Un flujo de trabajo verificado para el procesamiento de datos MiRNA-Seq y el análisis bioinformático mediante R

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para analizar datos de miRNA-Seq usando R. El flujo de trabajo permite a los investigadores explorar las redes reguladas por miARN y su importancia en diversas cuestiones biológicas y clínicas. Este trabajo pretende servir como una guía práctica tanto para investigadores novatos como experimentados en el campo de la bioinformática de miARN.

Abstract

Los microARN (miARN) son reguladores postranscripcionales críticos que influyen en una amplia gama de procesos fisiológicos y patológicos. Con el avance de las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, miRNA-Seq se ha convertido en una poderosa herramienta para perfilar patrones de expresión de miRNA. Sin embargo, la interpretación confiable de dichos datos requiere una canalización de análisis estandarizada y reproducible. Aquí, presentamos un flujo de trabajo verificado para el procesamiento de datos miRNA-Seq y el análisis bioinformático utilizando R. Este protocolo abarca todos los pasos esenciales, incluido el preprocesamiento de datos sin procesar, el control de calidad, la alineación, la cuantificación, la normalización, el análisis de expresión diferencial, la predicción de objetivos, el enriquecimiento funcional y la construcción de redes reguladoras. Diseñado para brindar flexibilidad y transparencia, el flujo de trabajo integra paquetes R ampliamente adoptados y admite anotaciones específicas de especies y personalización modular. Además, se guía a los usuarios para que realicen una interpretación biológica posterior aprovechando bases de datos seleccionadas y herramientas de visualización como Cytoscape. Este protocolo no solo admite un análisis estadístico sólido, sino que también permite obtener información significativa sobre las interacciones miARN-ARNm y sus funciones en los mecanismos de la enfermedad. Es particularmente adecuado tanto para investigadores novatos como experimentados que realizan el descubrimiento de biomarcadores de miARN, el modelado de enfermedades o estudios multiómicos integradores.

Introduction

Los microARN (miARN) son moléculas cortas de ARN no codificantes que influyen significativamente en la expresión génica al actuar en la etapa postranscripcional¹. Por lo general, funcionan uniéndose a secuencias complementarias en las regiones no traducidas (UTR) 3' de los ARN mensajeros diana (ARNm), lo que lleva a la degradación del ARNm o a la represión traduccional¹. En las últimas dos décadas, los miARN han sido cada vez más reconocidos como reguladores centrales de varios procesos biológicos, incluida la proliferación celular, la diferenciación, la apoptosis, las respuestas inmunes....

Protocol

NOTA: Los materiales con enlaces de software se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Preparar muestras de ARN y bibliotecas de secuencias

NOTA: Realice la extracción y secuenciación de ARN fuera de este flujo de trabajo computacional. Hay más de una forma de analizar los datos de secuenciación de miARN. Esta sección proporciona el contexto de una práctica.

1. Extraer ARN total: Extraiga el ARN total de las muestras biológicas utilizando un kit optimizado para el aislamiento de ARN pequeño (por ejemplo, kit de aislamiento de miARN). Sig....

Results

Descargamos la matriz de expresión de microARN de GSE133530 y realizamos un análisis de expresión diferencial directamente. Proporcionamos un script de R analítico de ejemplo para el conjunto de datos en el archivo complementario 1. El conjunto de datos realizó un perfil global de miARN en 16 quistes renales de diferentes tamaños (quistes mínimos: menos de 1-5 ml, n = 10; quistes medianos: entre 10-25 ml, n = 4; quistes grandes: más de 50 ml, n = 4) y tejido mínimamente q.......

Discussion

El análisis de los datos de miRNA-Seq presenta distintos desafíos debido al pequeño tamaño y la redundancia de las lecturas, lo que hace que el control de calidad riguroso y el preprocesamiento sean críticos. Uno de los pasos más importantes en el flujo de trabajo es el recorte del adaptador. Debido a que los miARN tienen aproximadamente 22 nucleótidos de largo, las secuencias adaptadoras pueden dominar fácilmente las lecturas si no se eliminan adecuadamente. Si no se realiza un recorte .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent-021827 Microarray de miARN humano	Agilent	/	Una matriz comercial para perfilar microARN de muestras humanas
Corbatín	Universidad Johns Hopkins	http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml	Una herramienta de software para alinear lecturas de secuenciación con secuencias de referencia largas
clusterProfiler (paquete R)	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	Un paquete de R diseñado para el análisis de enriquecimiento funcional y la visualización de datos biológicos de alto rendimiento.
Cutadapt	Código abierto	https://cutadapt.readthedocs.io	Una herramienta de línea de comandos que elimina secuencias de adaptadores, cebadores, colas poli-A y otros fragmentos no deseados de las lecturas de secuenciación de alto rendimiento.
Citopaisaje	Consorcio Cytoscape	https://cytoscape.org/	Una plataforma de software de código abierto diseñada para la visualización y el análisis de redes biológicas complejas.
DESeq2 (paquete R)	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/DESeq2/	Un paquete R diseñado para el análisis diferencial de la expresión génica de los datos de recuento
EnhancedVolcano (paquete R)	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/EnhancedVolcano/	Un paquete de R diseñado para crear gráficos de volcanes con calidad de publicación.
FastQC	Bioinformática de Babraham	https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/	Una herramienta de control de calidad de código abierto para datos de secuenciación de alto rendimiento.
característicaCuenta	Subleer / SourceForge	http://subread.sourceforge.net/	Un programa utilizado para contar lecturas asignadas a características genómicas
HTSeq-count	Paquete Python	https://htseq.readthedocs.io	Una herramienta de línea de comandos que cuenta cuántas lecturas de secuenciación de alto rendimiento alineadas se superponen a características genómicas como genes o exones. Yo
Illumina Human v2 MicroRNA expression beadchip	Illumina	/	Una matriz comercial para perfilar microARN de muestras humanas
multiMiR (paquete R)	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/multiMiR/	Un paquete R que proporciona la mayor colección integrada de microARN predichos y validados experimentalmente. interacciones objetivo junto con sus asociaciones con enfermedades y medicamentos.
Org. Hs.eg.db (paquete R)	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/	Un paquete de anotaciones diseñado para la investigación genómica humana (Homo sapiens).
R Software	Proyecto R	https://www.r-project.org/	Un proyecto de código abierto para la computación estadística
Rstudio	Postular PBC	/	Un entorno de desarrollo integrado ayuda a ser más productivo con R y Python
SAMtools	Código abierto	http://www.htslib.org/	Un paquete de software para manipular datos de secuenciación de próxima generación (NGS).