNAseI (10 μL, 100 unidades) y Dispasa (25 μL, 0,1 unidades).
      NOTA: Esta solución de digestión también es útil para digerir hasta 0,5 g de tumor.
4. Manejo de BMM
   1. Almacene BMM a -80 °C a largo plazo. Para evitar la congelación y descongelación de BMM, prepare alícuotas de 1 ml en tubos de 1,5 ml. Descongele una alícuota colocándola en hielo durante 2 h o durante la noche a 4 °C.
      NOTA: BMM se solidificará a temperatura ambiente (RT). Por lo tanto, se recomienda mantener siempre el tubo de BMM en hielo o en una rejilla de tubo frío. Utilice puntas de pipeta que se hayan enfriado previamente en un congelador a -20 °C durante al menos 2 h.

2. Aislamiento de células de FTE de ratón

1. Descongele una alícuota de BMM, TrypLE Express Enzyme precalentado y una placa de 24 pocillos a 37 °C (guarde la placa en la incubadora durante 24 h para obtener mejores resultados). Luego, prepare el área de operación: herramientas para disección y limpieza de tejido en el microscopio de disección, placa con PBS frío + P / S y mezcla de digestión tibia.
2. Eutanasia a ratones hembra C57BL / 6J por asfixia con dióxido de carbono. Realizar el método de eutanasia secundaria (luxación cervical) según lo requiera IACUC.
3. Diseccionar y extirpar el ovario y las trompas de Falopio y transferirlos a una placa de Petri estéril que contenga DMEM + PS a 4 °C. Usando un microscopio de disección, un juego fino de fórceps y tijeras extrae la cantidad residual de grasa del ovario y aísla la trompa de Falopio (infundíbulo y parte de la ampolla distal) del ovario y el útero.
   NOTA: Tenga cuidado de evitar tocar la piel o el pelo del ratón con las herramientas para evitar la contaminación microbiana.
4. Transfiera el tejido al tubo que contiene la mezcla de digestión completa y use unas tijeras finas para picar la trompa de Falopio en trozos pequeños (<0,5 mm). Incubar durante 40-50 min a 37 °C.
5. Después de la disociación, centrifugar las células a 350 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante. Añadir 500 μL de TrypLE Express precalentado. Incubar durante 15 min a 37 °C.
6. Apague la tripsinización con 500 μL de FBS al 3% en DMEM (medios 2D). Cuele la mezcla a través de un colador celular de 70 μm en un nuevo microtubo. Centrifugar durante 5 min a 350 g y desechar el sobrenadante.
7. Vuelva a suspender el sedimento celular (apenas visible dependiendo del número de FT utilizados) en 12,5 μL de medios murinos organoides e incube brevemente en hielo. Mezclar con 37,5 μL de BMM helado y sembrar todo el volumen (50 μL) en el fondo de un pocillo de una placa de 24 pocillos precalentada.
8. Coloque la placa a 37 °C durante al menos 20 min, pero no más de 48 h, para ajustar el BMM. Tenga cuidado de no perturbar las cúpulas al transferir la placa a la incubadora.
9. Agregue 500 μL de MOM precalentado a cada pocillo pipeteando el medio suavemente por el costado del pocillo. Nunca agregue medios directamente a la cúpula, ya que puede causar daños o desprendimiento. Coloque la tapa en la placa de cultivo e incube a 37 °C y 5% de CO₂.

3. Mantenimiento de organoides murinos derivados de FTE

1. Cambio de medios
   1. Con una punta estéril y sin filtrar de 10 μl, aspire el medio desde el fondo del pocillo mientras la placa se mantiene en una inclinación de 45°. Si la cúpula se desprende de la placa, aspire con cuidado el medio desde la parte superior del pocillo mientras la cúpula separada está en la parte inferior.
   2. Añadir lentamente 750 μL de MOM, precalentado a 37 °C, con la punta presionada contra la pared lateral del pocillo.
   3. Cambie el medio cada 2 o 3 días o hasta que cambie de color de rosa a amarillo. Si el medio se vuelve amarillo menos de 24 h después de cambiarlo, los organoides están listos para ser pasados.
2. Organoides de paso
   1. Retire el medio y lave cada pocillo con 500 μL de PBS frío (4 °C). Aspire PBS y agregue 500 μL de solución de recuperación celular fría (4 °C) directamente a la cúpula BMM para disolverla. Continúe pipeteando hasta que el BMM se disuelva por completo y transfiéralo a un tubo de 1,5 ml.
   2. Coloque el tubo en hielo durante 30 minutos y regrese la placa a la incubadora para que permanezca caliente. Si utiliza una placa nueva, asegúrese de que esté precalentada a 37 °C durante 24 h.
      NOTA: Si pasa más de 2 cúpulas de 50 μL, como durante las expansiones que se describen a continuación, es posible que la incubación en hielo deba extenderse durante más de 30 minutos para obtener mejores resultados.
   3. Centrifugar a 350 g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante con cuidado sin aspirar el pellet y lave con 500 μL de PBS frío. Repita este paso tres veces.
      NOTA: Si no hay una centrífuga fría disponible, deje que el tubo se enfríe entre lavados colocándolo sobre hielo o una rejilla fría.
   4. Después del último lavado, centrifugar a 350 g durante 5 min, retirar el sobrenadante y añadir 500 μL de Enzima TrypLE Express precalentada (37 °C). Para evitar la pérdida de células por el pipeteo, arrastre el tubo contra la rejilla de ventilación de la campana de cultivo de tejidos para homogeneizar las células.
   5. Incubar el tubo a 37 °C durante 30 a 60 min.
      NOTA: El tiempo puede adaptarse según el genotipo del organoide y el tiempo de paso, ya que algunos pueden requerir una tripsinización más prolongada para producir suspensiones unicelulares.
   6. Detenga el proceso de disociación celular añadiendo 500 μL de DMEM + 3% de HI FBS y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo hasta homogeneizar la solución.
   7. Centrifugar a 350 × g durante 5 min y aspirar el sobrenadante hasta que queden ~20 μL de volumen. Retire manualmente el sobrenadante restante con una pipeta P20 en lugar de con un aspirador al vacío, ya que es común aspirar el gránulo en este paso.
   8. Vuelva a suspender las células en 100 μL de MOM fría (4 °C) y mida la concentración celular. Prepare las diluciones celulares como desee y manténgalas en hielo. A continuación, mezclar con BMM helado utilizando puntas de pipeta que se hayan almacenado previamente a -20 °C.
      NOTA: Se recomienda preparar dos domos de 50 μL a 2 × 10⁵ células/ml, donde la relación de MOM a BMM es de 1:4. Por lo tanto, deberías tener; 25 μL de células en MOM a 8 × 10⁵ células/mL, y 75 μL de BMM para un total de 100 μL, divididas en 2 cúpulas. De esta manera, se sembrarán efectivamente 1 × 10^{4 celdas} por domo.
   9. Siembre cada cúpula de 50 μL en el medio del pocillo de una placa de 24 pocillos precalentada. Coloque la placa en la incubadora a 37 °C y 5% de CO₂ durante al menos 30 min para permitir que el BMM se solidifique. Agregue 500 μL de MOM a 37 °C como se mostró anteriormente en el paso 3.1.2 y devuelva la placa a la incubadora.
3. Expansión
   1. Para expandir el cultivo de células organoides a una placa de 6 pocillos (precalentada), prepare cinco domos de 50 μL a 8 × 10⁵ células/ml. Vuelva a suspender las células en un total de 62,5 μL de MOM y mezcle con 187,5 μL de BMM helado y siembre los 5 domos en el mismo pozo.
   2. Mueva la placa a la incubadora durante 30 minutos para permitir que el BMM se solidifique. Agregue 2 ml de MOM a 37 °C como se mostró anteriormente en el paso 3.1.2 y devuelva la placa a la incubadora. Cambie el medio según sea necesario hasta que las células sean confluentes.
      NOTA: Para recolectar células para su paso, use 1 ml de solución de recuperación celular en lugar de 500 μl e incube en hielo durante 45 min en lugar de 30 min.
4. Crioconservación
   1. Para el almacenamiento a largo plazo de organoides, pase como se describe en los pasos 3.2.1-3.2.7. Luego, vuelva a suspender en 250 μL de medios de congelación de organoides (80% MOM, 10% FBS y 10% dimetilsulfóxido (DMSO)) y transfiéralo a un criotubo. Congele 1 × 10⁵ células por criovial.
   2. Guarde el tubo en un recipiente de congelación de viales criogénicos (por ejemplo, Mr. Frosty) y déjelo enfriar en un congelador a -80 °C. Para el almacenamiento a largo plazo, mantenga las celdas en almacenamiento de nitrógeno líquido o en un congelador a -150 °C.

4. Modificación genética de organoides murinos derivados de FTE para desarrollar nuevas líneas celulares

1. Transducción por espinoculación (lentiviral o retroviral)
   1. Prepare una mezcla de 25 μL de MOM y 75 μL de BMM y agréguela a un pocillo de una placa fría (4 °C, permite que BMM "humedezca" completamente el pocillo) de 48 pocillos. Incubar a 37 °C durante 30 a 60 min para permitir que BMM se solidifique antes de sembrar las células.
   2. Obtenga células individuales derivadas de organoides (paso 3.2.5) y siembre aproximadamente 2 × 10⁴ en la parte superior del BMM. Añadir 200 μL de MOM tibia (37 °C) e incubar a 37 °C y 5% de CO₂ durante 48 h.
   3. Agregue el virus a la concentración deseada. Determinar el MOI experimentalmente; se sugiere un MOI aproximado de menos del 30%.
      NOTA: Los organoides son particularmente difíciles de infectar en comparación con las líneas celulares 2D, y esperan MOI bajos incluso con títulos de virus altos. Centrifugar celdas a 600 × g durante 60 min a 32 °C. Regrese la placa a la incubadora después de que termine la espinoculación.
   4. Después de 8 h, retire el medio y agregue una mezcla de 25 μL de MOM y 75 μL de BMM encima de las células para "intercalarlas" en BMM, lo que permite que los organoides crezcan naturalmente en 3 dimensiones. Deje que el BMM se solidifique colocando la placa en la incubadora durante 30-60 min. A continuación, añadir 250 μL de MOM tibia (37 °C).
   5. Una vez que las células sean confluentes, proceda a pasarlas como se detalla en el paso 3.2, expandiendo todo el volumen de células en 2 cúpulas en una placa de 24 pocillos.
      NOTA: Si se utiliza una selección de antibióticos, se recomienda realizar la selección directamente en el pocillo de 48, comenzando 48 h después de la espinoculación inicial. Si se realiza la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), se recomienda expandir aún más en una placa de 6 pocillos como se describe anteriormente para adquirir suficientes células. También se recomiendan tiempos de tripsinización más largos (1 h) para garantizar células individuales antes de filtrar las muestras para el flujo.
2. Transformación por CRISPR-Cas9 basado en electroporación
   NOTA: Para conocer las concentraciones y la preparación del complejo ribonucleoproteína (RNP), consulte la Guía de reparación dirigida por homología de IDT (págs. 9-11)²². Sin embargo, omita el HDR Enhancer V2 para knockouts, ya que se recomienda solo para la edición del genoma que requiere recombinación homóloga.
   1. Preparar una suspensión unicelular derivada de organoides (paso 3.2.7). Lavar con PBS y medir la concentración celular. Transfiera una suspensión celular que contenga una cantidad dentro del orden de magnitud 10⁴ (1 × 10⁴ a 9 × 10⁴ células) a un tubo de 1,5 ml.
   2. Centrifugar a 350 × g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender en 10 μL de tampón de edición del genoma. Si se requieren >1 × 10⁴ celdas para la electroporación, prepare un volumen suficiente para las electroporaciones en serie, asegurándose de que cada 10 μL contenga 1 × 10⁴ a 9 × 10⁴ celdas.
   3. Utilizando un sistema de pipeta de electroporación, recoja 10 μL de la suspensión celular, asegurándose de que no se introduzcan burbujas. Electroporar en las siguientes condiciones: voltaje de 1200 V, duración de pulso de 20 ms, 4 pulsos en total. Coloque las células en un tubo con MOM frío.
   4. Después de electroporar las celdas, centrifugar toda la suspensión a 350 × g durante 5 min. Vuelva a suspender el gránulo en MOM y BMM helados (proporción 1:4), preparando lo suficiente para sembrar un domo por ronda de electroporación (1 domo por 1 10⁴ celdas).
   5. Coloque la placa en la incubadora a 37 °C y 5% de CO₂ durante al menos 30 min para permitir que el BMM se solidifique. Agregue 500 μL de MOM a 37 °C como se mostró anteriormente en el paso 3.1.2 y devuelva la placa a la incubadora.
3. Selección de clones individuales
   1. Para obtener un clon proveniente de una sola célula, pase las células como se describió anteriormente, pero siembre de 50 a 100 células por domo (4 × 10³ a 8 × 10³ células/ml en suspensión celular antes de mezclarlas con BMM).
   2. Cambia la MOM cada 3 días. Comprueba que los organoides crecen adecuadamente y observa cuáles están bien separados de los demás.
   3. Cuando los organoides crecen a un tamaño discernible (alrededor de 500 μm), use un microscopio óptico para identificar 4-5 organoides grandes que estén lo suficientemente separados.
      NOTA: Deben ser visibles a simple vista, pero es útil marcar la parte inferior de la placa con un marcador de punta fina dibujando un círculo alrededor del área de la placa donde se encuentra el organoide.
   4. Con una pipeta de 20 μl en la campana estéril, inserte suavemente la punta en el BMM y aspire el organoide único (aspire un volumen de aproximadamente 12,5 μl). Coloque el organoide en un tubo de recolección de 1,5 ml con 500 μl de MOM.
   5. Centrifugar a 350 × g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender en 500 μL de TrypLE Express Enzyme. Incubar a 37 °C durante 30 min.
   6. Apagar la reacción de disociación celular con 500 μL de FBS al 3% en DMEM (medio 2D) y centrifugar a 350 × g durante 5 min. Retire con mucho cuidado el sobrenadante, vuelva a suspender en 12,5 μL de MOM frío, mezcle con 37,5 μL de BMM helado y siembre toda la suspensión como una sola cúpula de 50 μL en una placa de 24 pocillos, como se describió anteriormente.
   7. Coloque la placa en la incubadora a 37 °C y 5% de CO₂ durante al menos 30 min para permitir que el BMM se solidifique. Agregue 500 μL de MOM a 37 °C como se mostró anteriormente en el paso 3.1.2 y devuelva la placa a la incubadora.
   8. Cambie los medios cada 3-4 días y pase cuando la cúpula sea confluente.

5. Derivación de líneas celulares 2D a partir de organoides

1. Cultivo celular de transición
   1. Comience con una suspensión de una sola célula, como después de pasar organoides.
   2. Proceda como lo haría con la siembra de una placa de 6 pocillos (paso 3.3), pero utilizando en su lugar una preenfriada (4 °C durante 24 h). Sembrar las cúpulas en una placa de 6 pocillos almacenada a 4 °C durante la noche y dejar reposar la placa en la campana estéril durante 5-10 min antes de introducirla en la incubadora.
      NOTA: Este paso permitirá que las células se asienten suavemente en el fondo de la placa para adaptarse a una condición de crecimiento 2D sin dejar de tener acceso a los componentes ECM de BMM.
   3. Incubar la placa a 37 °C y 5% de CO₂ durante 30 min, luego añadir 2 mL de MOM a 37 °C. Cambie los medios según sea necesario.
   4. Cuando los organoides alcanzan la confluencia, el paso como se describe en los pasos 3.2.1-3.2.7. Después del lavado final de PBS del pocillo para eliminar los restos de BMM, agregue 2 ml de medios 2D precalentados en el pocillo.
      NOTA: La eliminación de BMM no eliminará las células que están unidas al pozo, y estas ahora pueden invadir libremente el resto del pozo mientras se adaptan a las condiciones / medios 2D.
   5. Una vez que se haya alcanzado una suspensión de una sola célula con las células que quedaron en el BMM, siembre la mitad del volumen de células, repitiendo el paso 5.1.2. Agregue la otra mitad del pozo original, permitiendo que se siembren más células, lo que acelerará la confluencia.
   6. Cambie los medios 2D después de 24 h para eliminar las celdas no adheridas.
      NOTA: Debe haber muchas células no adheridas, ya que las células cultivadas en BMM no están acostumbradas a sustratos plásticos y no se adhieren fácilmente.
   7. Repita el paso 5.1.4. Luego, vuelva a suspender todo el volumen de células en 4 ml de medios 2D y siembre 2 ml en cada uno de los pocillos utilizados anteriormente. Cambie los medios 2D cada 3-4 días.
2. Cultivo celular 2D para expansión
   1. Una vez que las células alcancen aproximadamente el 80% de confluencia, proceda al primer paso.
   2. Para pasar, aspire el medio, lave una vez con 1 ml de PBS y agregue 1 ml de tripsina al 0,25%. Incubar las células a 37 °C durante 5 a 10 min.
      NOTA: Las diferentes líneas celulares pueden tener diferentes propiedades adherentes, lo que hace que la duración de la tripsinización varíe. Verifique bajo el microscopio si las células se han desprendido antes de continuar con el siguiente paso. Golpear suavemente la placa de cultivo celular con la mano puede ayudar a separar las células.
   3. Una vez que todas las células se hayan desprendido, apague la disociación con DMEM + 10% FBS y centrifugue a 350 × g durante 5 min.
   4. Para la primera expansión (cuando el 80-100% es confluente), vuelva a sembrar en una proporción de división de 1:1. Repita el paso 5.1.6 y cambie los medios 2D cada 2-3 días.
   5. En la segunda expansión (80-100% de confluencia), siembre todas las células en un plato de 100 mm resuspendiendo las células en 10 ml de medios 2D a 37 ° C. Repita el paso 5.1.6 y cambie el medio cada 2-3 días.
      NOTA: Este proceso requiere mucho tiempo y puede demorar hasta un mes completo. Si se trabaja con líneas celulares que tienen genes integrados viralmente para la sobreexpresión de proteínas, se recomienda mantener la selección de antibióticos presentes en los medios de crecimiento en todo momento. Si el marcador es una proteína fluorescente, realice la clasificación celular activada por fluorescencia lo antes posible (es decir, al final de la expansión de la placa de 100 mm).
3. Crioconservación
   1. Para el almacenamiento de estas celdas, pase como se describe en los pasos 5.2.1-5.2.3. Luego, vuelva a suspender ~ 1 ×^{10 6} células en 1 ml de medios de congelación 2D, que se compone de 80% de medios 2D, 10% de FBS y 10% de DMSO, y transfiéralos a un criotubo. Almacene las celdas siguiendo el paso 3.5.2.

6. Validación de líneas de organoides

1. Aislamiento del material genético de los organoides
   1. A partir de una suspensión de una sola célula, siembre dos domos al doble de la densidad celular habitual (1 × 10⁶ células/ml). Cambia MOM el día 3.
   2. El día 5, retire el medio, lave una vez con PBS y agregue 350 μL de tampón de lisis preferido directamente sobre las cúpulas. Después de 5 min de incubación a temperatura ambiente, o hasta que se disuelva el MMC, transfiera el lisado a un tubo de 1,5 ml.
   3. Para un uso prolongado, almacene el lisado a -80 °C. De lo contrario, continúe con el protocolo para la extracción de ADN y/o ARN utilizando la técnica de extracción preferida o un kit comercial.
2. Tinción de inmunofluorescencia (IF)
   1. Para preparar las células, pase como se describe en los pasos 3.2.1-3.2.5. Vuelva a suspender en una mezcla de 37,5 μL de MOM y 112,5 μL de BMM helado (suficiente para tres cúpulas de 50 μL que actuarán como réplicas biológicas). Siga el paso 3.2.6 y cambie de soporte el día 3 y el día 5.
   2. El día 7, aspire MOM y lave las células con 500 μL de PBS. Fije cada domo por separado agregando 500 μL de solución de paraformaldehído (PFA) al 4% precalentada (37 °C) en PBS directamente sobre el domo. Incubar a 37 °C durante 60 min hasta que se disuelva el BMM.
   3. Con una punta de pipeta P1000 de gran calibre (si no está disponible, simplemente corte una punta P1000 normal a unos 0,5 cm del extremo fino), recoja los organoides en PFA al 4% y transfiera el volumen a un tubo de 1,5 ml.
      NOTA: El uso de una punta de pipeta estándar hará que los organoides se rompan.
   4. Espere de 2 a 3 minutos para que los organoides se hundan hasta el fondo del tubo. Aspirar PFA al 4% (dejando una cantidad segura de volumen para no aspirar organoides) y añadir 500 μL de PBS para lavar los organoides. Repita este paso dos veces más, para un total de 3 lavados.
      NOTA: Es preferible esperar a que los organoides se hundan hasta el fondo que la centrifugación para preservar la forma de los organoides.
   5. Para almacenamiento a largo plazo (4-6 semanas), mantenga los organoides en PBS a 4 ° C. Para proceder con la tinción, permeabilizar con PBS + 1% Triton-X durante 30 min a temperatura ambiente. Lavar una vez con PBS.
   6. Bloquear con PBS + Triton-X al 0,2 % + 4 % de FBS + suero de ratón al 1 % durante 60 min a temperatura ambiente. Lavar una vez con PBS y dejar 100 μL de volumen en el tubo.
   7. Prepare el tampón de trabajo para la tinción de anticuerpos: PBS + 0,2% Triton-X, 0,4% FBS, 0,1% suero de rata. Este tampón funcionará tanto para anticuerpos primarios como secundarios.
   8. Para preparar la tinción de anticuerpos primarios, calcule que la dilución sea dos veces más concentrada que la dilución real necesaria. Prepare suficiente solución para agregar 100 μL de anticuerpo a los 100 μL de PBS restantes en cada tubo. Por ejemplo, para una dilución original de 1:1000, prepare 100 μL de solución 1:500.
   9. Incubar durante la noche a 4 °C. Después, lavar tres veces con 500 μL de PBS.
   10. Prepare la tinción de anticuerpos secundaria como se explica en el paso 6.2.8. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
       NOTA: A partir de este paso, asegúrese de cubrir el área de trabajo con papel de aluminio / caja oscura preferida para evitar el fotoblanqueo de los anticuerpos fluorescentes.
   11. Una vez finalizada la tinción secundaria, lavar tres veces con 500 μL de PBS. Retire la mayor cantidad de líquido posible del tubo después del último lavado para preparar la muestra para el montaje. Utilice una pipeta de 20 μl para ayudar a evitar la aspiración de los organoides.
   12. Con una punta de pipeta de gran calibre o cortada, agregue 20 μl de medios de montaje de su elección y homogeneice bien la solución, evitando las burbujas.
   13. Coloque una gota de organoides en la solución de montaje en un cubreobjetos rectangular. Con fórceps, coloque un cubreobjetos circular encima de la gota, evitando las burbujas, y déjelo secar durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente. Repita este paso en el mismo portaobjetos si se va a colocar más de una muestra por portaobjetos.
   14. Agregue otros 20 μl de medios de montaje directamente sobre el cubreobjetos circular. Ahora, cree un "sándwich" de montaje volteando el cubreobjetos rectangular 180° y colocándolo encima del portaobjetos del microscopio. Dejar secar en la oscuridad a temperatura ambiente durante al menos 8 h.
       NOTA: El portaobjetos debe estar en el siguiente orden de abajo hacia arriba: portaobjetos de microscopio, cubreobjetos circulares, organoides, portaobjetos rectangulares. Esto crea condiciones óptimas para la imagen.

7. Desarrollo de modelos tumorales en ratones

1. Preparación de células
   1. Descongele un vial de células 2D de su elección en medios 2D. Permita que estas células crezcan y se expandan a una placa de 150 mm. Si las células tienen marcadores de selección de antibióticos, seleccione las células antes de la inyección para asegurar una población pura de las células deseadas.
   2. Para 5 inyecciones de ratón, expanda las células a dos placas de 150 mm. Cuando las placas sean 80% confluentes, recolecte las células siguiendo los pasos 5.2.2-5.2.3. Resuspender las células en 1 ml de medio de suero reducido Opti-MEM I y medir la concentración celular.
      NOTA: Cada inyección contiene 4 × 10⁶ células; sin embargo, se recomienda prepararse para una inyección adicional para tener en cuenta el volumen muerto de las jeringas. En este caso, prepare 24 × 10⁶ celdas en lugar de 20 × 10⁶ celdas.
   3. Coloque todo el volumen celular para todas las inyecciones en un tubo de 1,5 ml. Preparar un total de 44 μL por inyección, compuesto por 1 parte de células en Opti-MEM I sin suplemento y 1 parte de BMM helado. Por ejemplo, para 24 × 10⁶ células (6 inyecciones), vuelva a suspender en 132 μL de Opti-MEM I y 132 μL de BMM.
   4. Mezcle bien las células y manténgalas en hielo hasta realizar la inyección.
2. Preparándose para el procedimiento
   1. Expulse las burbujas de aire del volumen muerto de la jeringa (insulina U-100 28 G) con PBS frío.
   2. Usando las células en el tubo de 1.5 ml, prepare cinco inyecciones de 40 μl cargando lentamente la jeringa para evitar la lisis de las células debido a las fuerzas de cizallamiento dentro de la aguja. Mantener en hielo hasta que los ratones estén sedados.
   3. Una vez que todo esté preparado para las inyecciones, coloque las jeringas junto a la lámpara calefactora para que el BMM se caliente y se vuelva viscoso, facilitando la inyección y el injerto. No los coloque directamente debajo de la lámpara de calentamiento, ya que el BMM demasiado solidificado no pasará a través de la jeringa de manera adecuada. En general, trabaje rápido para evitar que esto suceda.
3. Inyección intrabursal (IBI) en el ovario
   1. Anestesiar un ratón C57BL/6J con ketamina (100 mg/ml). Administrar 0,1 mL por 10 g de peso corporal mediante inyección intraperitoneal.
      NOTA: Los ratones hembra jóvenes a menudo solo requieren inyecciones de 0,2 ml, pero pueden necesitar más si son mayores. Esto proporcionará anestesia durante 20-40 minutos de duración, pero no proporcionará ninguna analgesia.
   2. Coloque el ratón en una jaula que haya sido calentada por la lámpara calefactora.
      NOTA: No coloque ratones directamente debajo de la lámpara de calefacción, ya que esto puede causar necrosis de la cola e hipertermia, que pueden ser letales.
   3. Una vez que el primer ratón esté completamente anestesiado, mediante una técnica aséptica, corte una incisión de <1 cm a lo largo del flanco de un ratón C57BL / 6J en la región del abdomen y por encima del muslo. Asegúrese de atravesar la epidermis y la hipodermis antes de llegar a la región de la bursa.
   4. Saca con cuidado el ovario (que se encuentra fácilmente por la almohadilla de grasa adherida a él). Tome una de las jeringas preparadas e inyecte las células lentamente a través de la almohadilla de grasa justo detrás del ovario, a través del ovario mismo, en el saco del oviducto.
      NOTA: Una inyección exitosa hará que el saco del oviducto se hinche con BMM. Es probable que la mezcla también se filtre por toda la almohadilla de grasa, lo cual es normal.
   5. Vuelva a colocar con cuidado el ovario en la bolsa y cierre la incisión con grapas quirúrgicas o cosiendo.
   6. Vuelve a colocar el ratón en la jaula. Use una lámpara calefactora para mantener calientes a los ratones mientras se recuperan después de la operación hasta que estén semiconscientes (>15 min). Al día siguiente, revise el ratón para verificar que no se haya producido sepsis durante la noche.

Resultados

En la Figura 1 se muestra un esquema que resume el flujo de trabajo para generar y validar el cáncer de ovario HGSOC. Este proceso comienza con la extracción de tejido de las trompas de Falopio de un ratón hembra de tipo salvaje C57BL / 6J (Figura 2A). Se recomienda comenzar con un trozo de tejido generoso para garantizar una recolección adecuada. El uso de un microscopio de disección permite el aislamiento preciso de la trompa ...

Discusión

A pesar de los avances significativos en la investigación oncológica, el HGSOC sigue siendo el tipo más agresivo de neoplasia maligna ginecológica y la principal causa de mortalidad entre todos los cánceres de ovario^23,24. A medida que la investigación en oncología ginecológica ha evolucionado, también deberían hacerlo los modelos utilizados en ella. De hecho, se ha descubierto que muchas líneas celulares modelo de cáncer de ovar...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,25% de tripsina, 0,1% de EDTA en HBSS sin calcio, magnesio y bicarbonato de sodio	Corning	25053CI
A83-01	Tocris Bioscience	2939
DMEM/F12 avanzado	Gibco	12-634-028
De C57BL/6J (mujer)	El Laboratorio Jackson	000664
Mini kit de ADN/ARN AllPrep	QIAGEN	80204	Para la extracción de ADN/ARN
Alt-R S.p. Cas9-GFP V3	Tecnologías integradas de ADN	10008100
Anticuerpo anti-Ki67	Abcam	ab15580
Sistema AutoClip	Herramientas Científicas Fines	12020-00	Para cierre de heridas tras IBI
Suplemento de B-27 (50x), sin suero	Gibco	17-504-001
Blasticidina HCl (10 mg/mL) 50 mg	InvivoGen	ANT-BL-05
Albúmina sérica bovina	Sigma Aldrich	A9647
Buffer RLT Plus	QIAGEN	1053393	Para lisar células antes de la extracción de ADN/ARN
Solución de Recuperación Celular	Corning	354253
Colagenasa/Hialuronidasa	Tecnologías STEMCELL	07912
CoraLite 594-Faloidina (rojo)	Proteintech	PF00003
Vidrio de cubierta 15CIR-1	Fisherbrand	12-545-83
Tapa de vidrio 24 mm y agudo; 40 mm-1	Fisherbrand	12-544-12
Suplemento N-2 de CTS (Sistemas de Terapia Celular)	Gibco	A1370701
DAPI	Roche	10236276001
Desoxirribonucleasa I (DNAsa I) del páncreas bovino	Sigma Aldrich	D5025
Leche desnatada Difco	Becton Dickinson	232100
Dispasa	Tecnologías STEMCELL	07913
DMEM con L-glutamina, 4,5 g/L de glucosa y piruvato de sodio	Corning	10013CV
DNasa I recombinante, libre de RNasa	Roche	04716728001
Solución tamponada con fosfato de Dulbecco	Sigma Aldrich	D8537
Dumont #5 - Pinzas recubiertas de cerámica	Herramientas Científicas Fines	11252-50	Para la disección de la trompa de Falopio
Suero fetal bovino	Corning	35-010-CV	Inactivación por calor a 56 °C; C durante 60 minutos.
Tijeras Finas - ToughCut	Herramientas Científicas Fines	14058-09	Para la extracción de trompas de Falopio e incisión IBI
Antibiótico selectivo de genética (G418 Sulfato) (50 mg/mL)	Gibco	10131027
Suplemento GlutaMAX (100 veces)	Gibco	35-050-061
Anticuerpo secundario adsorbido cruzado contra IgG de conejo (H+L) de cabra, cianano3	Invitrogen	A10520
Pinzas Graefe	Herramientas Científicas Fines	11053-10	Para manipulación de tejidos
Búfer HEPES	Corning	25060CI
Proteína recombinante R-Spondin 1 humana	PeproTech	120-38
Jeringuilla de insulina, U-100 0,5 mL 0,36 mm (28 G)x 12,7 mm (1/2")	BD	BD329461
Insulina-Transferrina-Selenio (ITS -G) (100x)	Gibco	41-400-045
L-Glutamina 200 mM (100x)	Gibco	25-030-081
Matriz de membrana basal GFR Matrigel	Corning	356231	BMM
Proteína recombinante EGF del ratón	PeproTech	315-09
Proteína recombinante FGF-básica del ratón	PeproTech	450-33
Proteína recombinante de Noggin de ratón	PeproTech	250-38
Proteína recombinante Wnt-3a del ratón	PeproTech	315-20
Suplemento N2	Gibco	17502048
Amida de N-acetilcisteína	Sigma Aldrich	A0737
Sistema de electroporación Neon NxT	Invitrogen	NEON1S	Para electroporación CRISPR-Cas9
Sistema de electroporación Neon NxT 10-μ Kit L con tubos de 1 canal	Invitrogen	N1025	Consumibles para electroporación, incluyendo buffer de edición genómica
Nicotinamida	Sigma Aldrich	N3376
Suero normal para ratones	Invitrogen	10410
Suero normal para ratas	Tecnologías STEMCELL	13551
Medio sérico reducido Opti-MEM I	Gibco	31985070
Anticuerpo policlonal PAX8	Proteintech	10336-1-AP
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)	Gibco	15-140-122
Puromicina	Sigma Aldrich	P8833
Selectfrost 25 mm y agudo; 75 mm y agudo; 1,0 mm	Fisherbrand	12-550-003
Triton X-100	Biorreactivos de Fisher	BP151
TrypLE Express Enzyme (1x), sin fenol rojo	Gibco	12-604-013
Tijeras de muelle Vannas - Filo de corte de 4 mm	Herramientas Científicas Fines	15019-10	Para la disección de la trompa de Falopio
Y27632	Tecnologías STEMCELL	72304	Inhibidor de la rhoquinasa (ROCK) y nbsp;