Aquí, presentamos un protocolo para preservar la arquitectura arterial humana mediante la infusión de gel estabilizador de tejidos en la luz del vaso antes de la sección para análisis molecular o histopatológico.
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Artículo de método
In vitro Infusión de gel intraluminal: un enfoque avanzado para el análisis microscópico de arterias de resistencia humana
En este artículo
Resumen
Resumen
Las arterias de resistencia, que incluyen arterias pequeñas y arteriolas, juegan un papel esencial en la regulación de la presión arterial y la perfusión tisular. La disfunción en estas arterias puede provocar diversas afecciones cardiovasculares como hipertensión, aterosclerosis e insuficiencia cardíaca, así como afecciones neurovasculares. El examen de las arterias de resistencia humana es crucial para comprender los mecanismos de las enfermedades cardiovasculares y desarrollar estrategias terapéuticas específicas. Este estudio presenta un método innovador para preparar arterias de resistencia humana aisladas mediante la infusión de un gel estabilizador de tejidos en la luz, preservando su arquitectura nativa e integridad celular. Se obtuvieron tejidos omentales humanos de pacientes sometidos a cirugías abdominales y se aislaron pequeñas arterias de resistencia (100-300 μm de diámetro) mediante una microdisección cuidadosa. Luego, las arterias se canularon, se presurizaron en una cámara de miógrafo de cultivo y se fijaron con formalina tamponada neutra al 10%. Se infundió un gel estabilizador de tejidos en la luz de la arteria canulada, que se dejó solidificar para preservar la estructura tridimensional. Se realizaron análisis histológicos, inmunohistoquímicos y de expresión génica para evaluar la preservación de las arterias. Las secciones histológicas revelaron la integridad estructural bien conservada y la arquitectura natural de las arterias, manteniendo las capas endoteliales y de músculo liso bien definidas. La tinción inmunohistoquímica mostró una localización distinta de marcadores como CD31 y actina de músculo liso α. La hibridación in situ reveló patrones específicos de expresión génica, proporcionando información sobre los mecanismos moleculares. Este método avanzado de infusión de gel intraluminal ofrece ventajas significativas, ya que permite obtener imágenes avanzadas y un análisis exhaustivo de la estructura arterial, la remodelación y las interacciones celulares tanto en estados sanos como enfermos. Este método tiene el potencial de mejorar el diagnóstico clínico y las estrategias terapéuticas para las enfermedades vasculares, proporcionando así una herramienta valiosa para avanzar en la investigación de la biología vascular.
Introducción
Las arterias de resistencia regulan el flujo sanguíneo y la presión y experimentan cambios significativos en afecciones como hipertensión, diabetes y aterosclerosis 1,2,3,4,5. El examen de las arterias de resistencia humana es esencial para comprender las patologías cardiovasculares y desarrollar terapias dirigidas 6,7,8,9,10. Los métodos tradicionales para investigar los vasos sanguíneos a menudo han llevado a artefactos y pérdida de integridad tridimensional 10,11,12,13,14,15. Para abordar estas limitaciones, presentamos un método innovador para preparar arterias de resistencia humana aisladas mediante la infusión de un gel en la luz, preservando así su estructura aproximada ex vivo y / o in vivo.
Esta técnica de infusión de gel intraluminal mantiene la arquitectura natural de las arterias, lo que permite una representación más precisa de su estado fisiológico. Al estabilizar la estructura de los vasos, este método facilita el examen detallado de la remodelación arterial, la estructura celular, los microdominios, las uniones heterocelulares y la expresión de genes / proteínas en diferentes capas celulares. Esta técnica es particularmente ventajosa para estudiar componentes específicos del tipo de célula tanto en estados sanos como enfermos.
Esta técnica se ha aplicado con éxito en nuestro reciente estudio16, demostrando su eficacia en la preservación de la integridad estructural y molecular de las arterias de resistencia humana, facilitando la obtención de imágenes avanzadas y el análisis integral. El éxito de esta aplicación nos inspiró a documentar este protocolo detallado para que otros lo usen.
En este artículo sobre el método, describimos el protocolo para preparar arterias de resistencia humana aisladas e infundirlas con un gel estabilizador de tejidos biocompatible (Tissue Guard Gel). Aquí, describimos el método experimental e ilustramos sus aplicaciones para la evaluación de la estructura arterial y la investigación de patrones de expresión génica y proteica en diferentes capas celulares. Al proporcionar una técnica integral y reproducible para la preparación de arterias de resistencia humana, nuestro objetivo es avanzar en la investigación de la biología cardiovascular, mejorar la reproducibilidad de los resultados y contribuir a nuevos enfoques diagnósticos y terapéuticos para las enfermedades cardiovasculares.
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Protocolo
Antes de realizar los siguientes experimentos, asegúrese de que el uso de tejidos humanos y los siguientes procedimientos estén aprobados por la Junta de Revisión Institucional (IRB). La recolección de tejido omental de pacientes sometidos a operaciones abdominales clínicamente indicadas en el Centro Clínico de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) se realizó con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional (NCT01915225) de los NIH. Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito.
1. Materiales y equipos
- Consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre todos los reactivos y materiales necesarios para este protocolo. Para obtener detalles adicionales, se pueden consultar los manuales y sitios web asociados con los respectivos proveedores según sea necesario.
2. Recolección de tejidos omentales humanos
- Recolectar tejidos omentales humanos del equipo quirúrgico.
- Coloque inmediatamente los tejidos en un recipiente de muestras preenfriado que contenga tampón frío Krebs Henseleit (KH) (composición: 118 mM de NaCl, 4,7 mM de KCl, 1,2 mM de MgSO4, 1,2 mM de KH2PO4, 25 mM de NaHCO3, 10 mM de HEPES, 2,0 mM de CaCl2 y 11,1 mM de glucosa) en hielo.
- Asegúrese de que los pañuelos estén completamente sumergidos en el tampón y luego cierre bien la tapa.
- Transporte los tejidos en el recipiente cerrado con hielo al laboratorio dentro de los 30 minutos posteriores a la recolección para garantizar la viabilidad del tejido.
NOTA: Asegúrese de ajustar el pH a 7,4 con NaOH durante la preparación del tampón.
3. Microdisección de pequeñas arterias de resistencia humana
- Al llegar al laboratorio, enjuague los tejidos omentales con tampón KH frío para eliminar el exceso de sangre.
- Seleccione una pieza de la región más vascularizada del tejido para la disección en tampón frío en una placa de Petri con hielo.
- Bajo un microscopio de disección, identifique las arterias de resistencia pequeñas (100-300 μm de diámetro) según su ubicación y patrón de ramificación.
- Aísle cuidadosamente las arterias identificadas de los tejidos adiposos y conectivos circundantes. Con pinzas finas y microtijeras, corte y retire los tejidos circundantes sin dañar la arteria.
- Mantenga las arterias aisladas en un tampón frío durante todo el procedimiento de disección para mantener la viabilidad y evitar cualquier degradación enzimática.
NOTA: Antes de la disección, asegúrese de que el área de disección esté limpia. Verifique que la escala del objetivo del microscopio y/o el software de la cámara estén calibrados correctamente para medir con precisión el diámetro con diferentes aumentos. Por lo general, las venas son claramente visibles y las arterias están ubicadas justo al lado o alrededor de las venas. Las paredes de las arterias son más gruesas que las de las venas. Cuando se aíslan del tejido circundante, las arterias mantienen su estructura como tubos de vasos intactos. Por el contrario, las venas tienen paredes más delgadas, a menudo parecen más brillantes debido a la sangre en su luz y tienden a ser más frágiles una vez separadas del tejido.
4. Preparación de la cámara de miograma de cultivo
- Preparar una cámara de miograma de cultivo con dos cánulas de vidrio para la canulación y presurización de las arterias disecadas.
- Prepare una jeringa de 5 ml con un tubo capilar limpio y llénela con tampón KH nuevo. Conecte el tubo a un extremo de la cánula y llénelo con el KH, sin dejar burbujas de aire.
- Llene la cámara con tampón frío y colóquela sobre hielo para mantener una temperatura baja.
NOTA: Se puede utilizar un plato pequeño hecho a medida con dos cánulas, diseñado para imitar la cámara del miógrafo.
5. Canulación y presurización de arterias
- Transfiera con cuidado la arteria disecada a la cámara del miógrafo con fórceps finos o una pipeta de transferencia con un diámetro mayor que el de la arteria.
- Prepare cuatro nudos abiertos con la sutura de nailon (sutura 11/0, 7 capas) y coloque dos de ellos en cada cánula antes de canular la arteria.
- Canular el extremo proximal de la arteria deslizándolo sobre una cánula de vidrio con unas pinzas finas y asegurarlo con las dos suturas de nylon.
- Use el tampón KH en la jeringa para enjuagar suavemente la arteria canulada y eliminar cualquier resto de sangre.
- Canular el extremo distal de la arteria y asegurarlo de manera similar.
- Coloque la cámara en la unidad de miógrafo que está conectada al controlador de presión y temperatura.
- Ajuste la temperatura a 37 °C.
- Ajuste la presión intraluminal inicial a 10 mmHg.
- Aumente la presión intraluminal en incrementos de 10 mmHg cada 10 min hasta alcanzar los 60 mmHg. Asegúrese de que la presión se mantenga de manera constante utilizando el regulador de presión conectado al sistema de miógrafo de cultivo.
- Use el microposicionador para enderezar longitudinalmente la arteria presurizada según sea necesario para llevar la longitud aproximadamente a su nivel fisiológico.
- Ejecute MyoVIEW u otro software adecuado en el monitor de la computadora para rastrear los diámetros arteriales internos y externos con calibradores digitales.
- Deje que la arteria se equilibre durante 45 minutos para lograr un diámetro estable, asegurando que mantenga sus dimensiones fisiológicas y su tono.
- Pruebe la viabilidad de la arteria mediante el uso de un vasoconstrictor (p. ej., 60 mM de KCl o fenilefrina) o vasodilatador (p. ej., acetilcolina) y registre los cambios en el diámetro arterial.
NOTA: Aplicar una presión excesiva con una jeringa puede dañar la arteria, por lo que es importante tener cuidado al enjuagarla. Use una cantidad mínima de tampón y proceda suavemente. Alternativamente, la sangre arterial se puede eliminar usando el tampón de perfusión mientras se presuriza la arteria. Las arterias se pueden presurizar a 80 mmHg y el tiempo de equilibrio puede ser de hasta 1 h.
6. Fijación de arterias
- Después del equilibrio, fije las arterias luminal y abluminalmente durante la noche con formalina tamponada neutra al 10%. Mantenga una presión constante de 60 mmHg para garantizar que el proceso de fijación preserve la integridad estructural de la pared arterial y los componentes celulares.
- Después de la fijación, enjuague las arterias luminal y abluminalmente con PBS para eliminar cualquier fijador residual de la arteria y la cámara.
NOTA: Dependiendo del objetivo del estudio y de la región de interés para el análisis, el vaso montado puede fijarse en presencia de agentes farmacológicos como un vasodilatador o un vasoconstrictor. En esta etapa, la arteria se puede almacenar en PBS a 4 ° C hasta por 48 h. También se puede usar paraformaldehído al 4% para reparar las arterias.
7. Preparación de gel estabilizador de tejidos
- Licuar el gel estabilizador de tejidos en su tubo calentándolo a 60 ± 5 °C antes de su uso.
- Coloque el tubo a temperatura ambiente (RT) durante 3-5 min para que el gel líquido baje la temperatura, y luego colóquelo en un bloque calefactor a 40 °C para mantener el gel líquido durante 10-15 min.
- Use una jeringa estéril de 3 ml conectada a un tubo capilar de 10 a 15 pulgadas de largo para extraer el gel líquido. Continúe inmediatamente con los pasos de infusión a continuación.
NOTA: El gel se puede licuar utilizando diferentes métodos. Es fundamental seguir las instrucciones del fabricante.
8. Infusión e inclusión de gel intraluminal
- Mantener las arterias fijas canuladas en la cámara con PBS a 37 °C.
- Conecte el extremo distal del tubo capilar lleno de gel líquido a la cánula proximal.
- Para evitar que las burbujas de aire atraviesen la luz mientras infunde el gel, retire el extremo proximal de la arteria de la primera cánula para dejar salir las burbujas de aire y permitir que el gel llene la cánula.
- Vuelva a colocar la arteria en la cánula e infunda suavemente el gel en la luz de la arteria hasta que salga de la cánula distal.
- Reemplace inmediatamente el PBS en la cámara con un volumen igual de gel líquido para llenar la cámara hasta el nivel superior.
- Deje que la cámara con las arterias descanse a temperatura RT desconectando la unidad del controlador de temperatura durante unos 10 minutos para permitir que el gel se solidifique dentro del lumen y fuera del lumen de la cámara. Esto asegura que la arteria esté completamente incrustada en el gel, preservando su estructura tridimensional.
- Con unas pinzas finas, afloje las suturas de nailon y saque suavemente las cánulas de la cámara.
- Transfiera todo el gel solidificado que contiene la arteria de la cámara a un recipiente lleno de etanol al 70%. El etanol sirve como solución de retención para preservar la muestra hasta su posterior procesamiento.
NOTA: Una válvula de tres vías puede facilitar la eliminación de las burbujas de aire antes de infundir el gel. La solidificación del gel se puede confirmar tocando suavemente el gel en la cámara con una punta de pipeta limpia.
9. Histopatología
- Corte la arteria transversalmente mientras aún está en el gel y coloque estas muestras en la máquina de procesamiento de tejidos para su procesamiento de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Posteriormente, incruste el tejido para hacer un bloque de parafina. Asegúrese de que las muestras estén incrustadas "en el extremo" para que las secciones transversales estén hacia abajo en el bloque.
- Corte secciones axiales con un espesor de 5 μm con un micrótomo. Transfiera las secciones cortadas a portaobjetos adhesivos.
- Hornear las secciones a 60 °C durante 1 h, luego desparafinar con xileno, seguido de rehidratar con lavados con alcohol graduados.
- Tiña las secciones con hematoxilina y eosina (HE) para histopatología de rutina y diferencie en alcohol ácido al 1%. Examine las secciones bajo microscopía óptica con un microscopio adecuado y adquiera fotografías con una cámara compatible.
10. Inmunohistoquímica
- Logre la tinción utilizando un sistema automatizado con el sistema de detección de refinamiento de polímeros de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Desparafinar las secciones de tejido a 72 °C durante 30 s con una solución desparafinadora, luego rehidratar las secciones con lavados con alcohol graduado y solución de lavado.
- Realice la recuperación de epítopos inducida por calor calentando las secciones a 100 °C durante 20 min en la solución de recuperación de epítopos 1 y aplique un bloque de peróxido durante 5 min para apagar la actividad de la peroxidasa endógena.
- Aplique anticuerpos primarios (p. ej., anti-CD31 o anti-actina del músculo liso) a concentraciones apropiadas diluidas en diluyente de anticuerpos reductores de fondo. Incube las secciones con un polímero de peroxidasa de rábano picante durante 8 min y coloree las secciones con una solución de cromógeno durante 10 min. Contratiña los portaobjetos con hematoxilina durante 5 min.
11. Hibridación cromogénica in situ de RNAScope
- Realice la tinción utilizando un sistema automatizado con un kit adecuado y el kit de detección de polímero refinar rojo de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Hornee las secciones durante 30 min a 60 °C, luego desparafine las secciones durante 30 s en una solución de desparafinado calentada a 72 °C.
- Rehidratar los tejidos con lavados absolutos con etanol y solución de lavado.
- Tratar las secciones con la solución de recuperación de epítopos 2 durante 15 min a 95 °C e incubar las secciones con una solución enzimática durante 15 min a 40 °C.
- Hibridar las muestras con las sondas RNAScope apropiadas para los genes diana.
- Utilice una sonda génica de mantenimiento que exprese un medio (p. ej., peptidilprolil isomerasa B) para confirmar la abundancia e integridad adecuadas del ARN.
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Resultados
Se obtuvieron tejidos omentales humanos de pacientes sometidos a cirugías abdominales clínicamente indicadas. Se aislaron meticulosamente pequeñas arterias de resistencia (100-300 μm de diámetro) de los tejidos adiposos y conectivos circundantes bajo un microscopio de disección (Figura 1A-C). Las arterias aisladas se limpiaron, se canularon con éxito y se montaron en las cánulas de vidrio en la cámara del miógrafo de cultivo para su presurización (
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Discusión
Los avances en imágenes médicas, técnicas quirúrgicas y metodologías de investigación han mejorado nuestra comprensión de la arquitectura vascular 3D, revolucionando el diagnóstico, la planificación quirúrgica y la investigación 17,18,19,20. A pesar de estas innovaciones, preservar la estructura 3D de las arterias de resistencia humana aisladas sigue siendo un ...
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Divulgaciones
Se utilizó NIAID GenAI para generar un esquema inicial y un borrador del manuscrito, que fue escrito, revisado y editado minuciosamente por los autores humanos para garantizar la precisión y la coherencia.
Agradecimientos
Esta investigación fue financiada por la División de Investigación Intramuros del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas, número de proyecto AI001150 a HCA. Agradecemos a nuestro antiguo miembro del laboratorio, el Dr. Steven Brooks, así como a nuestros actuales miembros del laboratorio, Mohamed Ibrahim, Mary Jackson y Jian Wu de la Sección de Genómica Funcional de la Malaria, por su ayuda en la captura de imágenes durante el proceso.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Alcohol ácido con concentración al 1% | StatLab | SL89-1 | |
| 10% NBS | Leica Biosystems | 3800598 | |
| Cámara HDMI de microscopía 4K | Hitech Instruments, Inc. | HT-XP4K8MA | |
| Diluyente de anticuerpos - Reducción de antecedentes | Dako | S3022 | |
| Procesador Automatizado de Tejidos | Leica Biosystems | HistoCore PEGASUS/Cat# 14048858005 | |
| Solución de Dewax de Bond | Leica Biosystems | AR9222 | |
| Solución de recuperación de epítopos de enlace 1 | Leica Biosystems | AR9961 | |
| Solución de Recuperación de Epítopos de Enlace 2 | Leica Biosystems | AR9640 | |
| Detección de refinación de polímeros de enlace | Leica Biosystems | DS9800 | |
| Detección de Rojo Refinado de Polímeros de Enlace | Leica Biosystems | DS9390 | |
| Solución de lavado de unión (10 veces) | Leica Biosystems | AR9590 | |
| Paquete de cánula (cristal), 80 y guion; 100 & mu; m | DMT | Código de producto: 300407 | |
| CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Platos de disección, grandes (vidrio pyrex), 93 mm | Instrumentación de Sistemas Vivos | SKU: DD-90 | |
| Platos de disección, pequeños | Instrumentación de Sistemas Vivos | SKU: DD-50 | |
| Microscopio de disección | Hitech Instruments, Inc. | ZEISS SteREO Discovery.V8 | |
| Pinzas Dumont #5 | Herramientas Científicas Fines | Artículo nº 11295-10 | |
| Dumont #5SF Pinzas | Herramientas Científicas Fines | Artículo nº 11252-00 | |
| EcoMount | BioCare Medical | EM897L | |
| Eosina | IHC Mundo | IW-3100B | |
| Hematoxilina | BioCare Medical | Cathe-MM | |
| Cámara de Iamging | Olyumpus | DP28 | |
| Microscopio de imagen | Olyumpus | BX51 | |
| Tampón Krebs Henseleit (con 2 mM de cloruro de calcio) | Boston BioProducts, Inc. | SKU: C-10625N-200mL | |
| Amortiguador de Krebs-Henseleit (sin calcio) | Boston BioProducts, Inc. | SKU: C-9906W-200mL | |
| Medios de montaje | ThermoFisher Scientific | 4111 | |
| Cámara y unidad de miógrafo | DMT | 202/204CM | |
| PBS (solución salina tamponada con fosfato) | Thermofisher Scientific | 10010023 | |
| PPIB | ACDBio | 313908 | |
| Kit de reactivos RNAscope 2.5 LS-RED | ACDBio | 322150 | |
| Stainer | Leica | Sistema automatizado Leica Bond RX | |
| Pasadores de disección de acero inoxidable | Instrumentación de Sistemas Vivos | SKU: PIN-0,1MM | PIN-0,2MM | PIN-#3 | PIN-VP-1 | |
| Paraplasto Surgipath | Leica Biosystems | 39601006 | |
| Gel de protección tisular | StatLab | TissueGuard/SKU: TG12 | |
| Tijeras de muelle Vannas - Filo de corte de 2 mm | Herramientas Científicas Fines | Artículo nº 15000-03 | |
| Tijeras de muelle Vannas - Filo de corte de 2,5 mm | Herramientas Científicas Fines | Artículo nº 15000-08 | |
| Tijeras de muelle Vannas - Filo de corte de 3 mm | Herramientas Científicas Fines | Artículo nº 15000-00 | |
| α-SMA | Abcam | AB5694 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
