Optimización rápida de un sistema inducible por luz para controlar la expresión génica de mamíferos

Las herramientas de biología sintética, como los sistemas de expresión génica inducible, han proporcionado contribuciones significativas a la investigación biológica. Su capacidad para regular la expresión génica de manera ajustable, reversible y precisa puede mejorar el control de la producción de proteínas 1,2,3,4,5,6, la morfología celular 7,8,9,10,11,12, las vías metabólicas 13,14,15^,16,17,18, y otros objetivos para aplicaciones terapéuticas y de biofabricación. Los sistemas inducibles por productos químicos pueden tener efectos residuales^19,20 o fuera del objetivo. Los aditivos químicos también pueden ser muy caros y difíciles de escalar industrialmente debido a los procesos de purificación posteriores adicionales 21,22,23. Los sistemas de expresión génica inducibles por la luz pueden ofrecer un método escalable y preciso para las prácticas de biofabricación 24,25,26,27.

Muchos sistemas de expresión génica inducibles por la luz se han desarrollado como herramientas útiles de biología sintética en una variedad de aplicaciones 28,29,30,31,32,33,34,35,36 y longitudes de onda de azul 35,37,38, rojo / rojo lejano ^12,39,⁴⁰, o luz verde⁴¹. En el caso de la regulación génica optogenética basada en CRISPR, la modificación de la cantidad de ARN guía individuales (ARNg) administrados puede afectar la expresión de ARNm de genes endógenos⁴², y deberá optimizarse para diferentes líneas celulares. También se pueden utilizar proteínas de transactivación como VP64 37,42,43,44, VP16 39,40,44,45,46, p65⁴⁴, o fusiones de ellas 47, aumentando la modularidad de los sistemas optogenéticos. Con el fin de investigar vías biológicas complejas y entrelazadas 12,40,48,49,50,51,52,53, se pueden probar diferentes combinaciones de estos componentes conocidos. Además, diferentes líneas celulares pueden mostrar diferencias en la inducción con el mismo sistema⁵². Los diferentes niveles de inducción pueden conducir a una expresión génica insuficiente o sensibilidad en el control preciso de la expresión génica, lo que requiere pruebas rigurosas para encontrar un sistema optogenético óptimo en líneas celulares novedosas o biológicamente más relevantes. Con un ritmo creciente y una aplicabilidad cada vez mayor de la regulación de genes optogenéticos, es imperativo caracterizar rápidamente estos diferentes sistemas.

Los métodos actuales para caracterizar las herramientas optogenéticas utilizan la expresión estable o transitoria de genes^12,54. Generar líneas celulares que se expresan de manera estable y optimizar la dinámica del sistema para obtener la máxima expresión puede llevar mucho tiempo y, por lo tanto, ser costoso. La expresión transitoria permite obtener información rápida y valiosa, especialmente cuando se prueban sistemas optogenéticos multicomponente. Aquí, utilizamos el sistema efector CRISPR-dCas9 (LACE)³⁷ activado por luz azul, compuesto por criptocromo 2 (CRY2) y terminal N de hélice básica (CIBN) que interactúa con criptocromo. Se ha utilizado para controlar la expresión génica en células de mamíferos como HEK293T (células renales embrionarias humanas)^37,38, CHO-DG44 (células de ovario de hámster chino)⁵⁵ y C2C12 (células de mioblastos de ratón)³⁸. Su naturaleza modular es ideal para caracterizar rápidamente el rendimiento del sistema a través de métodos de expresión transitoria y alto rendimiento. Por ejemplo, los sistemas multicomponentes como LACE pueden necesitar la optimización de las relaciones de masa para mejorar la inducción, un paso que no se emplea normalmente en la caracterización del sistema optogenético.

Este protocolo detalla la rápida optimización y caracterización de dos plásmidos del sistema LACE (2pLACE)³⁸. En esta configuración, 2pLACE controla la expresión de un reportero fluorescente, eGFP (proteína fluorescente verde mejorada), en células HEK293T. La activación se realiza en placas de 96 pocillos con fondo de vidrio negro utilizando un OptoPlate-96, una matriz de LED impresa en 3D diseñada y construida por Lukasz Bugaj y sus colegas 56,57,58,59. Este protocolo optimiza específicamente la expresión máxima con diferentes proporciones de masa del sistema de dos plásmidos. También incluye un código fácil de usar para controlar diferentes intensidades de luz para investigar la capacidad de sintonización del sistema y su rango dinámico completo. La citometría de flujo se utiliza para la recopilación y el análisis de datos. Los protocolos para generar construcciones de plásmidos y materiales de impresión 3D para la matriz de LED se pueden encontrar en publicaciones anteriores^54,56. Estos métodos destacan una línea rápida y de alto rendimiento para caracterizar sistemas de expresión génica inducibles por luz.

1. Recubrimiento de celdas HEK293T en un formato de 96 pocillos

1. En un gabinete de bioseguridad, recoja un contenedor de desechos de lejía, pipetas serológicas, pipeta-aid, solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS), medio de águila modificado con Dulbecco (DMEM) con 10% de suero fetal bovino (FBS) y un matraz de cultivo celular T-75 con células HEK293T confluentes. Precalentar el medio a 37 °C.
2. En un matraz T-75, verifique que la confluencia sea aproximadamente 80%-100% confluente a través de un microscopio invertido.
3. En la cabina de bioseguridad, utilice una pipeta serológica para aspirar el medio gastado del matraz de cultivo celular. Evite tocar la superficie o el plástico del matraz. Deseche el medio gastado y el aspirador en el contenedor de residuos.
4. Lave suavemente las células con aproximadamente 10 ml de DPBS aspirándolo en una esquina del matraz y girándolo suavemente alrededor de la superficie. Aspirar el DPBS del matraz y desechar el lavado y el aspirador en el contenedor de residuos.
5. Añadir 1,5 ml de tripsina-EDTA al 0,05% para cubrir la superficie del matraz e incubar a temperatura ambiente durante 1 min. Golpee suavemente el matraz para aflojar las células de la superficie.
6. Añadir 8,5 ml de DMEM fresco en el matraz. Vuelva a suspender y mezcle las células con una pipeta serológica hasta que todos los agregados se hayan roto aspirando hacia arriba y hacia abajo.
7. Recoja 9 ml de suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml.
   1. Añadir 9 ml de DMEM fresco en el matraz y colocarlo en una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂
8. Con un hemocitómetro, mezcle 10 μL de células suspendidas con 10 μL de colorante azul de tripano en una proporción de 1:1 para calcular la concentración de células. Utilice este valor para preparar suficientes células para sembrar en el plato.
9. Sembrar ~35.000 células en 100 μL por cada pocillo de una placa inferior de vidrio negro de 96 pocillos #1.5 de alto rendimiento y colocar en una incubadora a 37 °C y 5% de CO₂ durante 24 h.

2. Optimización de la transfección 2pLACE

1. Para un pocillo y un exceso del 10%, alícuota 11 μL de DMEM sin suero tibio (SFM) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. Usando un CRY2-eGFP: CIBN-gRNA proporciones de masa de plásmidos iguales a 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7: 3, 8:2 y 9:1, alícuota 110 ng para cada pocillo de ADN total a las alícuotas de SFM (Tabla 1).
3. Como control positivo, alícuotas de la misma masa de plásmido CMV-eGFP a diferentes alícuotas de SFM.
4. Por cada pocillo, alícuota 11 μL de SFM para la dilución del reactivo de transfección.
5. Prepare el reactivo de transfección en una proporción de masa (μg) a volumen (μL) de 1:3 de ADN y reactivo de transfección.
6. Agregue el reactivo de transfección diluido al ADN diluido e incube durante 12 min a temperatura ambiente para crear los complejos de transfección.
7. Agregue ~ 20 μL del complejo de transfección a cada pocillo. Asegúrese de que no toque las paredes del pozo.
8. Envuelva la placa en papel de aluminio y colóquela en una incubadora a 37 °C y 5% de_CO2 durante 24 h.

3. Activación de 2pLACE

1. Modifique el código de entrada del microcontrolador para iluminar los pocillos deseados utilizando estos ajustes (Archivo de codificación suplementario 1, líneas 147 - 158).
   1. Intensidad del LED: 9,27 mW/cm² (Archivo de codificación suplementario 1, líneas 200 - 215).
   2. Longitud del pulso: 1 s (Archivo de codificación suplementario 1, líneas 280 - 290).
   3. Frecuencia de pulso: 0,067 Hz (cada 15 s) (Archivo de codificación suplementario 1, líneas 264 - 278).
      NOTA: La configuración de la longitud de onda está determinada por los tipos de LED instalados.
2. Rocíe la tapa impresa en 3D del OptoPlate con etanol al 70% y déjelo secar en un gabinete de bioseguridad.
3. Encienda una lámpara de luz roja en el cuarto oscuro y coloque la placa de 96 pocillos en un gabinete de bioseguridad, y reemplace la tapa con la tapa seca impresa en 3D.
   NOTA: Opcionalmente, se pueden ver las células CMV-eGFP utilizando microscopía de fluorescencia para estimar la eficiencia de la transfección.
4. Tome la placa de 96 pocillos y colóquela en la matriz de LED para construir el aparato de matriz de LED. Asegúrese de que la placa encaje en su lugar.
5. Conecte el microcontrolador, el LED y los puertos del ventilador a una fuente de alimentación.
6. Rocíe cuidadosamente los cables con etanol al 70% y séquelos.
7. Coloque el aparato de matriz de LED en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO₂ durante 24 h. Asegúrese de que los LED se enciendan según lo previsto y que los cables no estén tensos cuando la incubadora esté sellada.

4. Preparación de citometría de flujo

1. Mientras se encuentra en un entorno de luz roja, saque el OptoPlate y colóquelo en un gabinete de bioseguridad
   NOTA: Opcionalmente, se pueden ver las células mediante microscopía de fluorescencia para confirmar visualmente la inducción de luz.
2. Aspire cuidadosamente todos los medios de cada pocillo.
3. Desconecte las células con 30 μL de tripsina-EDTA al 0,05% e incube durante 1 min a temperatura ambiente.
4. Mezcle cada pocillo con tampón FACS frío de 100 μl (FBS al 1% en PBS) hasta que se convierta en una sola célula.
5. Transfiera cada muestra a una placa de 96 pocillos con fondo en V.
6. Centrifugar la placa de 96 pocillos con fondo en V a 164 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
7. Aspirar 80 μL de sobrenadante sin alterar el sedimento.
8. Agregue 200 μL de tampón FACS frío para resuspender el sedimento.
9. Envuelva la placa de 96 pocillos con fondo en V en papel de aluminio para un aislamiento ligero.
10. Coloque el plato en una caja de espuma de poliestireno con hielo para su transporte.

5. Activación de citometría de flujo y recopilación de datos

1. Encienda el citómetro de flujo con el interruptor de la parte posterior y abra el software de citometría de flujo correspondiente en el ordenador.
2. Ejecute el programa de inicio del sistema y cargue 2 ml de agua desionizada en el cargador de muestras (Figura complementaria 1A).
3. Ejecute el control de calidad (QC) utilizando las perlas de control de calidad proporcionadas (Figura complementaria 1B).
4. Asegúrese de que el citómetro de flujo esté en modo de muestreo de placa (Figura complementaria 1C).
5. Configure y especifique pocillos de muestra (Figura complementaria 1D).
6. Cree los siguientes diagramas de dispersión y tablas (Figura complementaria 2A).
   1. Dispersión lateral (SSC-A) vs dispersión directa (FSC-A).
   2. SSC-H contra SSC-A.
   3. SSC-A frente a FITC-A.
   4. Tabla de estadísticas FITC-A (Figura complementaria 2B).
7. Encaje la placa inferior en V en el cargador de placas del citómetro.
8. Seleccione un pocillo no transfectado y haga clic en Inicializar, y luego haga clic en Ejecutar.Asegúrese de que la frecuencia de muestreo de volumen sea de 10 μL/min (Figura complementaria 2C).
9. Ajuste los voltajes SSC y FITC para centrar la población de interés en el gráfico SSC-A frente a FSC-A (Figura complementaria 2C).
   1. Cree un polígono para controlar la población de células sanas de interés (Figura complementaria 2D).
   2. Cree un polígono para la puerta para la discriminación de dobletes en el gráfico SSC-H vs SSC-A.
   3. Ajuste el voltaje FITC para colocar celdas no transfectadas hacia la izquierda del gráfico SSC-A vs FITC-A (Figura complementaria 2D).
10. Repita para los pocillos restantes sin transfectar y registre los datos FITC-A medios.
11. Seleccione un pozo transfectado CMV-eGFP y haga clic en Ejecutar.
12. Ajuste el voltaje FITC para capturar células autofluorescentes y fluorescentes en el gráfico SSC-A frente a FITC-A.
    1. Cree un polígono para conectar las celdas fluorescentes con las celdas no fluorescentes mientras hace referencia a la puerta inicial en celdas no transfectadas (Figura complementaria 2E).
13. Registre automáticamente las muestras a 60 μL/min hasta que se hayan alcanzado los 200 s y/o los eventos hayan alcanzado los 10.000 (Figura complementaria 2F).
14. Exporte Mean FITC como un archivo CSV y analice los datos.
15. Limpie el citómetro de flujo a través de la opción Limpieza diaria (Figura complementaria 2G).

6. Optimización de la intensidad del LED

1. Edite el script del microcontrolador para probar las intensidades de LED deseadas (Archivo de codificación complementario 1, líneas 200-215).
   NOTA: Las intensidades de LED equivalentes con respecto a los valores en el script del microcontrolador se informan en otra parte³⁸. La autocalibración puede ser necesaria cuando se utilizan diferentes LED.
2. Asegúrese de que el script contenga los siguientes valores en (Archivo de codificación complementario 1, líneas 200-215) como se diseñó en la Tabla 2 y cargue el código en el microcontrolador.
3. Repita los pasos 1-5.

Adoptando elementos de flujo de trabajo de la literatura anterior 37,38,55, agregamos iluminación simultánea de alto rendimiento del OptoPlate-96 y demostramos una tubería para optimizar rápidamente un sistema de expresión génica inducible por luz en células de mamíferos (Figura 1).

Para los sistemas de expresión génica inducible, los rangos dinámicos altos son un marcador de rendimiento crítico, además de la expresión absoluta de encendido y apagado (con fugas). Con las imágenes de fluorescencia de las células transfectadas, se puede observar cualitativamente la diferencia en la expresión de eGFP entre las células activadas por la luz y las células mantenidas en la oscuridad (Figura 2). Una proporción de 1:9 da como resultado visiblemente una menor expresión máxima de eGFP en comparación con una proporción de 5:5. También se puede observar que hay un aumento de la fuga en la proporción 5:5. Las imágenes de fluorescencia de células transfectadas y no transfectadas de eGFP que expresan constitutivamente (CMV-eGFP) son valiosos controles positivos y negativos para contextualizar la eficiencia de la transfección y la expresión inducida y con fugas del sistema, respectivamente. El uso de imágenes de fluorescencia permite a los usuarios ver y validar rápidamente la transfección y activación exitosas de la expresión génica con luz azul, proporcionando un valioso punto de control antes de la citometría de flujo. La citometría de flujo se puede utilizar para cuantificar la intensidad media de fluorescencia (MFI) y el rango dinámico.

Después de activar la luz de las células, se preparan con tampón FACS y se analizan mediante citometría de flujo. HEK293T células miden aproximadamente 11-15 μm, lo que da como resultado una ganancia FSC de 500 y una ganancia SSC de 125 (Figura complementaria 2C) para centrar las poblaciones de células sanas. Los voltajes más altos dan como resultado el análisis de desechos en lugar de poblaciones celulares sanas. Nuestras carreras tienen consistentemente más de ~ 60% de eventos en la primera puerta de población (P1) (Figura 3A-D). Una vez que las poblaciones de células sanas constituyen la mayoría de los eventos en el gráfico SSC-A vs FSC-A, también se puede verificar la densidad de eventos para identificar a la mayoría de la población (Figura complementaria 3A). Luego, la discriminación del doblete se puede realizar a través del gráfico SSC-H vs SSC-A, que es crucial para obtener resultados confiables y reproducibles60,61. En este sistema, generalmente encontramos que más del 95% de los eventos cerrados en P1 eran singlets (Figura 3A-D). En el gráfico SSC-A vs FITC-A, las celdas no transfectadas generalmente estarán hacia la izquierda del centro del gráfico y estarán cerradas para tener una población <0.1% (Figura 3A). Luego, las células positivas para eGFP llenarán la puerta que estaba vacía en la muestra sin transfectar, lo que dará como resultado mediciones de análisis de una sola célula de MFI (Figura 3B). Una vez que se recopilan los controles negativos y positivos para establecer las puertas y voltajes adecuados, las muestras con 2pLACE se pueden analizar utilizando las mismas puertas para excluir de manera confiable las celdas autofluorescentes (Figura 3C, D). Aquí, el porcentaje de población de células positivas para eGFP fue de ~99% para CMV-eGFP y ~57% para células transfectadas con 2pLACE. También se puede usar una puerta final en el canal PE-A para garantizar que se capturen células altamente fluorescentes (Figura complementaria 3B).

Otra proporción que se optó por probar fue 3: 7. Como paso de validación, se tomaron imágenes de microscopía de fluorescencia antes de la citometría de flujo y se observó una transfección exitosa para la inducción de la expresión de eGFP con 2pLACE, esperadamente menor que CMV-eGFP (Figura 4A). Después de recopilar datos de citometría de flujo de 2pLACE, la expresión génica activada por luz azul se puede comparar con la expresión génica con fugas (Figura 4B). Usando la configuración enumerada en el Paso 3.1, pudimos observar un aumento de ~ 3 veces en la expresión después de la activación de la luz azul, coincidiendo con el aumento de la señal de fluorescencia vista cualitativamente por microscopía. Además, las eficiencias de transfección se pueden ver indirectamente midiendo el % de población positiva para eGFP, o porcentaje de padres, en ~ 60% de células individuales sanas (Figura 4C).

La implementación de este protocolo en su totalidad puede identificar relaciones de masa óptimas (Figura 5A) e intensidades de luz (Figura 5B) para un rango dinámico máximo y una expresión sintonizable. Las relaciones de masa inferiores a 6:4 exhibieron un rango dinámico más amplio (3,5-4,5), mientras que las relaciones de masa más allá de 6:4 mostraron un rango dinámico disminuido debido al aumento del fondo y la disminución de la expresión máxima de eGFP. Tanto para la expresión máxima como para el alto rango dinámico, se prefiere una relación de 3:7. Las proporciones por debajo de 3:7 mostraron inducciones de pliegues similares pero tuvieron menos expresión máxima general. Utilizando nuestros valores de intensidad de luz previamente calibrados38 (Tabla 2), se puede caracterizar el nivel de expresión génica con respecto a diferentes intensidades de luz. Las intensidades de luz también controlaron los niveles de expresión de eGFP, donde MFI se satura a ~ 3 mW / cm2. Las intensidades de luz más allá de esto pueden tener valores variables de MFI, probablemente debido al fotoblanqueo en algunas muestras como se ve a ~ 9 y 11 mW / cm2.

Figura 1: Pipeline general de experimentos de alto rendimiento que prueban sistemas optogenéticos. Las células se siembran en una placa negra de 96 pocillos durante 24 h. Luego, las células se transfectan con un período de incubación de 12 minutos de ADN y reactivo de transfección. 24 h después de la transfección, la placa se coloca en el OptoPlate-96 para la activación de la luz azul. Después de la duración deseada de la activación de la luz azul, las células se preparan en un entorno de luz roja para la citometría de flujo. Los datos de citometría de flujo se representan como gráficos de intensidad de fluorescencia media de células positivas para eGFP en la oscuridad o tratadas con luz azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imágenes representativas de microscopía de fluorescencia de 2pLACE en estado de encendido y apagado en células HEK293T. Se probaron diferentes proporciones de masa de CRY2-eGFP: CIBN-gRNA para determinar los niveles de expresión de eGFP. Las células se expusieron a la luz azul (ON) o se mantuvieron en la oscuridad (OFF) durante 24 h. La barra de escala representa 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Diagramas de dispersión representativos de citometría de flujo de células HEK293T no transfectadas (UT), CMV-eGFP y 2pLACE. La citometría de flujo se realizó utilizando la función de cargador de placas. (A) HEK293T celdas se cerraron en función de la dispersión directa (FSC-A) y la dispersión lateral (SSC-A). La concentración de eventos en las parcelas SSC-A frente a FSC-A se puede visualizar utilizando un gráfico de contorno (Figura complementaria 3A) para ayudar a controlar las poblaciones sanas. La discriminación de dobletes se realizó en un gráfico SSC-H vs. SSC-A utilizando una puerta lineal. El gráfico final detuvo las células fluorescentes haciendo referencia a la muestra no transfectada. (B) Las celdas se cerraron como en (A), mostrando la población fluorescente y la intensidad de fluorescencia en la tabla de estadísticas (Figura complementaria 2B). (C, D) 2pLACE-transfected se cerraron por separado a través de la puerta P3. La población magenta representa todas las células positivas para eGFP (Figura complementaria 3B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Análisis cualitativo y cuantitativo de la expresión de eGFP inducida por la luz en células HEK293T. (A) Imágenes de microscopía de fluorescencia de células HEK293T transfectadas con plásmidos 2pLACE o CMV-eGFP. (B) Cuantificación de la intensidad media de fluorescencia (MFI) de eGFP en células mantenidas en condiciones de luz azul u oscuridad. (C) Porcentaje de células positivas para eGFP medido mediante análisis de activación por citometría de flujo. La activación dio como resultado que el <0,1% de las células no transfectadas cayeran dentro del umbral positivo para eGFP. Los datos de citometría de flujo representan valores medios y las barras de error indican desviaciones estándar de cuatro réplicas técnicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Citometría de flujo de proporciones de masa representativas de 2pLACE e intensidades de luz azul. (A) Varias relaciones de masa de CRY2-eGFP: CIBN-gRNA se transfectaron en células HEK293T, que luego se expusieron a la luz azul o se mantuvieron en la oscuridad utilizando la misma configuración que se informó en el paso 3 del protocolo. Cada condición es la media de 3 réplicas biológicas. (B) Tendencia representativa de la expresión génica en función de la intensidad de la luz azul. Cada condición es la media de 6 réplicas técnicas. Las intensidades medias de fluorescencia se cuantifican mediante la activación del citómetro de flujo de las células que expresan eGFP. Todas las barras de error representan la desviación estándar. Para las proporciones de plásmidos, la significación estadística de MFI se calculó mediante una prueba t unidireccional que comparó la luz y la oscuridad de una proporción de plásmidos. Para intensidades de luz, se calculó la significación estadística con ANOVA de una vía y prueba post-hoc T2 de Tamhane en comparación con el estado oscuro (OFF). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p <0,0001, *****p < 0,00001 y ns no es significativo. Esta figura fue adaptada de Garimella et al.38. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Cantidad de plásmidos CRY2-eGFP y CIBN-gRNA por pocillo utilizando concentraciones de ejemplo. Las cantidades de volumen son por pocillo y se pueden modificar en función del número de muestras o réplicas en un experimento. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Valores recomendados para intensidades de luz azul. El código se encuentra en el Archivo de codificación complementario 1 (líneas 215-228). Los valores de intensidad equivalentes se calculan utilizando datos de calibración previamente informados con un medidor de potencia óptica. Cada nivel de intensidad tiene 6 réplicas técnicas. Las filas G y H están destinadas a CMV-eGFP y pocillos de control no transfectados. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Figura complementaria 1: Pasos 5.1-5.5 del protocolo. (A) Ejecutar el programa de inicio del sistema. (B) Estandarización del control de calidad mediante perlas de fluoróforo. (C) Cambio del modo de muestreo de tubos al modo de cargador de placas. (D) Selección de pozos para etiquetar como pozos de muestra; Se seleccionaron 35 pozos para este ejemplo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Pasos 5.6-5.14 del protocolo. (A) Configuración de gráficos de dispersión de luz: FSC-A frente a SSC-A para la activación de la población de células sanas, SSC-A frente a SSC-H para la discriminación de dobletes y SSC-A frente a FITC-A para la activación de células autofluorescentes y eGFP positivas. (B) Configuración de la tabla de estadísticas para adquirir datos FITC-A para medir la intensidad media de fluorescencia. (C) Resaltar las reglas de detención en la pestaña Eventos para mostrar. Asegure un caudal de muestra lento, expulse y cargue la placa, inicialice la sonda del citómetro de flujo y ajuste los voltajes de adquisición. (D) Crear polígonos para cerrar cada población como se muestra. (E) Agregar el número apropiado de pozos. (F) Hacer clic en Grabar automáticamente una vez que se completen los ajustes y las puertas. (G) Hacer clic en Limpieza diaria después de que se recolecten todas las muestras y se exporten las estadísticas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Validación de todas las celdas dentro de la puerta capturada, visualizadas por eventos verdes en P4 (magenta). (A) Gráfico de contorno de la población sana dentro de la puerta de población positiva para eGFP (P3). Las células se concentran principalmente en las zonas rojas, disminuyendo hacia afuera. (B) Gráfico SSC-A vs. PE-A para la compuerta P4, que proporciona una verificación adicional para garantizar que todos los eventos fluorescentes se tengan en cuenta en el gráfico FITC-A. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación complementario 1: Ejemplo de código Arduino que implementa todas las propiedades descritas en el protocolo anterior. Este archivo activa todas las posiciones de LED utilizando los valores de intensidad de LED recomendados en la Tabla 2. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.