Venopunción de venas faciales para extracción de sangre murina

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para una técnica de extracción de sangre optimizada en sujetos murinos a través de la venopunción de la vena facial utilizando una lanceta. Utilizamos esta técnica junto con la evaluación de citometría de flujo para caracterizar fenotipos celulares de cepas transgénicas, congénitas e indicadoras. También es adecuado para el análisis de citoquinas séricas y estudios de diabetes.

Resumen

Este artículo presenta un protocolo optimizado para la extracción de sangre murina a través de la venopunción de la vena facial utilizando una lanceta, ofreciendo una alternativa rápida, mínimamente invasiva y rentable a otras técnicas comunes como la vena de la cola y el muestreo retroorbitario. Esta técnica es particularmente ventajosa para estudios que requieren muestreo repetido, como fenotipado de ratones, análisis de citocinas séricas e investigación de diabetes. El protocolo es eficiente, requiere un equipo especializado mínimo y es adecuado para el análisis celular de alto rendimiento en ratones. Nuestra aplicación principal es el fenotipado de ratones transgénicos, congénitos e informadores mediante citometría de flujo, demostrado aquí con tinción de anticuerpos y ratones reporteros tdTomato. El documento describe el procedimiento completo, desde la preparación de animales hasta el análisis de muestras. Los pasos clave incluyen la recolección de sangre con una lanceta de 3 mm, lisis celular, tinción y perfil citométrico de flujo. La venopunción de venas faciales mejora la eficiencia de la recolección al tiempo que respalda las prácticas éticas de investigación. Este método práctico y adaptable es adecuado para una amplia gama de protocolos experimentales que involucran muestras de sangre murina y análisis celulares.

Introducción

La recolección de sangre eficiente, reproducible y mínimamente invasiva es esencial para muchos estudios murinos, particularmente aquellos que requieren muestreos repetidos. Este protocolo proporciona un método simplificado para recolectar pequeños volúmenes de sangre mediante venopunción de venas faciales, seguida de lisis de glóbulos rojos, tinción de anticuerpos y análisis de citometría de flujo. Este flujo de trabajo es adecuado para aplicaciones de alto rendimiento al tiempo que minimiza las complejidades técnicas.

Muchos métodos de extracción de sangre, como el sangrado retroorbitario o la incisión de la vena de la cola, pueden requerir procedimientos que involucran calor, anestesia¹ y tiempos de manejo prolongados, lo que puede causar una angustia significativa al animal². Por el contrario, la venopunción de la vena facial con una lanceta ofrece una alternativa simple y rápida que respalda el diseño experimental ético y reproducible. Este método ha sido validado en estudios previos como una alternativa humana para el muestreo de sangre de pequeño volumen en ratones³.

Ilustramos este método fenotipando células inmunitarias de ratones transgénicos e informadores, incluidos los ratones reporteros TdTomato y los ratones MD4-IgHEL. Este último requiere tinción con anticuerpos contra CD19 e IgMa, un alotipo de IgM.

Si bien este protocolo está desarrollado para el perfil celular sanguíneo, se puede adaptar fácilmente para otros usos, incluido el análisis de citoquinas séricas, la detección de anticuerpos específicos o las mediciones de glucosa, omitiendo el paso de lisis de glóbulos rojos. En general, esta técnica mejora la calidad de los datos y la eficiencia experimental al tiempo que causa una angustia mínima a los animales, lo que la hace ampliamente útil en diversas aplicaciones de investigación.

Protocolo

Los ratones se alojaron en un entorno específico libre de patógenos en Dartmouth Hitchcock Medical College, una institución acreditada por AAALAC, y se utilizaron de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Utilización de Animales.

1. Recolección de materiales

1. Prepare tubos de cultivo de 5 ml, cada uno de los cuales contiene 1,5 ml de 1 tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC) (10 veces lisis de glóbulos rojos diluida con agua estéril). Use un tubo por ratón.
2. Reúna una caja de lancetas de 3 mm (una lanceta por ratón).
3. Reúna una caja de esponjas de gasa (una esponja de gasa por ratón).
4. Reúna pipetas de transferencia y un tubo cónico de 50 ml que contenga 1x HBSS con 0,5 mM de EDTA (suficiente para hasta 20 ratones).
   NOTA: Este tampón se utiliza para detener la reacción de lisis. Si el tampón solo se necesita para el fenotipado y no para un análisis posterior posterior, la mayoría de los tampones neutros con pH 7,2-7,4 se pueden usar en lugar de HBSS.
5. Lleve un cubo de hielo, 1x tampón de lisis de glóbulos rojos adicional, tubos adicionales de 5 ml y pipetas de transferencia.

2. Etiquetado de mouse y tubo

1. Etiquete cada tarjeta de jaula y ratón con un identificador de fenotipo que corresponda a las etiquetas en cada tubo para ayudar a distinguir qué resultados se correlacionan con qué ratón. Los identificadores comúnmente utilizados incluyen diferentes colores de marcadores permanentes (por ejemplo, rojo, azul, verde, negro) en las colas de los ratones, que corresponden a las marcas en el tubo.
   NOTA: Incluya siempre un ratón de control para el fenotipado. Para los ratones reporteros, asegúrese de tener un control de reportero negativo. Para ratones transgénicos, incluya un ratón de tipo salvaje como control.
2. Coloque los tubos etiquetados en una rejilla con un cubo de hielo cerca para almacenar los tubos inmediatamente después de la extracción de sangre.
3. Abra todas las lancetas necesarias para el procedimiento.
4. Abra todas las esponjas de gasa necesarias para el procedimiento.

3. Manejo del ratón y recogida de muestras

1. Use la mano dominante para agarrar el mouse por la cola y colóquelo en una rejilla de alimentación de alambre o en cualquier superficie plana.
2. Use el dedo índice y el pulgar no dominantes para agarrar el mouse maniobrando desde la cola hacia la región cervical.
3. Use los dedos restantes para asegurar la cola, minimizando el movimiento del mouse.
4. Use la mano dominante para recuperar una lanceta abierta de 3 mm.
5. Ubique la pequeña mancha sin pelo justo más allá de la boca y trace una línea recta hacia la oreja. Deténgase donde la línea se cruza con la esquina exterior del ojo (Figura 1).
6. Inserte la lanceta en esta intersección para asegurar un amplio suministro de sangre.
7. Use el borde lateral plano de la lanceta para recolectar una sola gota de sangre.
8. Deposite toda la lanceta, con la muestra de sangre, en el tubo marcado que contiene tampón de lisis de glóbulos rojos.
9. Agite suavemente el tubo para asegurarse de que toda la muestra se mezcle con el tampón. La mezcla incompleta puede causar coagulación y mala calidad de los datos.
10. Use una esponja de gasa para aplicar una presión suave en el sitio de punción durante 5-10 s.
11. Regrese el ratón a su jaula.
12. Mantenga una relación tampón sangre-lisis superior a 1:10.
13. Repita los pasos de esta sección para cada mouse adicional.

4. Lisis, preparación y análisis de la muestra

1. Espere de 7 a 10 minutos después del inicio de la lisis, agregue aproximadamente 2 ml de 1x HBSS con 0,5 mM de EDTA (u otro medio).
2. Centrifugar tubos a 400 g durante 5 min. Prepare cócteles de anticuerpos durante este tiempo.
3. Deseche el sobrenadante.
4. Retire las lancetas de los tubos con fórceps.
5. Agregue 30 μL de un cóctel de anticuerpos diseñado para identificar las poblaciones celulares deseadas.
   NOTA: Para fenotipar ratones MD4 IgHEL, nuestro cóctel consistió en 1 ml de HBSS, 25 μl de IgMa PerCP cy-5.5 y 25 μl de CD19 APC.
6. Resuspender las células en vórtice durante 2-3 s e incubar durante 25-30 min a 4 °C.
7. Encienda el citómetro de flujo y configure los gráficos de flujo según las necesidades del experimento.
   NOTA: No es necesario centrifugar las células después de la tinción si el objetivo es el fenotipado.
8. Agregue 150-25 μL de HBSS u otros medios a cada muestra usando una pipeta de transferencia. Si es necesario, se puede agregar DAPI a una concentración final de 1. μg/mL (use 10 μL de medios que contengan DAPI).
9. Agite cada muestra durante 2-3 s justo antes de la adquisición.
10. Adquirir datos de 8.000 a 10.000 eventos/s, con el objetivo de obtener 100.000 células si la lisis fuera efectiva.
11. Analice los datos adquiridos, ilustrados en la Figura 2 y la Figura 3.

Resultados

Usando citometría de flujo, la Figura 2 muestra sangre lisada de ratones reporteros de tipo salvaje (WT) y PF4-Cre TdTomato, preparados utilizando el protocolo descrito anteriormente. El primer conjunto de diagramas de flujo muestra la dispersión lateral (SSC), que refleja la granularidad de la celda, frente a la dispersión directa (FSC), que indica el tamaño de la celda. Los restos celulares y las plaquetas se observan cerca...

Discusión

Este protocolo optimizado de recolección de sangre de venas faciales proporciona una alternativa eficiente y simple a otros métodos comúnmente utilizados, como la vena de la cola o el sangrado retroorbitario. Si bien el protocolo es simple y directo, se deben seguir cuidadosamente algunos pasos críticos. El paso más importante para ejecutar correctamente es la colocación correcta del sitio de punción⁴. Apuntar a la ubicación adecuada en la mejilla asegura un flujo...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anticuerpo anti-ratón APC CD19	Bioleyenda	152410	CD19 APC
Centrífuga 5810 R, sin rotor, 120 V, 50/60 Hz	Eppendorf	22625501	Centrifugadora
Esponjas de gasa Dermacea de 8 capas de 2" x 2"	Covidien	441211	Guaze Ponges
Pipetas desechables de transferencia graduada	Fisherbrand	13-711-91am	Pipeta de transferencia
ErgoOne Single Channel Pipette (200 & micro; L)	USA Scientific	7100-2200	Pipeta
Ácido etilendediaminético tetraacético (solución 0,5 M/pH 8,0)	Fisherbrand	BP2482-100	EDTA 5 M
Analizador de celdas FACSymphony A3	BD Biociencias	660937	Citómetro de flujo
Fisherbrand  Mezclador de vórtices analógico	Fisherbrand	02-215-414	Vórtice
Goldenrod Animal Lancet 3 mm Estériles 5 bandejas de 200	Vara de oro	GR 3MM	Lancet 3 mm
Pinzas Graefe	Herramientas Científicas Fines	11051-10	Pinzas
Hank' s Solución salina equilibrada, 1X sin calcio ni magnesio	Corning	21-021-CVR	HBSS
PerCP/Cyanine5.5 anti-ratón IgMa  Anticuerpo	Bioleyenda	408612	IgMa PerCP cy-5.5
Búfer de lisis de glóbulos rojos (10x)	Bioleyenda	420301	Búfer de lisis de los glóbulos rojos
Tubos de ensayo de poliestireno de fondo redondo sin tapa	Fisherbrand	FB1496110	Tubos de cultivo
Rotuladores permanentes con rotulador rotulador, punta de cincel	Sharpie	38254PP	Rotuladores permanentes y nobsp;
Analizado para agua estéril USP y nbsp;	Corning	25-055-CI	Agua de calidad para cultivo celular
Recargas de puntas de pipeta TipOne (200 y micro; L Biselado natural)	USA Scientific	1111-1730	Puntas de pipeta