Method Article

Cuantificación tridimensional del moco intestinal mediante imágenes de tejido de montaje completo

DOI:

10.3791/68789

⸱

September 12th, 2025

 ,  ,  , 
1Laboratory of Host-Microbe Interactions and Cell Dynamics, Department of Medical Biotechnology and Laboratory Science, College of Medicine, Chang Gung University, 2Institute of Microbiology and Immunology, National Yang Ming Chiao Tung University, 3Program in Molecular Medicine, National Yang Ming Chiao Tung University and Academia Sinica, 4Graduate Institute of Biomedical Sciences, College of Medicine, Chang Gung University, 5Center for Molecular and Clinical Immunology, Chang Gung University, 6Division of General Surgery, Department of Surgery, Chang Gung Memorial Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio presenta un método de imagen en 3D que utiliza tejidos intestinales de montaje completo y microscopía multifotónica para cuantificar el moco secretado, lo que permite un análisis volumétrico preciso y la visualización de la dinámica del moco en respuesta a estímulos como el cloruro de carbamoilcolina.

Abstract

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El moco juega un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis intestinal al facilitar la digestión, formar una barrera contra los microbios y regular las respuestas inmunes dentro del intestino. Su secreción está modulada por varios factores intrínsecos y extrínsecos, incluidas las infecciones microbianas y la inflamación. Si bien los métodos tradicionales para el análisis de moco se basan en la cuantificación relativa, como la medición del grosor del moco en secciones histológicas, estos enfoques proporcionan una visión limitada del volumen real y la distribución espacial del moco secretado dentro de la luz intestinal. Aquí, presentamos una metodología detallada para la cuantificación tridimensional absoluta del moco utilizando tejidos intestinales de montaje completo y microscopía multifotónica. Este protocolo incluye la preparación de asas intestinales ligadas, tratamiento con cloruro de carbamoilcolina como estímulo para la activación de las células caliciformes, fijación de tejidos y tinción para imágenes. Usando microscopía multifotónica, adquirimos imágenes apiladas Z de la superficie luminal. Estos se procesan en el software Imaris para cuantificar el volumen y la distribución espacial de la mucosidad secretada. Demostramos que el cloruro de carbamoilcolina induce de manera robusta la secreción de moco en los tejidos ileales y colónicos en 30 minutos. El moco secretado aparece de manera esporádica y discontinua a lo largo de la luz, lo que subraya la importancia del análisis volumétrico sobre los enfoques bidimensionales tradicionales. Este protocolo permite a los investigadores obtener datos cuantitativos absolutos y visualizar la distribución del moco in situ, ofreciendo una poderosa herramienta para estudiar la dinámica del moco intestinal en condiciones fisiológicas y patológicas.

Introduction

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El entorno mucoso del tracto gastrointestinal de los mamíferos es altamente dinámico, lo que favorece la colonización de una comunidad microbiana diversa. El epitelio intestinal consta de varias células especializadas que colaboran para absorber nutrientes, mantener la integridad de la barrera y comunicarse con el sistema inmunológico1. Entre estos, las células caliciformes almacenan gránulos de mucina y secretan moco en la luz en condiciones de estado estacionario. Este moco forma una barrera física crítica, evitando el contacto microbiano directo con la capa epitelial, modulando la inflamación tisular y manteniendo la homeostasis intestinal 2,3. La desregulación de la secreción de moco compromete la función de barrera y se ha asociado con inflamación y tumorigénesis 4,5,6,7.

La secreción de moco intestinal puede ser desencadenada por factores intrínsecos, como el neurotransmisor acetilcolina, y por componentes microbianos de comensales 8,9. Dada la complejidad del entorno intestinal, muchos factores que influyen en la secreción de moco de las células caliciformes permanecen inexplorados. Por lo tanto, un método preciso para cuantificar el moco luminal es esencial para investigar cómo los diferentes estímulos afectan la dinámica de la secreción. Los enfoques tradicionales se basan principalmente en la cuantificación relativa: por ejemplo, medir el grosor del moco utilizando partículas fluorescentes o de carbón en sistemas de explante intestinal ex vivo 10,11, o evaluar la distancia entre los microbios luminales y el epitelio en secciones de tejido teñido12,13. Si bien estos métodos son convenientes para comparaciones relativas, es posible que no capturen la distribución completa o la estructura tridimensional del moco secretado, particularmente porque el moco secretado no siempre cubre uniformemente el epitelio.

En este estudio, presentamos un método para la visualización tridimensional y la cuantificación absoluta del moco luminal utilizando tejidos intestinales de montaje completo. Este enfoque requiere la fijación de tejido fresco con un fijador apropiado para preservar la integridad estructural y la morfología, seguido de tinción fluorescente e imágenes con un microscopio confocal o multifotónico. Al administrar agentes de prueba directamente en asas intestinales ligadas de ratones profundamente anestesiados, seguido de una fijación inmediata, el método preserva la arquitectura del moco nativo y permite el análisis de la cinética de secreción. En comparación con los tejidos seccionados, donde la profundidad de la imagen está limitada principalmente por el grosor del tejido, la profundidad de la imagen de los tejidos de montaje completo (sin delipidación) alcanza aproximadamente 200-300 μm, limitada por la dispersión de la luz y la opacidad del tejido. Usando esta técnica, mostramos que el cloruro de carbamoilcolina (CCh), un análogo de la acetilcolina cuyos receptores se expresan en las células caliciformes14, induce robustamente la secreción rápida de moco. En particular, el moco secretado forma una capa continua a lo largo del epitelio y estructuras discontinuas dentro de la luz, características que son difíciles de detectar en secciones de tejido convencionales. Este protocolo proporciona una plataforma sólida para cuantificar la distribución tridimensional del moco intestinal y para comparar el potencial inductor de moco de varios estímulos.

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Protocol

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Todos los experimentos con animales están aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Chang Gung. La instalación de animales de la Universidad de Chang Gung está acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC). No se observaron problemas de salud animal en estos estudios.

1. Preparación de la base de fijación.

  1. Mezclar agarosa en polvo con ddH2O hasta una concentración del 4% (p/v) en un matraz apto para microondas. Cocine en el microondas durante 2-3 minutos hasta que hierva sin pequeñas burbujas.
    NOTA: El volumen depende del número de muestras; aproximadamente 10 ml para un plato de 6 cm.
  2. Deje que la solución de agarosa se enfríe a ~60 °C en ~3 min. Vierta la agarosa en un plato de 6 cm con cuidado hasta que la altura del líquido alcance la mitad del plato (aproximadamente 10 ml para un plato de 6 cm).
  3. Coloque el plato con tapa en un área cerrada durante 20-30 min, hasta que la agarosa se haya solidificado por completo.

2. Preparación del material de fijación

  1. Prepare nuevos alambres de cobre y córtelos en longitudes de 5 mm. Cada pieza de tejido requiere de 6 a 8 piezas de alambre.

3. Preparación de la solución de CCh

  1. Disuelva el CCh cristalino en tampón PBS estéril hasta una concentración final de 10 μM (200 μL para un asa intestinal).

4. Preparación de anestésicos inyectables

  1. Para preparar la solución madre para la anestesia, disuelva el 2,2,2-tribromoetanol en 2-metil-2-butanol.
  2. Utilice PBS estéril para diluir la solución madre, de modo que la solución de trabajo final contenga 30 mg/ml de 2,2,2-tribromoetanol y 3% (v/v) de 2-metil-2-butanol.
  3. Agite completamente durante ~ 1 min hasta que no quede ningún gránulo en solución (tasa máxima: 8).
  4. Almacenar la solución madre en la oscuridad a 4 °C para evitar la degradación; Deseche el caldo 1 mes después de la preparación.
  5. Antes de la anestesia, extraiga la solución madre en PBS estéril y mezcle bien para asegurar una dispersión uniforme, logrando una dosis final de 250 mg / kg por ratón.
    PRECAUCIÓN: El 2,2,2-tribromoetanol tiene neurotoxicidad y el 2-metil-2-butanol es volátil y tiene un olor irritante. Se debe utilizar el equipo de protección adecuado. Para su eliminación, recoja los desechos en un contenedor sellado y siga los procedimientos de eliminación de desechos químicos peligrosos de la institución.

5. Inoculación intestinal mediante inyección de asa

  1. Anestesiar a un ratón de 6-8 semanas de edad con una inyección intraperitoneal de 200 μL de 2,2,2-tribromoetanol (250 mg/kg por ratón), y colocar al ratón sobre una almohadilla térmica para mantener su temperatura corporal.
  2. Después de esterilizar la superficie de la piel con alcohol, haga una incisión en la parte inferior izquierda del abdomen del ratón con unas tijeras quirúrgicas y exponga el ciego bajo anestesia.
  3. Identifique el íleon o el colon proximal, coloque el asa intestinal sobre una gasa estéril y use pinzas arteriales para asegurar ambos extremos, creando un circuito cerrado de 3 cm de largo.
  4. Enjuague el órgano en la gasa con PBS estéril.
  5. Inyecte el reactivo estéril PBS o CCh en un volumen no superior a 200 μL en el asa intestinal ligada bajo anestesia.

6. Recolección de tejidos, fijación y tinción

  1. Después de 30 minutos de tratamiento, eutanasia al ratón por dislocación cervical y cosecha el asa intestinal.
  2. Use fórceps para sostener el asa intestinal y enjuáguelo suavemente en PBS estéril.
  3. Corte suavemente el asa intestinal longitudinalmente y enjuague el tejido en PBS estéril.
  4. Aplana el tejido y usa segmentos de alambre de cobre para anclarlo a la agarosa en un plato de 6 cm.
  5. Fije el tejido con 10 ml de solución de paraformaldehído al 4% durante 12-24 h en el plato.
  6. Lave el pañuelo con PBS al menos 3 veces para eliminar el paraformaldehído residual.
  7. Sumerja el tejido en 10 ml de tampón bloqueante (PBS suplementado con Triton X-100 al 0,4% y albúmina sérica bovina al 3% [BSA]) a 4 °C durante 12-24 h en el plato.
  8. Tiñir el tejido con aglutinina de germen de trigo (WGA, 1:200) y faloidina (1:500) en tampón de bloqueo, agitando a 120 rpm a 4 °C durante 12-24 h en el plato.
    NOTA: Para minimizar el consumo de colorante, el tejido se puede anclar en agarosa solidificada en un plato de 3 cm sumergido en 2 ml de tampón de colorante para tinción.
    PRECAUCIÓN: El paraformaldehído representa un peligro de inhalación. Se debe utilizar el equipo de protección adecuado durante la manipulación, como la operación en una campana extractora. Para su eliminación, recoja los desechos en un contenedor sellado y siga los procedimientos de eliminación de desechos químicos peligrosos de la institución.

7. Captura de imágenes por microscopía multifotónica

  1. Lave el tampón de tinción restante al menos 3 veces con PBS.
  2. Anclar el tejido sobre agarosa con alambres de cobre en un plato de 6 cm en 10 mL de PBS.
  3. Adquiera 100 secciones ópticas (que cubren 99 μm de profundidad) de tejido intestinal y moco secretado asociado utilizando un microscopio multifotónico equipado con una lente de objetivo de alta NA para imágenes de tejidos profundos. Utilice una fuente de excitación para microscopía multifotónica ajustada a una longitud de onda de 750 nm. Recopile señales de emisión utilizando filtros de paso de banda BP500-550 nm y BP565-610 nm. Establezca la velocidad de escaneo en 8.
    NOTA: Para la microscopía multifotónica, la velocidad máxima de escaneo es 9, y los valores más altos indican una adquisición más rápida. El ajuste de velocidad depende de la capacidad del microscopio. Cuando se utiliza la plataforma de imágenes utilizada para adquirir pilas 3D, recomendamos una velocidad de escaneo de 8 para equilibrar el tiempo de adquisición y la calidad de la imagen.

8. Análisis de imágenes y cuantificación de moco (Figura 1)

  1. Para medir el volumen de cada partícula de moco (en el canal WGA), abra la pila de imágenes en Imaris arrastrando y soltando el archivo en la página Arena. Haga clic en el icono Superficie para comenzar el flujo de trabajo de creación de superficies. Siga los pasos estándar para segmentar y cuantificar los volúmenes de partículas dentro de la pila z. Los parámetros específicos y los pasos de procesamiento se detallan en la Figura 1.
  2. Excluya las partículas de moco menores de 1,000 μm3, que en su mayoría son células caliciformes (Figura 2A, B).
  3. Sume el volumen de moco secretado para cada grupo.

9. Análisis estadístico

  1. Analice y compare el volumen total de cada grupo. Introduzca el valor del volumen de moco en Columna y analice utilizando una prueba de Mann-Whitney no paramétrica.

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Results

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En este método, cuantificamos el volumen de moco intestinal a partir de imágenes apiladas de tejidos de montaje completo adquiridos mediante microscopía multifotónica. Los tejidos intestinales se tiñeron con faloidina fluorescente y aglutinina de germen de trigo (WGA) para visualizar la F-actina celular y el moco, respectivamente15,16. Tanto en los tejidos ileales como en los colónicos tratados con PBS, el moco WGA+ se detectó principalmente dentro de ...

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Discussion

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Aquí, presentamos un método para la cuantificación tridimensional del moco intestinal utilizando tinción tisular de montaje completo, microscopía multifotónica y análisis con el software Imaris. Este procedimiento permite observar la distribución discontinua de moco dentro de la luz intestinal y proporciona una medición absoluta del volumen de moco.

También se ha observado una distribución discontinua de moco tras la estimulación en sistemas de cultivo de teji...

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Disclosures

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Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Acknowledgements

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Agradecemos al Laboratorio Central de Microscopía, Chang Gung Memorial Hospital, Linkou, por su asistencia técnica. También nos gustaría agradecer la asistencia de la Instalación Central de Imágenes de la Universidad Nacional Yang Ming Chiao Tung por el servicio del microscopio multifotónico Zeiss LSM 7 MP, especialmente a la Sra. Pei-jun Chen y Yung-yu Lu por su apoyo técnico. Los autores desean agradecer el apoyo de NSTC 110-2320-B-A49A-544-MY3 y 113-2628-B-182-002-MY3 (a YHT).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,2,2-tribromoetanolSigma-AldrichT48402
2-metil-2-butanolSigma-Aldrich240486
6 cm de plato y nbsp;Alpha Plus16021-1
Agarose HispanagarA02599
BSABioShopALB001
Cloruro de carbamoilcolina & ge; 98% (titulación), cristalinoSIGMASI-C4382-1G
Alambre de cobre (nuevo)CABLE DE TECNOLOGÍA SUPERIOR Y INDUSTRIA DEL CABLEIW00125Alambre de cobre sin capa aislante
FórcepsShinetehST-M110
Gasa, estérilGMTHMayo-40
GraphPad Prism 8 GraphPad Software
Almohadilla térmicaCONFORTSY-666
IMARIS 10.0.0INSTRUMENTOS OXFORD
ParaformaldehidoBIOVOVASBL0415-1000
PBSGENESTARBL0180-1000
Sondas de Marcado de FaloidinasInvitrogenA12379
TijerasShineteh02-1250.18
Triton X-100Merck1.08603.1000
Conjugados de la Aglutinina de Germen de Trigo (WGA)Biotium29027
Zeiss 7MP con un objetivo de inmersión en agua W Plan-Apochromat 20 x/1.0 DIC III (NA 1.0), láser Spectra-Physics Mai Tai HP ti zafiro de femtosegundos (sin módulo DeepSee) con detectores BP500 nm-550 nm y BP565 nm-610 nm, y longitud de onda láser de 750 nmplataforma de imagen utilizada para adquirir pilas 3D con una lente objetivo de alto NA para imágenes de tejido profundo; una fuente de excitación para microscopía multifotona ajustada a una longitud de onda de 750 nm

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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