Artículo de método

Moldes personalizados impresos en 3D para imágenes de pez cebra y desarrollo cardíaco

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DOI:

10.3791/68768

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15 de agosto de 2025

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1Department of Biology, University of Mississippi

En este artículo

Resumen

Aquí describimos un método que utiliza una impresora 3D estereolitográfica de bajo costo para crear moldes que faciliten el montaje reproducible de embriones de pez cebra para estudios de imágenes. Usando este método, hemos creado moldes para obtener imágenes de la morfogénesis cardíaca en embriones de pez cebra.

Resumen

El montaje de embriones es uno de los desafíos técnicos que encuentran los investigadores al emprender un proyecto de imágenes. Los embriones deben orientarse de manera reproducible de modo que el tejido de interés sea accesible a un objetivo de microscopio durante todo el período de imagen. Para superar este desafío, los investigadores pueden incrustar embriones en medios viscosos o crear placas y moldes especializados para mantener los embriones en la orientación deseada durante la obtención de imágenes. Aquí, describimos un método para usar una impresora 3D estereolitográfica (SLA) de bajo costo para fabricar moldes reutilizables que crean pozos de agarosa en los que se pueden montar embriones para obtener imágenes. Estos pocillos de agarosa proporcionan un medio confiable para orientar múltiples embriones para obtener imágenes. Este método incluye un marco de diseño que se puede personalizar fácilmente para una variedad de tejidos, organismos y desafíos de imágenes. Usando este método, hemos creado moldes para obtener imágenes del desarrollo cardíaco en el pez cebra para microscopios verticales e invertidos. Al utilizar materiales y equipos accesibles, este método permite a los investigadores crear fácilmente moldes específicos para sus necesidades de montaje.

Introducción

Visualizar la dinámica celular dentro de un animal intacto es esencial para comprender las patologías de las enfermedades congénitas y los procesos fundamentales de desarrollo y homeostasis. Esta visualización abarca imágenes a múltiples escalas espaciales para identificar la dinámica fisiológica en todo un organismo, así como a nivel tisular, celular y subcelular. Las modalidades de imagen utilizadas para visualizar la dinámica celular van desde estudios de inmunofluorescencia de muestras fijas hasta imágenes de lapso de tiempo de muestras vivas. Estas modalidades de imágenes requieren mantener muestras intactas en orientaciones específicas, de modo que una región de interés sea accesible para el objetivo del microscopio.

Los embriones de pez cebra son un organismo modelo ideal para estudios de imagen debido a su transparencia óptica, tratable genético, fertilización externa y origen vertebrado. Sin embargo, el montaje de embriones de pez cebra en una orientación específica de manera consistente y reproducible ha representado un desafío continuo. El montaje es especialmente desafiante para la visualización del desarrollo del corazón en embriones de pez cebra porque la morfogénesis cardíaca ocurre en diferentes planos1.

Se han desarrollado múltiples enfoques para abordar los desafíos de montar embriones para obtener imágenes. Uno de los métodos más simples consiste en montar embriones de pez cebra entre dos cubreobjetos con capas de cinta adhesiva entre los cubreobjetos para evitar el aplastamiento. Este método permite obtener imágenes tanto en microscopios invertidos como verticales2. Los embriones de pez cebra también se pueden montar en un medio o gel altamente viscoso, como metilcelulosa o agarosa de baja temperatura de fusión al 0,1-0,8%, para mantener los embriones en orientaciones específicas 2,3,4. Estos enfoques de bajo rendimiento funcionan bien para muchos proyectos de imágenes; sin embargo, garantizar la integridad del embrión y obtener orientaciones específicas de manera reproducible puede ser problemático. Para aumentar el rendimiento de las imágenes y facilitar el montaje, se pueden crear pocillos espaciados regularmente a partir de agarosa solidificada en una placa de imágenes 5,6,7,8. Para facilitar la creación de estos pozos de agarosa, se han creado moldes de plástico 9,10,11. Si bien estos moldes se pueden aplicar a la obtención de imágenes a lo largo de los ejes dorsal-ventral-lateral estándar10,12, a menudo se fabrican para desafíos de imagen específicos, como para su uso en placas de 96 pocillos13 o para la detección del primer latido del corazón14. En casos especializados, se han creado placas de imagen completas 5,15,16. Por ejemplo, una cámara microfluídica (llamada ZEBRA) hecha de PDMS facilita tanto la obtención de imágenes como la exposición de embriones a sustancias químicas17. Estos moldes a menudo están hechos de silicona o mecanizados a partir de lucita 10,18,19. Sin embargo, la llegada de impresoras tridimensionales (3D) relativamente económicas ha democratizado la creación de moldes personalizados que se utilizan para crear pozos de imágenes de agarosa.

La impresión 3D, también llamada fabricación aditiva o por capas, implica la producción de un objeto 3D a partir de un diseño digital mediante la adición y fusión secuencial de capas individuales20,21. La estereolitografía (SLA) utiliza luz ultravioleta (UV) para curar una resina líquida sensible a la luz en capas secuenciales22. Las impresoras SLA son rentables, rápidas y altamente precisas y se pueden usar con una variedad de resinas, incluidas las que brindan una superficie lisa16. El proceso comienza con el software de diseño asistido por computadora (CAD), donde los modelos digitales del objeto pueden diseñarse de novo o modificarse a partir de diseños preexistentes. Luego, el modelo digital se corta virtualmente en capas imprimibles. Usando estas capas digitales, una impresora 3D construye el objeto, capa por capa. Aquí, presentamos un método y marco para el diseño personalizado y la creación de moldes de imágenes utilizando una impresora 3D SLA de bajo costo disponible comercialmente. Además, utilizamos este marco para crear moldes para obtener imágenes de diferentes etapas del desarrollo cardíaco del pez cebra en microscopios invertidos o verticales y para obtener imágenes de embriones de pez cebra a lo largo de sus ejes lateral, dorsal o ventral.

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Protocolo

Los protocolos, experimentos y hallazgos descritos aquí se llevaron a cabo de acuerdo con las regulaciones y pautas de bienestar animal, y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Mississippi (protocolo # 24-008).

Para crear pocillos de agarosa de diferentes formas en los que los embriones se pueden orientar para obtener imágenes, desarrollamos un diseño que utiliza una base unida a clavijas (Figura 1A). La forma de estas clavijas (ver flecha que apunta a clavijas en púrpura en la Figura 1A) se puede personalizar para orientar embriones de diferentes etapas de desarrollo y para enfocarse en diferentes tejidos. A continuación, describimos un protocolo para personalizar estas clavijas y para usar este sistema para crear pozos de agarosa.

1. Creación de un molde de imagen diseñado a medida

  1. Cree un boceto preliminar de la muestra o embrión colocado en la orientación deseada. Considere la orientación deseada del embrión y si el microscopio que se utilizará contiene objetivos verticales o invertidos. También considere el tamaño del plato, la cantidad de embriones que se montarán y el espacio entre ellos.
  2. Mida las dimensiones del embrión (por ejemplo, longitud, anchura y altura) utilizando un microscopio combinado con una herramienta de software como FIJI23. Utilice estas dimensiones para asegurarse de que los embriones encajen en los pocillos creados por las clavijas.
  3. Identifique una forma que corresponda a la geometría del embrión. Usando las mediciones del paso 1.2 en combinación con un software de diseño asistido por computadora (CAD), cree una clavija que se aproxime a la forma y el tamaño de la muestra.
    NOTA: Esta forma se puede crear en un programa de software CAD básico combinando y superponiendo diferentes formas prediseñadas, o la forma se puede crear de novo utilizando un programa de software CAD avanzado. Además, se puede modificar una de nuestras clavijas prediseñadas (ver Archivo complementario 1). Estrechar la clavija, como en la Figura 1A, puede ayudar a orientar los embriones para garantizar que el tejido de interés esté más cerca del objetivo.
  4. Combine el diseño de la clavija con el diseño de la base:
    1. En un programa de software CAD, agregue una clavija diseñada a medida a una de las bases prediseñadas (Archivo complementario 1). A continuación, duplique y coloque uniformemente las clavijas en toda la base para obtener imágenes de alto rendimiento utilizando las herramientas de un programa CAD avanzado. Verifique dos veces para asegurarse de que todas las clavijas alcancen la misma altura lejos de la base.
  5. Prepara el diseño para la impresión 3D:
    1. Transfiera el diseño del molde personalizado o uno de los moldes prediseñados (Archivo complementario 2) a un software de corte, que convierte el diseño en comandos para la impresora 3D.
    2. Dentro del software de la cortadora, asegúrese de rotar el diseño para que los componentes críticos, como las clavijas, se coloquen lejos de la etapa de la impresora. Para el soporte del cubreobjetos, que se imprime en una impresora de modelado por deposición fundida (FDM), coloque la impresión horizontalmente.
      NOTA: La rotación del diseño evitará la deformación, que puede ocurrir cuando las piezas delicadas se colocan cerca de la etapa de impresión.
    3. Agregue soportes dentro del software de corte para asegurarse de que los aspectos delicados del molde no se rompan durante la impresión. La función de colocación automática de soportes medios en el software junto con la curación manual garantiza una buena distribución de los soportes sin grandes espacios. Se utiliza una estrategia de relleno del 100% para crear un molde sólido.
    4. Imprima varias piezas simultáneamente utilizando un único archivo STL que contenga todos los moldes u organizando archivos STL individuales utilizando el software de corte.
  6. Imprenta
    NOTA: Las impresoras SLA son nuestro tipo de impresora 3D preferido para los moldes de imágenes debido a su viabilidad, precisión y creación de superficies lisas. Se utiliza una impresora FDM para hacer el soporte de cubreobjetos porque crea impresiones más ligeras y rígidas que las impresoras SLA.
    1. Comience con la siguiente configuración de impresión y optimice a partir de ahí: altura de capa de 0,05 mm; 5 capas inferiores; tiempo de exposición de 2,5 s; tiempo de exposición inferior de 35 s; Elevación inferior de 5 mm y distancia de elevación; Velocidad de elevación inferior de 60 mm/min; Velocidad de elevación de 80 mm/min; y velocidad de retracción de 210 mm/min.
      NOTA: Es probable que el usuario deba optimizar la configuración de impresión, ya que depende del tipo de resina, la temperatura ambiente y el modelo de impresora.
  7. Después de la impresión, lave los moldes con agua, retire los soportes y coloque los moldes bajo luz ultravioleta en una campana de cultivo de tejidos para asegurar la solidificación de la resina.
    NOTA: Lavar y curar los moldes a fondo es importante para evitar que la resina se desprenda y para evitar que el moho se deforme.
    Se deben usar guantes y una bata de laboratorio al manipular resina sin curar y limpiar los moldes, ya que la resina sin curar puede irritar la piel. Las impresoras SLA utilizan luz ultravioleta para curar la resina, que puede ser dañina para los ojos y la piel. Asegúrese de que la cámara de impresión esté bien cerrada y evite mirar directamente a la fuente de luz UV.

2. Un procedimiento para usar moldes impresos en 3D para crear pocillos de agarosa

  1. Hacer pozos de agarosa
    1. Haga pocillos de agarosa disolviendo agarosa al 2% (g / ml) en medios E3 (1.578 mM NaCl, 0.169 mM KCl, 0.249 mM CaCl2 * 2 H2O, 0.161 mM MgSO4 * 7H2O). Coloque un molde en el centro de un plato inferior con la flecha apuntando hacia el pozo (véase la Figura 2A, B). Pipetear 750 μL de agarosa fundida al 2%/E3 a lo largo de la mitad del perímetro del molde de imagen (ver Figura 2C).
      NOTA: La agarosa fundida debe ser no viscosa pero lo suficientemente fría como para pipetear sin crear burbujas. Utilizamos placas de 60 mm con un pocillo inferior de 30 mm, mientras que para los moldes diseñados para microscopios verticales, se puede utilizar una placa estándar de 60 mm. Se utiliza un protocolo ligeramente diferente para el molde de cribado (ver más abajo).
    2. Pipetee otros 750 μL de agarosa fundida al 2% / E3 a lo largo de la otra mitad del perímetro del molde de imágenes (consulte la Figura 2D).
    3. Espere de 5 a 7 minutos para que la agarosa se solidifique, observando la transición de un líquido transparente a un gel azul opaco (ver Figura 2E).
    4. Agregue una capa delgada de agarosa fundida alrededor del perímetro de la agarosa central solidificada.
      NOTA: Aunque no es estrictamente necesario, este paso ayuda a anclar la agarosa solidificada al plato y evita el desprendimiento inducido por el medio.
    5. Coloque el anillo exterior (Figura complementaria S1B) sobre el conjunto del molde de agarosa con la flecha apuntando hacia la agarosa (consulte la Figura 2F).
    6. Mientras sujeta suavemente el anillo exterior, tire con cuidado hacia arriba del molde interior para separarlo de la agarosa (véase la figura 2G).
      NOTA: Para evitar romper o dañar los pocillos de agarosa, no empuje demasiado fuerte el anillo exterior y no gire ni mueva el molde interior al tirar hacia arriba.
    7. Retire el anillo exterior, revelando los pocillos de agarosa en el plato inferior del cubreobjetos (Figura 2H).
    8. Inspeccione los pocillos de agarosa bajo un microscopio para confirmar el tamaño y la producción correctos.
      NOTA: Para obtener imágenes en un microscopio invertido, a menudo es necesario levantar una película delgada de agarosa del fondo del pocillo. Esto se puede hacer con fórceps.
  2. Protocolo modificado para usar el molde de cribado
    1. Vierta agarosa fundida al 2% / E3 en la placa de Petri hasta que esté aproximadamente a la mitad.
    2. Sostenga el molde con las clavijas hacia arriba y pipetee agarosa fundida al 2%/E3 en las clavijas, hasta que estén cubiertas (~3 ml).
      NOTA: Asegúrese de que no se introduzcan burbujas liberando solo el 90% de la agarosa fundida que se ha introducido en la pipeta.
    3. Con un movimiento de inclinación, coloque un extremo y luego todo el molde con las clavijas hacia abajo en la placa de Petri que contiene agarosa fundida (Figura complementaria S2).
    4. Deje que la agarosa se solidifique durante 5-7 min.
    5. Retire con cuidado el molde usando el mango para levantar un extremo y luego el otro extremo.

3. Montaje de embriones en pocillos de agarosa con y sin agarosa de baja temperatura de fusión

  1. Descorionar y anestesiar embriones en una solución de tricaína de 200 μg/ml antes del montaje.
    NOTA: Se requiere una solución de tricaína de ~400 μg/ml para detener los latidos del corazón.
    1. Sin usar agarosa de baja temperatura de fusión: llene el plato de imágenes con 1x E3 y tricaína (200 μg / ml), agregue embriones anestesiados descorionados al plato de imágenes, use fórceps para colocar y orientar los embriones en los pocillos de agarosa y luego obtenga imágenes (ver Figura 2I, J).
      NOTA: Debido a que las pinzas pueden dañar fácilmente un embrión, se puede usar un atizador de embriones en el que se inserta hilo de pescar de 0,41 mm de diámetro en un tubo capilar o en la punta de la pipeta y se asegura con superpegamento en su lugar24.
    2. Usando agarosa de baja temperatura de fusión:
      NOTA: Si bien los moldes están diseñados para colocar embriones en orientaciones específicas, el uso de agarosa a baja temperatura de fusión para mantener los embriones en su lugar puede garantizar que los embriones no se desplacen durante la obtención de imágenes o mientras transportan el plato de imágenes con los embriones montados al microscopio. Los pasos a continuación se derivan de nuestro protocolo anterior6.
      1. Cree tubos de agarosa de baja temperatura de fusión disolviendo agarosa de baja temperatura de fusión al 0,1-0,8% en 5 ml de medios E3 y calentando a 65-70 °C en un baño de agua. Ocasionalmente, invierta el tubo hasta que la agarosa de baja temperatura de fusión se haya disuelto. Alícuota la solución de agarosa de baja temperatura de fusión en tubos de microfuga y colóquelos en un bloque de calor a 42 °C. Deje que la solución se equilibre a 42 °C durante al menos 1 h.
        NOTA: Por lo general, es aconsejable utilizar una solución de agarosa de baja temperatura de fusión recién hecha.
      2. Con una pipeta Pasteur de vidrio de gran calibre, transfiera un solo embrión a un tubo que contenga la solución de agarosa de baja temperatura de fusión. Para evitar agregar exceso de líquido a la solución de agarosa de baja temperatura de fusión, transfiera solo el embrión y el líquido que lo rodea inmediatamente. Transfiera inmediatamente el embrión, que ahora está en agarosa de bajo punto de fusión, a uno de los pozos de agarosa. Regrese la solución de agarosa a baja temperatura de fusión al bloque térmico para su reutilización.
      3. Con fórceps o un atizador de embriones (ver paso 3.1.1), coloque el embrión en el pocillo para obtener imágenes.
      4. Repita los pasos 3.1.2.2-3.1.2.3 para los otros pocillos. Si los pocillos anteriores comienzan a secarse, use una pipeta p200 para agregar una pequeña cantidad de E3 (~ 50-100 μL) encima del pocillo.
  2. Una vez que los embriones se han montado en todos los pocillos y la agarosa a baja temperatura de fusión se ha solidificado, con una pipeta agregue lentamente la solución de tricaína / E3 a la placa de imágenes.
  3. Después de la obtención de imágenes, extraiga los embriones con cuidado de los pocillos con fórceps y deje que se desarrollen más para asegurarse de que las imágenes no causen defectos de desarrollo.
    NOTA: Los pocillos de agarosa se pueden extraer de la placa de imágenes, que se puede enjuagar y reutilizar. El enjuague con el limpiacristales disponible en el mercado y luego varias veces con ddH2O ayuda a eliminar los depósitos de sal en los cubreobjetos. Aunque no hemos experimentado toxicidad debido a rastros residuales de limpiacristales, se aconseja al investigador que confirme estos resultados utilizando sus propias condiciones de laboratorio.

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Resultados

El protocolo anterior se utilizó para diseñar moldes para obtener imágenes de diferentes etapas del desarrollo cardíaco en el pez cebra, incluida la fusión cardíaca, la formación del tubo cardíaco, el bucle cardíaco y la formación de cámaras. Dado que el desarrollo cardíaco no ocurre a lo largo de los principales ejes anatómicos del embrión, la forma de las clavijas se personalizó para diferentes etapas de desarrollo con el fin de colocar correctamente los embriones. Por ejemplo, la colocación interna anterior del corazó...

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Discusión

En este protocolo, describimos un método para diseñar moldes impresos en 3D que crean pocillos de agarosa que pueden facilitar el montaje de embriones o tejidos para estudios de imágenes. Estos moldes se pueden fabricar para obtener imágenes con microscopios verticales o invertidos y los pocillos de agarosa fabricados mediante el uso de estos moldes personalizados se pueden usar para aplicaciones de imágenes que van desde estudios de inmunofluorescencia de embriones fijos hasta imágenes ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio Bloomekatz, especialmente a Sasmitha Singh y Allison Holmes, así como al núcleo de imágenes GlyCORE (apoyado por P20GM130460), al laboratorio IDEA de la Universidad de Mississippi, al Dr. Yiwei Han y al laboratorio Han, y a los miembros de las comunidades de Glicociencia y Biología del Desarrollo de la Universidad de Mississippi. Este trabajo cuenta con el apoyo financiero de los NIH (R15HD108782, P20GM130460).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Impresora 3D SLAElegooMARS 2 PRO
Agarose Apex Bioresearch; Genesee Scientific 20-102QDCualquier marca puede ser sustituida
Autodesk Fusion 360Autodesk Inc.https://www.autodesk.com/products/fusion-360/ Software de diseño de ayuda informática (CAD) - más avanzado
Microscopio vertical Axio-ZoomZeissAxio Zoom.V16
ChituboxCBD-Techhttps://www.chitubox.com/Software de corte
Plato inferior de cubreobjetos (plato de 60 mm con pocillo inferior de 30 mm)CellvisD60-30-1.5N
F59 Cadena pesada de miosina (todas las isoformas rápidas)DHSBF591:50 dilución
Filamentos FDMBambúPLA filamentos
impresora FDMBambúBambú X1 Carbono FDM0.4mm boquilla extrusora
PinzasFisher16-100-121Es probable que otras marcas sean adecuadas
Anti-ratón de cabra Alexa 488ThermoFisher#A28175Dilución 1:300
ImarisAndor10.2Software
Microscopio confocal invertidoLeicaLeica SP8 X
Agarosa de baja temperatura de fusiónGold BiotechnologyCatálogo No: A-204-25Es probable que otras marcas sean adecuadas
Bomba de pipetaBel-ArtF37898
Resina para impresora SLAElegooElegoo P05BB028Resina de fotopolímero lavable con agua V2.0
Ricinus communis aglutinina (RCA-120)Vector labs#RLK-2200 (kit de lectina)Dilución 1:300
TinkerCADAutodesk Inc.https://www.tinkercad.com/Software de diseño de ayuda informática (CAD) -
básico Tricaine S Western Chemical, Inc.ANADA #200-226
Aglutinina de germen de trigo (WGA)Vector labs#RLK-2200 (kit de lectina)Dilución 1:300
Pipeta Pasteur de vidrio de gran calibre Duran Wheaton Kimble (DWK)63A53WT

Referencias

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