Un flujo de trabajo verificado para el procesamiento de datos MiRNA-Seq y el análisis bioinformático mediante R

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para analizar datos de miRNA-Seq usando R. El flujo de trabajo permite a los investigadores explorar las redes reguladas por miARN y su importancia en diversas cuestiones biológicas y clínicas. Este trabajo pretende servir como una guía práctica tanto para investigadores novatos como experimentados en el campo de la bioinformática de miARN.

Abstract

Los microARN (miARN) son reguladores postranscripcionales críticos que influyen en una amplia gama de procesos fisiológicos y patológicos. Con el avance de las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, miRNA-Seq se ha convertido en una poderosa herramienta para perfilar patrones de expresión de miRNA. Sin embargo, la interpretación confiable de dichos datos requiere una canalización de análisis estandarizada y reproducible. Aquí, presentamos un flujo de trabajo verificado para el procesamiento de datos miRNA-Seq y el análisis bioinformático utilizando R. Este protocolo abarca todos los pasos esenciales, incluido el preprocesamiento de datos sin procesar, el control de calidad, la alineación, la cuantificación, la normalización, el análisis de expresión diferencial, la predicción de objetivos, el enriquecimiento funcional y la construcción de redes reguladoras. Diseñado para brindar flexibilidad y transparencia, el flujo de trabajo integra paquetes R ampliamente adoptados y admite anotaciones específicas de especies y personalización modular. Además, se guía a los usuarios para que realicen una interpretación biológica posterior aprovechando bases de datos seleccionadas y herramientas de visualización como Cytoscape. Este protocolo no solo admite un análisis estadístico sólido, sino que también permite obtener información significativa sobre las interacciones miARN-ARNm y sus funciones en los mecanismos de la enfermedad. Es particularmente adecuado tanto para investigadores novatos como experimentados que realizan el descubrimiento de biomarcadores de miARN, el modelado de enfermedades o estudios multiómicos integradores.

Introduction

Los microARN (miARN) son moléculas cortas de ARN no codificantes que influyen significativamente en la expresión génica al actuar en la etapa postranscripcional¹. Por lo general, funcionan uniéndose a secuencias complementarias en las regiones no traducidas (UTR) 3' de los ARN mensajeros diana (ARNm), lo que lleva a la degradación del ARNm o a la represión traduccional¹. En las últimas dos décadas, los miARN han sido cada vez más reconocidos como reguladores centrales de varios procesos biológicos, incluida la proliferación celular, la diferenciación, la apoptosis, las respuestas inmunes y el desarrollo de órganos². Además, la desregulación de la expresión de miARN se ha implicado en la patogénesis de numerosas enfermedades, como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares, los trastornos neurológicos y la enfermedad renal³. Estos hallazgos resaltan el potencial de los miARN no solo como objetivos terapéuticos, sino también como biomarcadores mínimamente invasivos en el diagnóstico clínico.

Con el advenimiento de las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS), el estudio de los miARN ha entrado en una nueva era. A diferencia de los métodos basados en microarrays que se limitan a los miARN conocidos, la secuenciación de miARN (miRNA-Seq) permite un perfil completo, de alto rendimiento e imparcial de miARN conocidos y nuevos en diferentes tipos y condiciones de muestra⁴. miRNA-Seq proporciona una sensibilidad, precisión y rango dinámico superiores, lo que lo convierte en un método preferido para investigar patrones de expresión de miARN y descubrir mecanismos reguladores en entornos fisiológicos y patológicos⁵. Sin embargo, el análisis de los datos de miRNA-Seq presenta desafíos computacionales específicos, incluido el manejo de longitudes de lectura cortas, la eliminación de secuencias adaptadoras, la distinción entre miembros de la familia de miRNA estrechamente relacionados y la gestión de una alta redundancia en los recuentos de lectura⁶. Estas características requieren un flujo de trabajo analítico cuidadosamente diseñado y estandarizado.

Aunque se han desarrollado varias canalizaciones y herramientas de software para el análisis de datos de miRNA-Seq, muchas de ellas se basan en interfaces gráficas de usuario o flujos de trabajo fijos que limitan la flexibilidad y la reproducibilidad⁷. Por el contrario, el entorno de programación R proporciona una plataforma potente y personalizable para el análisis bioinformático⁸. R ofrece un rico ecosistema de paquetes para modelado estadístico, visualización de datos e integración con bases de datos biológicas. Esto permite a los usuarios realizar análisis completos y reproducibles de forma transparente y basada en scripts. Además, la naturaleza modular de los flujos de trabajo de R permite a los investigadores adaptar cada paso de acuerdo con los requisitos experimentales específicos, desde el preprocesamiento de datos sin procesar hasta la interpretación funcional.

En este protocolo, presentamos un flujo de trabajo de análisis miRNA-Seq verificado y completo implementado completamente en R, con el objetivo de proporcionar una solución reproducible y adaptable al usuario para los investigadores que trabajan con datos de expresión de miRNA. El flujo de trabajo comienza con el control de calidad y el recorte del adaptador de las lecturas de secuenciación sin procesar, seguido de la alineación con un genoma de referencia o secuencias de miARN conocidas. Los pasos posteriores incluyen la cuantificación de los recuentos de lecturas, la normalización, el análisis de expresión diferencial, la predicción del gen diana, el enriquecimiento funcional y la visualización de la red. El flujo de trabajo incorpora varios paquetes de R ampliamente utilizados y bien mantenidos, lo que garantiza tanto la confiabilidad como la compatibilidad con futuras actualizaciones y extensiones.

Una de las fortalezas centrales de este protocolo radica en su capacidad para ir más allá de los resultados de expresión diferencial y proporcionar una interpretación biológica significativa. Al integrar bases de datos seleccionadas de interacciones miARN-ARNm validadas y predichas, el flujo de trabajo permite a los usuarios identificar genes diana biológicamente relevantes. Estos objetivos pueden someterse a análisis de ontología genética y enriquecimiento de vías para descubrir los procesos biológicos y las vías moleculares afectados. En el paso final, las redes de interacción miARN-ARNm se pueden visualizar utilizando herramientas externas como Cytoscape⁹, lo que proporciona información sobre el panorama regulatorio e identifica miARN centrales clave con importancia funcional potencial.

Este método se ha aplicado con éxito en contextos de investigación clínica, incluidos estudios sobre enfermedad renal, donde los miRNAs circulantes sirven como biomarcadores prometedores para el diagnóstico y pronóstico¹⁰. Sin embargo, el diseño modular y flexible del flujo de trabajo lo hace adecuado para una amplia gama de aplicaciones, incluido el modelado de enfermedades, los estudios de respuesta a fármacos, la biología del desarrollo y la genómica comparativa. Los investigadores pueden adaptar fácilmente el flujo de trabajo para acomodar anotaciones específicas de especies, condiciones experimentales o capas adicionales de datos ómicos.

Al ofrecer una solución de código abierto basada en scripts, esta canalización centrada en R aborda varias de las principales limitaciones asociadas con las herramientas miRNA-Seq existentes, incluida la personalización limitada, la dependencia de interfaces gráficas no transparentes, la falta de soporte para organismos no modelo, la reproducibilidad deficiente debido a la ausencia de control de versiones y la dificultad para integrarse con marcos de análisis estadísticos y funcionales posteriores. Permite un control total sobre los parámetros de procesamiento de datos, fomenta la reproducibilidad a través de código controlado por versiones y promueve la transparencia en la investigación bioinformática. A medida que la importancia de los miARN continúa creciendo en el contexto de la biología de sistemas y la medicina traslacional, tener acceso a un marco de análisis confiable y adaptable se vuelve cada vez más esencial.

Protocol

NOTA: Los materiales con enlaces de software se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Preparar muestras de ARN y bibliotecas de secuencias

NOTA: Realice la extracción y secuenciación de ARN fuera de este flujo de trabajo computacional. Hay más de una forma de analizar los datos de secuenciación de miARN. Esta sección proporciona el contexto de una práctica.

1. Extraer ARN total: Extraiga el ARN total de las muestras biológicas utilizando un kit optimizado para el aislamiento de ARN pequeño (por ejemplo, kit de aislamiento de miARN). Siga cuidadosamente el protocolo del fabricante. Asegúrese de utilizar consumibles sin ARNasa y mantenga las muestras en hielo para minimizar la degradación.
2. Evaluar la integridad y la cantidad de ARN: Ejecute 1-2 μL del ARN extraído en un bioanalizador o dispositivo equivalente. Verifique el número de integridad del ARN (RIN) y asegúrese de que sea ≥ 7.0 para una secuenciación confiable. Registre la concentración con un espectrofotómetro o fluorómetro.
3. Construir bibliotecas de ARN pequeñas: Prepare bibliotecas de secuenciación a partir de 1 μg de ARN total utilizando un kit comercial de preparación de bibliotecas de secuenciación de ARN pequeño. Siga el protocolo del kit para ligar adaptadores, transcribir de forma inversa y amplificar el ADNc. Purifique los productos de PCR con selección de tamaño (por ejemplo, inserto de 18-30 nt) para enriquecer los fragmentos de miARN.
4. Bibliotecas de secuencia: cargue las bibliotecas en una plataforma de secuenciación de alto rendimiento. Establezca la configuración de ejecución para la secuenciación de un solo extremo con una longitud de lectura de ~50 pb. Asegúrese de que cada muestra genere aproximadamente 10 millones de lecturas sin procesar para lograr una profundidad suficiente.
5. Exportar salida de secuenciación: Después de la secuenciación, exporte los datos sin procesar como archivos FASTQ utilizando el software de salida de datos del instrumento. Compruebe que el directorio de salida contiene las lecturas de secuencia y los archivos de puntuación de calidad asociados. Almacene los archivos FASTQ en un directorio estructurado para el análisis posterior.

2. Preprocese las lecturas sin procesar y realice el control de calidad

1. Secuencias de adaptadores de recorte
   1. Instale y configure Cutadapt o fastp.
   2. Ejecute el recorte del adaptador en cada archivo FASTQ mediante el siguiente comando:
      cutadapt -a XXXX -o trimmed_reads.fastq raw_reads.fastq
      NOTA: La secuencia del adaptador seguida después de '-a' debe aplicarse con el kit de preparación de la biblioteca de ARNs específico. '-o' define el nombre del archivo de salida con el archivo de entrada seguido.
2. Evaluar la calidad de lectura
   1. Utilice FastQC para generar informes de control de calidad:
      fastqc trimmed_reads.fastq
   2. Revise las puntuaciones de calidad por base, la distribución de la longitud de lectura y la contaminación del adaptador: abra el informe HTML de FastQC generado para cada archivo FASTQ en un navegador web. Examine los siguientes módulos paso a paso:
      1. Calidad de secuencia por base: asegúrese de que la mayoría de las bases se encuentren dentro de la zona verde (puntuación Phred ≥30). Busque cualquier caída en la calidad en el extremo 3 'que pueda indicar errores de secuenciación.
      2. Distribución de longitud de lectura: Confirme que la distribución corresponde al tamaño de inserción esperado (por ejemplo, 18-30 nt para miARN). Compruebe que no haya picos inesperados.
      3. Contenido del adaptador: compruebe que las secuencias del adaptador se han recortado eficazmente. Confirme que el porcentaje de contaminación del adaptador sea cercano a cero después del recorte.
   3. Guarde el informe de resumen de FastQC y marque las muestras con métricas de mala calidad para recortarlas o excluirlas de un análisis posterior.

3. Mapear lecturas y generar matrices de conteo

1. Alinear lecturas con referencia
   1. Descargue el archivo FASTA del genoma de referencia o de las secuencias de miARN maduras (por ejemplo, de miRBase)¹¹. Ejemplo:
      wget ftp://mirbase.org/pub/mirbase/CURRENT/mature.fa
   2. Indexe el genoma de referencia usando Bowtie.
      1. Abra una terminal y ejecute el siguiente comando para compilar el índice:
         bowtie-build reference.fa reference_index
      2. Reemplace reference.fa con el nombre de archivo FASTA real.
      3. Reemplace reference_index por el prefijo deseado para el índice.
      4. Asegúrese de que Bowtie genere varios archivos de índice (por ejemplo, .ebwt). Compruebe que estos archivos están presentes en el directorio de trabajo, ya que son necesarios para la alineación.
   3. Alinee las lecturas con Bowtie con parámetros adecuados para lecturas cortas. Ejemplo:
      bowtie -v 0 -a --best --strata reference_index trimmed_reads.fastq > aligned_reads.sam
      NOTA: El archivo de entrada es trimmed_reads.fastq y el archivo de salida es aligned_reads.sam. '-v 0' significa que no permitimos ningún error en toda la lectura. '-a -best -strata' significa que desechamos cualquier alineación que tenga más desajustes que la mejor.
2. Cuantificar la expresión de miARN
   1. Convierta archivos SAM a formato BAM usando SAMtools.
      samtools view -S -b aligned_reads.sam > aligned_reads.bam
      NOTA: El archivo de entrada aligned_reads.sam es el resultado del último comando. El archivo de salida aligned_reads.bam se prepara para su posterior análisis.
      1. Utilice SAMtools para comprimir y ordenar el archivo de alineación:
         samtools sort aligned_reads.bam -o aligned_reads_sorted.bam
samtools index aligned_reads_sorted.bam
      2. Asegúrese de que el primer comando convierte el archivo SAM en formato BAM.
      3. Asegúrese de que el segundo comando ordena el archivo BAM por coordenadas genómicas.
      4. Asegúrese de que el tercer comando genera un archivo de índice (.bai), que es necesario para los análisis posteriores.
      5. Confirme que tanto el archivo BAM ordenado como su índice se han creado correctamente antes de continuar con la cuantificación.
   2. Utilice featureCounts o HTSeq-count para generar una matriz de recuento utilizando la anotación de miARN GTF:
      featureCounts -a miRNA.gtf -o counts.txt aligned_reads.bam
      NOTA: featureCounts cuantifica las lecturas en el archivo de entrada aligned_reads.bam basado en miRNA.gtf y genera counts.txt.

4. Realizar análisis de expresión diferencial en R

1. Datos de recuento de carga
   1. Importar matriz de recuento y metadatos de muestra en R:
      library(DESeq2)
countData <- read.csv("counts.csv", row.names=1)
colData <- read.csv("metadata.csv", row.names=1)
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = countData, colData = colData, design = ~ condition)
      NOTA: Los datos de recuento (counts.csv) y el grupo de muestras (metadata.csv) deben proporcionarse a DESeq2. 'condición' aquí aclara el grupo de muestras proporcionadas. Para requisitos individuales, consulte el Manual de DESeq2¹².
2. Normalizar y transformar datos
   1. Normalice los datos de recuento utilizando el método predeterminado de DESeq2:
      dds <- DESeq(dds)
   2. Realice la transformación de estabilización de varianza:
      vsd <- vst(dds, blind=FALSE)
   3. Visualice la agrupación de muestras mediante PCA:
      plotPCA(vsd, intgroup="condition")
3. Identificar miARN expresados diferencialmente
   1. Extraiga y ordene los resultados de la expresión diferencial:
      res <- results(dds)
resOrdered <- res[order(res$pvalue), ]
      NOTA: Reordenamos el archivo de resultados 'res' en función del valor de pvalue.
      summary(res)
   2. Filtro para miARN expresados significativamente diferencialmente (valor p < 0,05, |log2FC| > 1).
      sig_miRNA <- subset(res, pvalue < 0.05 & abs(log2FC) > 1)
      NOTA: Existen múltiples umbrales para filtrar miARN significativamente modificados. Los requisitos «valor p < 0,05, |log2FC| > 1' se aplican ampliamente. Los umbrales se pueden ajustar para datos individuales.
4. Visualización de cambios de expresión
   1. Instale y cargue el paquete EnhancedVolcano.
   2. Cree el gráfico del volcán:
      library(EnhancedVolcano)
EnhancedVolcano(res,
lab = rownames(res),
x = 'log2FoldChange',
y = 'pvalue',
title = 'Differentially Expressed miRNAs')

5. Predecir genes diana de miARN

1. Bases de datos de consulta
   1. Utilice recursos en línea como TargetScan, miRDB y miRTarBase para buscar microARN específicos y recuperar genes diana.
   2. Concéntrese en objetivos validados experimentalmente para una mayor confianza.
2. Automatizar la predicción en R
   1. Cargue el paquete multiMiR y consulte los destinos validados:
      library(multiMiR)
target_results <- get_multimir(mirna = c("hsa-miR-21-5p"), table = "validated")
      NOTA: Aquí tomamos "has-miR-21-5p" por ejemplo y obtenemos objetivos validados.
   2. Extraiga símbolos de genes diana únicos para el análisis de enriquecimiento:
      genes <- unique(target_results@data$target_symbol)

6. Realizar análisis de enriquecimiento funcional

1. Realizar enriquecimiento de GO
   1. Herramientas de enriquecimiento de carga:
      library(clusterProfiler)
library(org.Hs.eg.db)
      NOTA: Aquí, cargamos una base de datos que contiene anotaciones del genoma humano, que son útiles para convertir identificadores de genes comunes.
   2. Ejecute análisis de enriquecimiento de GO para procesos biológicos:
      ego <- enrichGO(gene = genes,
OrgDb = org.Hs.eg.db,
keyType = "SYMBOL",
ont = "BP",
pAdjustMethod = "BH",
pvalueCutoff = 0.05)
dotplot(ego)
      NOTA: Para el uso de enrichGO, proporcionamos una lista de genes y aclaramos que están nominados como 'SÍMBOLO' aquí. Realizamos el enriquecimiento del proceso biológico, que corresponde al parámetro 'ont = "BP" '. Realizamos múltiples correcciones de prueba, por lo que designamos pAdjustMethod = "BH". Para un umbral significativo, elegimos pvalueCutoff = 0.05.dotplot presenta un resultado visualizado. Para obtener opciones más individuales, consulte el Manual de clusterProfiler¹³.
2. Realizar el enriquecimiento de la vía KEGG
   1. Ejecute el enriquecimiento de KEGG:
      ekegg <- enrichKEGG(gene = genes, organism = 'hsa')
dotplot(ekegg)
      NOTA: Para el uso de enrichKEGG, proporcionamos una lista de genes y aclaramos el organismo como humano ("tiene"). dotplot presenta un resultado visualizado. Para obtener opciones más individuales, consulte el Manual de clusterProfiler¹³.

7. Construir y visualizar la red de interacción miARN - ARNm

1. Exportar datos para la visualización de la red
2. Cree un marco de datos de pares de genes diana de miARN basado en las dianas generadas a partir de TargetScan, miRDB o miRTarBase.
3. Escriba la tabla de red en CSV:
   write.csv(miRNA_target_pairs, "network.csv")
4. Importar a Cytoscape
   1. Abra Cytoscape e importe la tabla de red.
   2. Visualice la red mediante un diseño circular o dirigido por fuerza.
   3. Analice las propiedades topológicas (por ejemplo, la centralidad de grados) para identificar miARN centrales.

Results

Descargamos la matriz de expresión de microARN de GSE133530 y realizamos un análisis de expresión diferencial directamente. Proporcionamos un script de R analítico de ejemplo para el conjunto de datos en el archivo complementario 1. El conjunto de datos realizó un perfil global de miARN en 16 quistes renales de diferentes tamaños (quistes mínimos: menos de 1-5 ml, n = 10; quistes medianos: entre 10-25 ml, n = 4; quistes grandes: más de 50 ml, n = 4) y tejido mínimamente q...

Discussion

El análisis de los datos de miRNA-Seq presenta distintos desafíos debido al pequeño tamaño y la redundancia de las lecturas, lo que hace que el control de calidad riguroso y el preprocesamiento sean críticos. Uno de los pasos más importantes en el flujo de trabajo es el recorte del adaptador. Debido a que los miARN tienen aproximadamente 22 nucleótidos de largo, las secuencias adaptadoras pueden dominar fácilmente las lecturas si no se eliminan adecuadamente. Si no se realiza un recorte ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent-021827 Microarray de miARN humano	Agilent	/	Una matriz comercial para perfilar microARN de muestras humanas
Corbatín	Universidad Johns Hopkins	http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml	Una herramienta de software para alinear lecturas de secuenciación con secuencias de referencia largas
clusterProfiler (paquete R)	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	Un paquete de R diseñado para el análisis de enriquecimiento funcional y la visualización de datos biológicos de alto rendimiento.
Cutadapt	Código abierto	https://cutadapt.readthedocs.io	Una herramienta de línea de comandos que elimina secuencias de adaptadores, cebadores, colas poli-A y otros fragmentos no deseados de las lecturas de secuenciación de alto rendimiento.
Citopaisaje	Consorcio Cytoscape	https://cytoscape.org/	Una plataforma de software de código abierto diseñada para la visualización y el análisis de redes biológicas complejas.
DESeq2 (paquete R)	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/DESeq2/	Un paquete R diseñado para el análisis diferencial de la expresión génica de los datos de recuento
EnhancedVolcano (paquete R)	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/EnhancedVolcano/	Un paquete de R diseñado para crear gráficos de volcanes con calidad de publicación.
FastQC	Bioinformática de Babraham	https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/	Una herramienta de control de calidad de código abierto para datos de secuenciación de alto rendimiento.
característicaCuenta	Subleer / SourceForge	http://subread.sourceforge.net/	Un programa utilizado para contar lecturas asignadas a características genómicas
HTSeq-count	Paquete Python	https://htseq.readthedocs.io	Una herramienta de línea de comandos que cuenta cuántas lecturas de secuenciación de alto rendimiento alineadas se superponen a características genómicas como genes o exones. Yo
Illumina Human v2 MicroRNA expression beadchip	Illumina	/	Una matriz comercial para perfilar microARN de muestras humanas
multiMiR (paquete R)	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/multiMiR/	Un paquete R que proporciona la mayor colección integrada de microARN predichos y validados experimentalmente. interacciones objetivo junto con sus asociaciones con enfermedades y medicamentos.
Org. Hs.eg.db (paquete R)	Bioconductor	https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/	Un paquete de anotaciones diseñado para la investigación genómica humana (Homo sapiens).
R Software	Proyecto R	https://www.r-project.org/	Un proyecto de código abierto para la computación estadística
Rstudio	Postular PBC	/	Un entorno de desarrollo integrado ayuda a ser más productivo con R y Python
SAMtools	Código abierto	http://www.htslib.org/	Un paquete de software para manipular datos de secuenciación de próxima generación (NGS).