Artículo de método

Optimización rápida de un sistema inducible por luz para controlar la expresión génica de mamíferos

DOI:

10.3791/68779

⸱

4 de noviembre de 2025

 ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of California, Davis, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Davis

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio describe un método para experimentos de alto rendimiento utilizando una matriz de LED impresa en 3D para optimizar la expresión génica inducible por luz en células HEK293T.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las herramientas de expresión génica inducibles pueden abrir aplicaciones novedosas en salud humana y biotecnología, pero las opciones actuales suelen ser caras, difíciles de revertir y tienen efectos indeseables fuera del objetivo. Los sistemas optogenéticos utilizan proteínas sensibles a la luz para controlar la actividad de los reguladores, de modo que la expresión se controla con solo presionar un interruptor. Este estudio optimiza un sistema efector CRISPR activado por luz simplificado (2pLACE), que proporciona un control sintonizable, reversible y preciso de la expresión génica de los mamíferos. El OptoPlate-96 permite la detección de alto rendimiento mediante citometría de flujo para el análisis de una sola célula y la optimización rápida de 2pLACE. Este estudio demuestra cómo usar el sistema 2pLACE con OptoPlate-96 en celdas HEK293T para identificar las proporciones óptimas de componentes para maximizar el rango dinámico y encontrar la curva de respuesta de intensidad de luz azul. Se pueden desarrollar flujos de trabajo similares para otras células de mamíferos y para otros sistemas optogenéticos y longitudes de onda de luz. Estos avances mejoran la precisión, escalabilidad y adaptabilidad de las herramientas optogenéticas para aplicaciones de biofabricación.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las herramientas de biología sintética, como los sistemas de expresión génica inducible, han proporcionado contribuciones significativas a la investigación biológica. Su capacidad para regular la expresión génica de manera ajustable, reversible y precisa puede mejorar el control de la producción de proteínas 1,2,3,4,5,6, la morfología celular 7,8,9,10,11,12, las vías metabólicas 13,14,15,16,17,18, y otros objetivos para aplicaciones terapéuticas y de biofabricación. Los sistemas inducibles por productos químicos pueden tener efectos residuales19,20 o fuera del objetivo. Los aditivos químicos también pueden ser muy caros y difíciles de escalar industrialmente debido a los procesos de purificación posteriores adicionales 21,22,23. Los sistemas de expresión génica inducibles por la luz pueden ofrecer un método escalable y preciso para las prácticas de biofabricación 24,25,26,27.

Muchos sistemas de expresión génica inducibles por la luz se han desarrollado como herramientas útiles de biología sintética en una variedad de aplicaciones 28,29,30,31,32,33,34,35,36 y longitudes de onda de azul 35,37,38, rojo / rojo lejano 12,39,40, o luz verde41. En el caso de la regulación génica optogenética basada en CRISPR, la modificación de la cantidad de ARN guía individuales (ARNg) administrados puede afectar la expresión de ARNm de genes endógenos42, y deberá optimizarse para diferentes líneas celulares. También se pueden utilizar proteínas de transactivación como VP64 37,42,43,44, VP16 39,40,44,45,46, p6544, o fusiones de ellas 47, aumentando la modularidad de los sistemas optogenéticos. Con el fin de investigar vías biológicas complejas y entrelazadas 12,40,48,49,50,51,52,53, se pueden probar diferentes combinaciones de estos componentes conocidos. Además, diferentes líneas celulares pueden mostrar diferencias en la inducción con el mismo sistema52. Los diferentes niveles de inducción pueden conducir a una expresión génica insuficiente o sensibilidad en el control preciso de la expresión génica, lo que requiere pruebas rigurosas para encontrar un sistema optogenético óptimo en líneas celulares novedosas o biológicamente más relevantes. Con un ritmo creciente y una aplicabilidad cada vez mayor de la regulación de genes optogenéticos, es imperativo caracterizar rápidamente estos diferentes sistemas.

Los métodos actuales para caracterizar las herramientas optogenéticas utilizan la expresión estable o transitoria de genes12,54. Generar líneas celulares que se expresan de manera estable y optimizar la dinámica del sistema para obtener la máxima expresión puede llevar mucho tiempo y, por lo tanto, ser costoso. La expresión transitoria permite obtener información rápida y valiosa, especialmente cuando se prueban sistemas optogenéticos multicomponente. Aquí, utilizamos el sistema efector CRISPR-dCas9 (LACE)37 activado por luz azul, compuesto por criptocromo 2 (CRY2) y terminal N de hélice básica (CIBN) que interactúa con criptocromo. Se ha utilizado para controlar la expresión génica en células de mamíferos como HEK293T (células renales embrionarias humanas)37,38, CHO-DG44 (células de ovario de hámster chino)55 y C2C12 (células de mioblastos de ratón)38. Su naturaleza modular es ideal para caracterizar rápidamente el rendimiento del sistema a través de métodos de expresión transitoria y alto rendimiento. Por ejemplo, los sistemas multicomponentes como LACE pueden necesitar la optimización de las relaciones de masa para mejorar la inducción, un paso que no se emplea normalmente en la caracterización del sistema optogenético.

Este protocolo detalla la rápida optimización y caracterización de dos plásmidos del sistema LACE (2pLACE)38. En esta configuración, 2pLACE controla la expresión de un reportero fluorescente, eGFP (proteína fluorescente verde mejorada), en células HEK293T. La activación se realiza en placas de 96 pocillos con fondo de vidrio negro utilizando un OptoPlate-96, una matriz de LED impresa en 3D diseñada y construida por Lukasz Bugaj y sus colegas 56,57,58,59. Este protocolo optimiza específicamente la expresión máxima con diferentes proporciones de masa del sistema de dos plásmidos. También incluye un código fácil de usar para controlar diferentes intensidades de luz para investigar la capacidad de sintonización del sistema y su rango dinámico completo. La citometría de flujo se utiliza para la recopilación y el análisis de datos. Los protocolos para generar construcciones de plásmidos y materiales de impresión 3D para la matriz de LED se pueden encontrar en publicaciones anteriores54,56. Estos métodos destacan una línea rápida y de alto rendimiento para caracterizar sistemas de expresión génica inducibles por luz.

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Protocolo

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1. Recubrimiento de celdas HEK293T en un formato de 96 pocillos

  1. En un gabinete de bioseguridad, recoja un contenedor de desechos de lejía, pipetas serológicas, pipeta-aid, solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS), medio de águila modificado con Dulbecco (DMEM) con 10% de suero fetal bovino (FBS) y un matraz de cultivo celular T-75 con células HEK293T confluentes. Precalentar el medio a 37 °C.
  2. En un matraz T-75, verifique que la confluencia sea aproximadamente 80%-100% confluente a través de un microscopio invertido.
  3. En la cabina de bioseguridad, utilice una pipeta serológica para aspirar el medio gastado del matraz de cultivo celular. Evite tocar la superficie o el plástico del matraz. Deseche el medio gastado y el aspirador en el contenedor de residuos.
  4. Lave suavemente las células con aproximadamente 10 ml de DPBS aspirándolo en una esquina del matraz y girándolo suavemente alrededor de la superficie. Aspirar el DPBS del matraz y desechar el lavado y el aspirador en el contenedor de residuos.
  5. Añadir 1,5 ml de tripsina-EDTA al 0,05% para cubrir la superficie del matraz e incubar a temperatura ambiente durante 1 min. Golpee suavemente el matraz para aflojar las células de la superficie.
  6. Añadir 8,5 ml de DMEM fresco en el matraz. Vuelva a suspender y mezcle las células con una pipeta serológica hasta que todos los agregados se hayan roto aspirando hacia arriba y hacia abajo.
  7. Recoja 9 ml de suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml.
    1. Añadir 9 ml de DMEM fresco en el matraz y colocarlo en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2
  8. Con un hemocitómetro, mezcle 10 μL de células suspendidas con 10 μL de colorante azul de tripano en una proporción de 1:1 para calcular la concentración de células. Utilice este valor para preparar suficientes células para sembrar en el plato.
  9. Sembrar ~35.000 células en 100 μL por cada pocillo de una placa inferior de vidrio negro de 96 pocillos #1.5 de alto rendimiento y colocar en una incubadora a 37 °C y 5% de CO2 durante 24 h.

2. Optimización de la transfección 2pLACE

  1. Para un pocillo y un exceso del 10%, alícuota 11 μL de DMEM sin suero tibio (SFM) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  2. Usando un CRY2-eGFP: CIBN-gRNA proporciones de masa de plásmidos iguales a 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7: 3, 8:2 y 9:1, alícuota 110 ng para cada pocillo de ADN total a las alícuotas de SFM (Tabla 1).
  3. Como control positivo, alícuotas de la misma masa de plásmido CMV-eGFP a diferentes alícuotas de SFM.
  4. Por cada pocillo, alícuota 11 μL de SFM para la dilución del reactivo de transfección.
  5. Prepare el reactivo de transfección en una proporción de masa (μg) a volumen (μL) de 1:3 de ADN y reactivo de transfección.
  6. Agregue el reactivo de transfección diluido al ADN diluido e incube durante 12 min a temperatura ambiente para crear los complejos de transfección.
  7. Agregue ~ 20 μL del complejo de transfección a cada pocillo. Asegúrese de que no toque las paredes del pozo.
  8. Envuelva la placa en papel de aluminio y colóquela en una incubadora a 37 °C y 5% deCO2 durante 24 h.

3. Activación de 2pLACE

  1. Modifique el código de entrada del microcontrolador para iluminar los pocillos deseados utilizando estos ajustes (Archivo de codificación suplementario 1, líneas 147 - 158).
    1. Intensidad del LED: 9,27 mW/cm2 (Archivo de codificación suplementario 1, líneas 200 - 215).
    2. Longitud del pulso: 1 s (Archivo de codificación suplementario 1, líneas 280 - 290).
    3. Frecuencia de pulso: 0,067 Hz (cada 15 s) (Archivo de codificación suplementario 1, líneas 264 - 278).
      NOTA: La configuración de la longitud de onda está determinada por los tipos de LED instalados.
  2. Rocíe la tapa impresa en 3D del OptoPlate con etanol al 70% y déjelo secar en un gabinete de bioseguridad.
  3. Encienda una lámpara de luz roja en el cuarto oscuro y coloque la placa de 96 pocillos en un gabinete de bioseguridad, y reemplace la tapa con la tapa seca impresa en 3D.
    NOTA: Opcionalmente, se pueden ver las células CMV-eGFP utilizando microscopía de fluorescencia para estimar la eficiencia de la transfección.
  4. Tome la placa de 96 pocillos y colóquela en la matriz de LED para construir el aparato de matriz de LED. Asegúrese de que la placa encaje en su lugar.
  5. Conecte el microcontrolador, el LED y los puertos del ventilador a una fuente de alimentación.
  6. Rocíe cuidadosamente los cables con etanol al 70% y séquelos.
  7. Coloque el aparato de matriz de LED en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO2 durante 24 h. Asegúrese de que los LED se enciendan según lo previsto y que los cables no estén tensos cuando la incubadora esté sellada.

4. Preparación de citometría de flujo

  1. Mientras se encuentra en un entorno de luz roja, saque el OptoPlate y colóquelo en un gabinete de bioseguridad
    NOTA: Opcionalmente, se pueden ver las células mediante microscopía de fluorescencia para confirmar visualmente la inducción de luz.
  2. Aspire cuidadosamente todos los medios de cada pocillo.
  3. Desconecte las células con 30 μL de tripsina-EDTA al 0,05% e incube durante 1 min a temperatura ambiente.
  4. Mezcle cada pocillo con tampón FACS frío de 100 μl (FBS al 1% en PBS) hasta que se convierta en una sola célula.
  5. Transfiera cada muestra a una placa de 96 pocillos con fondo en V.
  6. Centrifugar la placa de 96 pocillos con fondo en V a 164 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
  7. Aspirar 80 μL de sobrenadante sin alterar el sedimento.
  8. Agregue 200 μL de tampón FACS frío para resuspender el sedimento.
  9. Envuelva la placa de 96 pocillos con fondo en V en papel de aluminio para un aislamiento ligero.
  10. Coloque el plato en una caja de espuma de poliestireno con hielo para su transporte.

5. Activación de citometría de flujo y recopilación de datos

  1. Encienda el citómetro de flujo con el interruptor de la parte posterior y abra el software de citometría de flujo correspondiente en el ordenador.
  2. Ejecute el programa de inicio del sistema y cargue 2 ml de agua desionizada en el cargador de muestras (Figura complementaria 1A).
  3. Ejecute el control de calidad (QC) utilizando las perlas de control de calidad proporcionadas (Figura complementaria 1B).
  4. Asegúrese de que el citómetro de flujo esté en modo de muestreo de placa (Figura complementaria 1C).
  5. Configure y especifique pocillos de muestra (Figura complementaria 1D).
  6. Cree los siguientes diagramas de dispersión y tablas (Figura complementaria 2A).
    1. Dispersión lateral (SSC-A) vs dispersión directa (FSC-A).
    2. SSC-H contra SSC-A.
    3. SSC-A frente a FITC-A.
    4. Tabla de estadísticas FITC-A (Figura complementaria 2B).
  7. Encaje la placa inferior en V en el cargador de placas del citómetro.
  8. Seleccione un pocillo no transfectado y haga clic en Inicializar, y luego haga clic en Ejecutar.Asegúrese de que la frecuencia de muestreo de volumen sea de 10 μL/min (Figura complementaria 2C).
  9. Ajuste los voltajes SSC y FITC para centrar la población de interés en el gráfico SSC-A frente a FSC-A (Figura complementaria 2C).
    1. Cree un polígono para controlar la población de células sanas de interés (Figura complementaria 2D).
    2. Cree un polígono para la puerta para la discriminación de dobletes en el gráfico SSC-H vs SSC-A.
    3. Ajuste el voltaje FITC para colocar celdas no transfectadas hacia la izquierda del gráfico SSC-A vs FITC-A (Figura complementaria 2D).
  10. Repita para los pocillos restantes sin transfectar y registre los datos FITC-A medios.
  11. Seleccione un pozo transfectado CMV-eGFP y haga clic en Ejecutar.
  12. Ajuste el voltaje FITC para capturar células autofluorescentes y fluorescentes en el gráfico SSC-A frente a FITC-A.
    1. Cree un polígono para conectar las celdas fluorescentes con las celdas no fluorescentes mientras hace referencia a la puerta inicial en celdas no transfectadas (Figura complementaria 2E).
  13. Registre automáticamente las muestras a 60 μL/min hasta que se hayan alcanzado los 200 s y/o los eventos hayan alcanzado los 10.000 (Figura complementaria 2F).
  14. Exporte Mean FITC como un archivo CSV y analice los datos.
  15. Limpie el citómetro de flujo a través de la opción Limpieza diaria (Figura complementaria 2G).

6. Optimización de la intensidad del LED

  1. Edite el script del microcontrolador para probar las intensidades de LED deseadas (Archivo de codificación complementario 1, líneas 200-215).
    NOTA: Las intensidades de LED equivalentes con respecto a los valores en el script del microcontrolador se informan en otra parte38. La autocalibración puede ser necesaria cuando se utilizan diferentes LED.
  2. Asegúrese de que el script contenga los siguientes valores en (Archivo de codificación complementario 1, líneas 200-215) como se diseñó en la Tabla 2 y cargue el código en el microcontrolador.
  3. Repita los pasos 1-5.

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Resultados

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Adoptando elementos de flujo de trabajo de la literatura anterior 37,38,55, agregamos iluminación simultánea de alto rendimiento del OptoPlate-96 y demostramos una tubería para optimizar rápidamente un sistema de expresión génica inducible por luz en células de mamíferos (Figura 1).

Para los sistemas de expresión génica inducible, los ran...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo demuestra el control optogenético de una expresión génica transitoria multicomponente en células de mamíferos, lo que permite a otros investigadores caracterizar rápida y simultáneamente sistemas optogenéticos modulares con un reportero fluorescente.

En este caso, se optimizó un sistema inducible por luz de dos plásmidos para la expresión de eGFP en células HEK293T. Para una cotransfección exitosa, es esencial optimizar las densidades de siembra...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo cuenta con el apoyo del Instituto de Investigación Traslacional a través del Acuerdo de Cooperación de la NASA NNX16AO69A y del Good Foods Institute. Este proyecto fue apoyado por el Laboratorio de Recursos Compartidos de Citometría de Flujo de UC Davis con la asistencia técnica de Bridget McLaughlin, Jonathan Van Dyke y Ashley Karajeh, con fondos del NCI P30 CA093373 (Centro Integral del Cáncer) y S10OD018223 (citómetro Beckman Coulter "Cytoflex").

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos microcentrífugas de 1,5 mLVWR10025-724
Reservorios de reactivos de 10 mLVWR77395-252
Pipetas serológicas de 10 mLVWR75816-100
1000 y mu; Puntas del filtro en LVWR76322-154
15 mL  Tubos de centrifugadora de alto rendimiento, tapa planaVWR89039-664
Medidor de potencia óptica 1931-CNewport1931-C
2 mL de pipetas serológicasVWR75816-104
20 & mu; Puntas del filtro en LVWR76322-134
200 & mu; Puntas del filtro en LVWR76322-150
Tubos centrífugos de alto rendimiento de 50 mL, tapa planaVWR89039-656
Placas en V de 96 pozosMARCAplacas781661
A21, bombilla LED rojaBombillas BluexN/AFuente de luz roja
Arduino IDE SoftwareArduinoN/A
Gabinete de Bioseguridad, Clase IINuAireN/A
Hemocitometro de línea brillanteHausser Scientific3110
Diapositivas de conteo de célulasBioRad1450016
Placa de cultivo celular de 96 pozos, placa inferior de vidrio #1,5HCellvisP96-1.5H-N
CytExpert SoftwareBeckman CoulterN/A
Fluorosferas de control de calidad diarias listas para usar CytoFLEXBeckman CoulterC657194 & deg; C
Citómetro de flujo CytoFLEX-S (4 canales violetas, 2 azules, 4 amarillos verdes, 3 rojos)Beckman CoulterC09766
Polvo salino tamponado con fosfato de Dulbecco, sin calicum, sin magnesioFisher Scientific21600069Temperatura ambiente
Centrífuga Eppendorf 5804Eppendorf  022622501Paso de centrífuga con placa inferior en V
Centrífuga Eppendorf 5810REppendorf22625501
Eppendorf Research plus, 8 canales, volumen variable, 30 - 300 y mu; LEppendorf3125000052
Eppendorf Research plus, canal único, volumen variable, 100 - 1000 & mu; LEppendorf3123000063
Eppendorf Research plus, monocanal, volumen variable, 2 - 20 y mu; LEppendorf3123000039
Eppendorf Research plus, canal único, volumen variable, 20 - 200 y mu; LEppendorf3123000055
Cinta de etiquetado de laboratorio de uso generalVWR89097-920
DMEM gibco, polvo, glucosa altaFisher Scientific121000614 & deg; C
Solución azul de Gibco Trypan, 0,4%Fisher Scientific15-250-061Temperatura ambiente
Gibco Value Heat Inactivated FBSFisher ScientificA5256901-20 y grados; C
Gibco, Tripsina-EDTA (0,05%), con EDTA, Origen Animal, 1X, Fenol Rojo, 500 mLGibco25300062-20 y grados; C
HEK293T CélulasATCCCRL-11268-80 ºC; C, nitrógeno líquido
Marcadores de laboratorio, MicronovaVWR89205-944
Lámpara de escritorio metálicaDiseños sencillosN/ALámpara para luz roja
OptoPlate-96LABmakerN/A
XP de ayuda de bisetaDrummond4-000-101
Plásmido: CIBN-gRNAN/AN/A-20 y grados; C
Plásmido: CMV-eGFPN/AN/A-20 y grados; C
Plásmido: CRY2-eGFPN/AN/A-20 y grados; C
Reactivo de transfección in vitro de ADN PolyJetFisher ScientificNC15361174 & deg; C
Matraz de cultivo celular T-75VWR10062-860
Incubadora de CO<2/sub> con chaqueta de aguaVWR10810-884

Referencias

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