Artículo de método

Producción de microburbujas monodispersas recubiertas de fosfolípidos estables a temperatura ambiente utilizando un dispositivo microfluídico de enfoque de flujo

DOI:

10.3791/68796

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10 de octubre de 2025

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1Biomedical Engineering, Department of Cardiology, Cardiovascular Institute, Erasmus MC, 2Molecular and Nanoscale Physics Group, School of Physics and Astronomy, University of Leeds

En este artículo

Resumen

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Este artículo describe un método para producir microburbujas monodispersas recubiertas de fosfolípidos utilizando un dispositivo microfluídico de enfoque de flujo a temperatura ambiente, incluida la forma de preparar la formulación del recubrimiento de fosfolípidos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las microburbujas monodispersas han demostrado un potencial significativo para mejorar la eficacia de los agentes de contraste de ultrasonido tanto para aplicaciones de imagen como terapéuticas. Estas microburbujas se pueden producir directamente utilizando un método de enfoque de flujo microfluídico, que permite un control preciso sobre su tamaño. Sin embargo, prevenir la coalescencia durante la producción sigue siendo un desafío crítico. Si bien las temperaturas de producción elevadas (por ejemplo, 55 ° C) pueden suprimir la coalescencia, tales condiciones complican el diseño de dispositivos microfluídicos y pueden ser incompatibles con los agentes dirigidos y los conjugados de fármacos. Este protocolo describe un método para producir microburbujas monodispersas recubiertas de fosfolípidos a temperatura ambiente, manteniendo la estabilidad y monodispersidad de las microburbujas durante al menos 7 días. El protocolo también describe la fabricación de chips microfluídicos PDMS reutilizables y la preparación de la formulación del recubrimiento de fosfolípidos que contiene el tensioactivo Pluronic F68. Nuestros hallazgos muestran que las microburbujas producidas con este método mantienen su tamaño y estabilidad durante 7 días, lo que respalda su futura aplicabilidad en entornos clínicos donde los agentes de contraste de ultrasonido estables y controlables son esenciales.

Introducción

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Los agentes de contraste ultrasónicos (ACU) son ampliamente utilizados en ecografía clínica y aplicaciones terapéuticas 1,2,3. Administradas por vía intravenosa, estas microburbujas permanecen confinadas en el sistema vascular, actuando como agentes de acumulación de sangre 4,5. Una carcasa estabilizadora recubre las microburbujas y reduce la difusión de gas impulsada por la presión de Laplace, extendiendo así la vida útil de la microburbuja 3,6. Cuando se exponen a ultrasonidos, las microburbujas comienzan a oscilar y producen fuertes ecos debido a la compresibilidad del núcleo de gas 7,8. La oscilación es más pronunciada en la frecuencia de resonancia de la microburbuja, que está influenciada por el tamaño de la microburbuja y las propiedades de la cáscara 9,10,11. La ACU clínicamente aprobada generalmente consiste en microburbujas polidispersas con una amplia distribución de tamaño, que generalmente oscila entre aproximadamente 0,5 y 10 μm de diámetro 12,13,14. Esta amplia distribución de tamaño conduce a una amplia gama de frecuencias en las que estas microburbujas son resonantes. Dado que las sondas de ultrasonido clínico generalmente operan en un ancho de banda de frecuencia estrecho, solo un subconjunto de la población de UCA resuena de manera efectiva15. Se ha demostrado que las microburbujas monodispersas, que tienen una distribución de tamaño estrecha (p. ej., PDI 3 ~ 10%16,17), aumentan el diagnóstico y la terapia en comparación con las microburbujas polidispersas. Para las imágenes de ultrasonido mejoradas con contraste, la intensidad aumentó en dos o tres órdenes de magnitud18, mientras que la sensibilidad para la detección de presión no invasiva a través de señales subarmónicas casi se duplicó 19,20,21, y la eficiencia de administración de medicamentos aumentó en casi un orden de magnitud 22. En consecuencia, la producción de microburbujas monodispersas con una distribución de tamaño estrecha y, por lo tanto, una respuesta acústica es clave para maximizar su potencial para imágenes de ultrasonido y aplicaciones terapéuticas, donde las oscilaciones controladas de microburbujas son críticas.

Las microburbujas monodispersas se pueden producir a través de varios métodos, como la decantación23 , la filtración mecánica24 y la centrifugación de un agente de microburbujas polidisperso25. Sin embargo, lograr un control de tamaño preciso y una alta monodispersidad sigue siendo un desafío con estas técnicas26. Un enfoque alternativo y más controlado es la producción directa de microburbujas monodispersas utilizando un dispositivo microfluídico de enfoque de flujo. En este proceso, un hilo de gas se enfoca entre dos corrientes acuosas de liposomas en un chip microfluídico, lo que lleva a un pellizco reproducible del hilo de gas, lo que permite la producción de alta velocidad de microburbujas monodispersas en el tamaño deseado27. Aunque los métodos de enfoque de flujo se han utilizado ampliamente para producir gotas monodispersas28,29, su aplicación en la producción de microburbujas monodispersas es menos común debido a la dificultad de prevenir la coalescencia y mantener adecuadamente la estabilidad a largo plazo en términos de tamaño, monodispersidad y concentración30. La coalescencia, donde múltiples microburbujas se fusionan en otras más grandes, afecta la monodispersidad. Se ha demostrado que las temperaturas de producción elevadas reducen la coalescencia31, pero esto complica el diseño del sistema microfluídico y puede no ser adecuado para formulaciones que involucran agentes dirigidos o conjugados de fármacos. Por lo tanto, sería ventajoso producir microburbujas monodispersas a temperatura ambiente. Igualmente importante es el método de almacenamiento de estas microburbujas monodispersas, ya que las microburbujas recubiertas de fosfolípidos tienden a encogerse, colapsar y perder su monodispersidad con el tiempo32. Garantizar la estabilidad a largo plazo, durante varios días, durante el almacenamiento es fundamental para traducir la tecnología de microburbujas monodispersas en aplicaciones clínicas.

En este protocolo, describimos un método para la producción de microburbujas monodispersas recubiertas de fosfolípidos utilizando una plataforma microfluídica de enfoque de flujo a temperatura ambiente. Este método es compatible con caudales de lípidos que oscilan entre 13 y 42 μl/min y está diseñado para su uso a temperatura ambiente, lo que lo hace adecuado para laboratorios que carecen de control de temperatura en su sistema microfluídico. El protocolo utiliza una formulación de fosfolípidos que consiste en 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[carbonil-metoxipolietilenglicol] (DPPE-PEG5000) y Pluronic F68, que garantiza la estabilidad y la reproducibilidad. El protocolo proporciona instrucciones paso a paso sobre la fabricación de chips microfluídicos PDMS reutilizables, la preparación de las soluciones de recubrimiento de fosfolípidos y la incorporación del tensioactivo Pluronic F68 para evitar la coalescencia de microburbujas durante la producción a temperatura ambiente. También detalla los procedimientos para limpiar el sistema microfluídico para evitar la obstrucción de la boquilla, ajustar la presión del gas y el caudal de líquido para controlar el tamaño de las microburbujas, y recolectar y almacenar las microburbujas producidas para una estabilidad a largo plazo. Este método ofrece un enfoque práctico para generar microburbujas monodispersas estables con un control preciso del tamaño a temperatura ambiente.

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Protocolo

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1. Hacer películas lipídicas

NOTA: La mezcla de lípidos para la producción de microburbujas monodispersas está formulada con una mezcla binaria de DSPC y DPPE-PEG5000 en una proporción molar de 90:10. Se eligió DSPC como lípido principal porque se ha demostrado que proporciona una estabilidad superior contra la disolución de gas tanto en microburbujas polidispersas33,34 como monodispersas31. Se plantea la hipótesis de que esta estabilidad mejorada es el resultado de su temperatura de transición de fase cristalina de gel a líquido relativamente alta de 55 °C35, que es más alta que la de otros lípidos de uso común como DPPC (~ 41 ° C) 35, lo que conduce a una capa lipídica más rígida e impermeable a temperatura ambiente36. Aquí se muestra un ejemplo de preparación de una solución de recubrimiento de fosfolípidos de 3 ml. Para lograr una concentración final de fosfolípidos de 20 mg/ml, que es una concentración típica para producir microburbujas monodispersas16,17, se requieren 60 mg de fosfolípidos. La cantidad deseada de cada componente de fosfolípidos se da en la Tabla 1.

  1. Retire el polvo de fosfolípidos del congelador a -20 °C y déjelo descongelar a temperatura ambiente durante 1 h.
  2. Pesar el polvo lipídico necesario en matraces aforados de 2 ml separados.
  3. Preparar 100 ml de una mezcla de 90:10 v/v de disolvente de cloroformo: metanol en una campana extractora midiendo 90 ml de cloroformo con un cilindro de medición de vidrio de 100 ml y luego transfiriéndolo a un Erlenmeyer de vidrio de 250 ml. A continuación, mida 10 ml de metanol con el cilindro medidor de vidrio de 100 ml y viértalo en el Erlenmeyer de vidrio de 250 ml que ya contiene el cloroformo. Cierre el Erlenmeyer de vidrio con un tapón de vidrio y mezcle los dos disolventes agitando suavemente el Erlenmeyer hasta que la solución se haya aclarado.
    PRECAUCIÓN: El cloroformo y el metanol son sustancias químicas tóxicas. El cloroformo es un carcinógeno potencial y puede causar irritación respiratoria, cutánea y ocular. El metanol es altamente inflamable, tóxico si se inhala, ingiere o absorbe a través de la piel, y puede causar ceguera si se ingiere. Trabaje siempre con mezclas de cloroformo / metanol en una campana extractora bien ventilada para evitar la inhalación de humos. Use el equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes, gafas de seguridad y una bata de laboratorio. Asegúrese de que no haya llamas abiertas ni fuentes de ignición al manipular metanol. Eliminar los residuos de disolventes de acuerdo con los protocolos de residuos peligrosos de la institución.
  4. Para disolver completamente los polvos lipídicos pesados en el Paso 1.2, agregue ml de la mezcla de cloroformo / metanol a cada matraz de vidrio volumétrico de 2 ml y cierre rápidamente la tapa de vidrio para evitar la evaporación.
    NOTA: Asegúrese de que el polvo lipídico esté completamente disuelto. Si es necesario, gire suavemente el matraz para facilitar la disolución.
  5. Mezcle las soluciones lipídicas disueltas en un vial de vidrio de 30 ml vertiendo cada solución secuencialmente.
  6. Evapore el disolvente bajo un flujo constante de gas argón, girando el vial para garantizar una distribución uniforme de la película lipídica en la superficie del vidrio.
    NOTA: Las trazas finales de disolvente pueden ser difíciles de evaporar utilizando solo gas argón. Deje el vial en la campana extractora durante 2 h para permitir un secado posterior. Si no se dispone de gas argón, se puede utilizar gas nitrógeno37 o un evaporador rotativo al vacío que funcione a 6 °C31,38 (es decir, por encima de la temperatura de transición de fase de DSPC de 55 °C35) para evaporar el disolvente de cloroformo/metanol.
  7. Después de la evaporación del disolvente, someta la mezcla lipídica al vacío para eliminar cualquier residuo de disolvente orgánico restante. Selle el vial de vidrio con una capa de parafilm y perfore varios orificios con una aguja para permitir el flujo de aire durante el vacío.
    NOTA: El propósito de usar parafilm es evitar que el lípido se disperse fuera del vial de vidrio durante el proceso de liofilización.
  8. Coloque los viales en un liofilizador al vacío durante la noche para eliminar cualquier solvente orgánico residual.
  9. Continúe con el siguiente paso o guarde la película lipídica a -20 °C hasta que la necesite.
    NOTA: No se utiliza ningún paso de centrifugación en esta sección ni en ninguna otra parte del protocolo.

2. Fabricación de chips microfluídicos de enfoque de flujo

NOTA: Las microburbujas monodispersas se producen utilizando un chip microfluídico que se enfoca en el flujo, como se ilustra en la Figura 1A. En la Figura complementaria S1 se proporciona un esquema de la geometría del canal microfluídico, incluidas las dimensiones de la boquilla y la salida. Anteriormente se ha descrito un protocolo de fabricación detallado para la fotolitografía basada en SU-8 utilizado para preparar estos moldes37 y se puede encontrar como información complementaria a este protocolo. El proceso de fabricación del chip PDMS se describe en los siguientes pasos.

  1. Mezclar la base de PDMS (23 g) y el agente de curado (2,3 g) en una proporción de peso de 10:1 para obtener un total de 25,5 g de PDMS.
  2. Coloque el molde maestro en una placa de Petri y vierta la mezcla de PDMS sobre él.
  3. Desgasifique la mezcla al vacío (2 ~ 7 mbar) durante 40 minutos para eliminar las burbujas de aire atrapadas.
    NOTA: Para volúmenes más grandes, es posible que se requiera un tiempo de desgasificación más largo para garantizar la eliminación completa de las burbujas.
  4. Colocar el molde en una placa caliente a 75 °C durante 1 h.
    NOTA: Para volúmenes más grandes, es posible que se requiera un tiempo de curado más largo.
  5. Deje que el PDMS se enfríe a temperatura ambiente. Con un bisturí, corte con cuidado alrededor del PDMS curado y quítelo para liberar el chip.
  6. Corte el chip PDMS al tamaño deseado y perfore los orificios de entrada/salida con un punzón de 1 mm.
  7. Limpie el chip PDMS con cinta adhesiva para eliminar las partículas de polvo.
  8. Limpie tanto el chip PDMS como el portaobjetos de vidrio con isopropanol, seguido de agua desionizada.
  9. Unir el PDMS al portaobjetos de vidrio tratándolos en un limpiador de plasma de aire durante 1 minuto al 60% de potencia (60 W).
  10. Coloque la viruta adherida en una placa calefactora a 95 °C durante 3 minutos para mejorar la unión.
  11. Deje que el chip PDMS se enfríe a temperatura ambiente. El chip completamente fabricado se muestra en la Figura 1C, y en la Figura 1D se muestra una imagen microscópica de campo brillante de la boquilla.
  12. Coloque el chip adherido en el limpiador de plasma durante 5 minutos al 80% de potencia (80 W) para restaurar la hidrofilia superficial del canal microfluídico.
  13. Llene inmediatamente el chip con agua Milli-Q para preservar la hidrofilia.
  14. Guarde las papas fritas a temperatura ambiente en agua Milli-Q hasta su uso.

3. Preparación de la solución de recubrimiento de fosfolípidos

  1. Retire la película lipídica preparada del congelador a -20 °C y descongele a temperatura ambiente durante 1 h.
  2. Agregue 3 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) precalentada (55 °C) a la película lipídica (60 mg) para alcanzar una concentración final de lípidos de 20 mg / ml. Colocar los viales en un baño de agua a 55 °C durante 40 min, vórtice cada 15 min a velocidad media (nivel 3 de 5 en el mezclador de vórtice).
    NOTA: Este paso sirve para disolver previamente y dispersar uniformemente los componentes lipídicos en PBS antes de la sonicación en el paso 3.5. Esta temperatura es la temperatura de transición de fase de DSPC39, que promueve la solubilización parcial y reduce la agregación lipídica. Aunque la sonicación en el paso 3.6 es necesaria para lograr una claridad óptica completa, la incubación térmica preliminar facilita una sonicación más eficiente y reproducible al minimizar la formación de grandes agregados lipídicos y mejorar la homogeneidad de la dispersión.
  3. Agregue 0,43 ml de solución de Pluronic F68 a la mezcla de lípidos para alcanzar una concentración molar del 10%, a saber, DSPC: DPPE-PEG5000: Pluronic F68 = 81: 9: 10 mol%. Después, la muestra debe parecerse visualmente a la Figura 2A, que es una solución turbia.
    NOTA: Pluronic F68 es un tensioactivo utilizado para prevenir la coalescencia durante la producción de microburbujas monodispersas16,40. En ausencia de Pluronic F68, no se pueden formar microburbujas monodispersas utilizando el dispositivo microfluídico Horizon37y la formulación lipídica descrita en este protocolo16. No se utilizó propilenglicol en la formulación lipídica, ya que se ha informado que este compuesto compromete tanto la monodispersidad como la estabilidad de la suspensión de microburbujas monodispersas resultante38.
  4. Para la preparación de microburbujas monodispersas marcadas con fluorescencia, incorpore un colorante lipídico, como un colorante de carbocianina lipofílica, en la mezcla en esta etapa.
  5. Sonicar la mezcla lipídica en un baño de agua al 100% de potencia durante 20 min, manteniendo la temperatura del agua a 55 °C. La solución lipídica debe parecerse a la Figura 2B después de 20 min, que es una solución menos turbia que en el paso 3.4. Continúe la sonicación en intervalos de 10 minutos hasta que la solución sea clara, como se muestra en la Figura 2C.
    NOTA: Para la solución de la Figura 2C, se necesitaron 30 minutos de sonicación para lograr una solución clara. La caracterización de la solución lipídica se puede realizar midiendo el tamaño del liposoma utilizando, por ejemplo, un dispersor de luz dinámico.
  6. Deje que la solución lipídica se enfríe a temperatura ambiente antes de continuar con el procesamiento.

4. Preparación del vial de recolección de microburbujas

NOTA: Para garantizar el almacenamiento a largo plazo de microburbujas monodispersas, se necesita un vial médico hermético al gas como vial de recolección.

  1. Selle un vial médico de vidrio de 5 ml con un tapón de goma y llénelo con gas C4F10 . Posteriormente, engarce una tapa de aluminio alrededor del vial para garantizar la estanqueidad al gas. El vial de recolección ya está listo para su uso.

5. Preparación de la plataforma microfluídica

NOTA: Como se ilustra en la Figura 3A, el sistema comprende la plataforma microfluídica Horizon37 (en adelante, «plataforma microfluídica»), un ordenador para el control, una cámara de alta velocidad para supervisar el proceso de producción, una fuente de luz externa de diodos emisores de luz (LED) para iluminar durante la obtención de imágenes de alta velocidad y un generador de formas de onda de función para activar la obtención de imágenes de alta velocidad a intervalos específicos durante la producción. Antes de comenzar la producción de microburbujas, el dispositivo debe limpiarse para reducir la probabilidad de obstrucción de la boquilla. El procedimiento de limpieza involucra tanto el tubo como el chip microfluídico.

  1. Procedimiento de limpieza de tubos
    1. Encienda el interruptor de encendido de la plataforma microfluídica, que se encuentra en el lado derecho (Figura 3A).
      NOTA: El "interruptor de encendido" se refiere a la unidad de control de energía principal de la plataforma Horizon, que activa el microcontrolador, las bombas y los sensores internos del sistema.
    2. Coloque un vial de vidrio de 4 ml lleno de etanol al 70% en el lado izquierdo de la cámara de la bomba P de la plataforma microfluídica (Figura 3). Inicie el flujo de líquido a 100 μL / min para que el tubo de entrada de líquido se enjuague con el etanol al 70% del vial. Detenga el lavado deteniendo el flujo de líquido después de 5 minutos.
      NOTA: La bomba P se refiere a la unidad de suministro de gas controlada por presión integrada dentro del sistema microfluídico. Este paso está destinado a limpiar solo el tubo; El tubo no debe conectarse al chip microfluídico en esta etapa. Este proceso elimina el polvo soluble en etanol y los contaminantes del sistema fluídico.
    3. Reemplace el vial lleno de etanol con un vial lleno de agua Milli-Q.
    4. Enjuague el tubo con agua Milli-Q a 100 μL/min durante 5 min para eliminar cualquier etanol residual del sistema.
  2. Procedimiento de limpieza de virutas
    1. Encienda el interruptor de luz LED interno de la plataforma microfluídica.
    2. Inserte el chip PDMS en el soporte.
    3. Coloque el colector sobre el chip y asegúrelo con la rueda ajustable.
    4. Conecte el gas, el líquido y el tubo de salida al chip PDMS con unas pinzas. La configuración de la conexión se muestra en la Figura 3B. Asegúrese de que el tubo de salida conduzca a un vial para recoger la solución de desecho del proceso de limpieza.
    5. Ajuste la plataforma para colocar la boquilla del chip dentro del campo de visión del objetivo.
    6. Limpie el chip con agua Milli-Q durante 5 min con una presión de gas de 1000 mbar y un caudal de líquido de 100 μL/min. Primero inicie el flujo de gas, luego siga con el flujo de líquido.
      NOTA: Este paso es para limpiar el chip microfluídico aguas arriba de la boquilla.
    7. Detenga el flujo de líquido, seguido del flujo de gas.
    8. Vuelva a conectar la tubería de gas y salida como se muestra en (Figura 3C).
    9. Repita el procedimiento de lavado con agua Milli-Q durante otros 5 min, utilizando una presión de gas de 1000 mbar y un caudal de líquido de 50 μL/min. Primero inicie el flujo de gas, luego siga con el flujo de líquido.
      NOTA: Esta configuración limpia el chip microfluídico aguas abajo de la boquilla.
    10. Detenga el flujo de líquido, seguido del flujo de gas. El chip PDMS ya está listo para la producción de microburbujas.

6. Configuración de imágenes de alta velocidad

NOTA: Para monitorear y controlar la producción de microburbujas monodispersas, se recomienda integrar una cámara de alta velocidad con la plataforma microfluídica, ya que la microburbuja se producirá a una tasa de producción superior a 105 microburbujas / s. La cámara de alta velocidad permite medir el tamaño de las microburbujas en el chip y la tasa de producción, así como monitorear la coalescencia de las microburbujas en el chip.

  1. Monte una fuente de luz LED sobre la plataforma de montaje (Figura 3A) para iluminar el chip microfluídico durante la obtención de imágenes de alta velocidad.
  2. Acople la cámara de alta velocidad al puerto de imágenes lateral de la plataforma microfluídica.
  3. Utilice un generador de formas de onda de función externa para activar grabaciones de alta velocidad a intervalos de 10 s durante toda la producción de microburbujas. Conecte la salida de disparo TTL del generador de forma de onda a la entrada de disparo externa de la cámara de alta velocidad mediante un cable BNC estándar para garantizar una adquisición sincronizada. Este monitoreo es necesario para evaluar la forma del hilo de gas y la estabilidad del tamaño de las microburbujas durante la producción.
    NOTA: El monitoreo continuo es importante, ya que pueden producirse obstrucciones durante la producción. Además, las secuencias de imágenes de alta velocidad se utilizan para extraer distribuciones de tamaño de microburbujas en chip resueltas en el tiempo. Este intervalo de 10 s puede ajustarse en función de las necesidades del usuario.»

7. Producción y caracterización de microburbujas monodispersas

  1. Antes de comenzar la producción, configure el vial colector como se muestra en la Figura 4A. Perfore una aguja a través del tapón de goma para que sirva como aguja colectora, y otra aguja a través del tapón como aguja de ventilación, con la punta de la aguja colocada cerca del fondo del vial. Mantenga el vial colector invertido con una abrazadera durante la producción.
    NOTA: La aguja de ventilación asegura una presión constante dentro del vial durante la recolección. Dado que C4F10 es más pesado que el aire, no sale espontáneamente del vial.
  2. Cargue la solución de fosfolípidos preparada en la bomba P de la plataforma microfluídica.
  3. Mueva la parte de la boquilla del chip al campo de visión del objetivo.
    NOTA: La plataforma microfluídica incluye un módulo óptico interno con zoom y enfoque ajustables, y un acoplador externo de montura F para conectar una cámara de alta velocidad.
  4. Para iniciar la producción de microburbujas, ajuste la presión del gas a 800 mbar y el caudal de líquido a 40 μL/min.
    NOTA: La plataforma microfluídica integra dos canales de líquido controlados por flujo, 1-5 μL/min a la izquierda y 1-100 μL/min a la derecha, y un canal de gas controlado por presión. En este protocolo, se utilizaron el canal de líquido de 1-100 μL / min y el canal de gas controlado por presión.
  5. Una vez que el líquido llega a la boquilla, el hilo de gas se pellizca y libera microburbujas monodispersas a través de la salida (Figura 4A).
  6. Establezca la grabación de alta velocidad en una velocidad de fotogramas de ≥ 200.000 fps y utilice grabaciones de alta velocidad para medir el tamaño de las microburbujas producidas a través de la función imfindcircles en MATLAB.
  7. Ajuste la presión del gas y el caudal de líquido para controlar el tamaño de la microburbuja.
    NOTA: Después de ajustar el caudal y/o la presión del gas, utilice el script de MATLAB para trazar la distribución del tamaño en el chip a partir de la grabación de alta velocidad. Ajuste de la distribución de tamaño con una distribución gaussiana, se pueden derivar los σ de μ media y desviación estándar. El μ representa el tamaño en chip de las microburbujas monodispersas producidas. La coalescencia de microburbujas puede ocurrir en la etapa inicial de producción debido al agua Milli-Q residual en el tubo, que diluye la concentración de lípidos. Este problema generalmente se resuelve una vez que la solución lipídica sin diluir llega a la boquilla. La Tabla 2 resume los diámetros de microburbujas resultantes para varios caudales aplicados a una presión de gas constante de 800 mbar; Varias combinaciones de presión de gas y caudal de líquido pueden producir tamaños de microburbujas similares, aunque diferentes combinaciones de parámetros también influyen en la tasa de producción. A un caudal de gas constante, se sabe que la tasa de producción se correlaciona positivamente con los caudales de líquido41. La tasa de producción de microburbujas en este protocolo es del orden de ~ 105 microburbujas por segundo, según un análisis cuadro por cuadro de las grabaciones de alta velocidad, que es consistente con los valores informados anteriormente para geometrías similares de enfoque de flujo37.
  8. Una vez que se alcanza el tamaño de microburbuja deseado, recolecte las microburbujas producidas conectando el tubo de salida al vial colector.
  9. Durante la recolección, configure la grabación de alta velocidad para que se active cada 10 s para monitorear el proceso de producción.
    NOTA: El intervalo entre grabaciones se puede ajustar en función de los requisitos específicos.
  10. Después de recolectar suficiente suspensión de microburbujas, retire tanto la aguja de ventilación como la aguja colectora del vial colector.
  11. Detenga el flujo de líquido, seguido del flujo de gas.
  12. Almacene las microburbujas recolectadas en posición vertical a temperatura ambiente, asegurándose de que el vial se agite mecánicamente al mínimo.
    NOTA: La solución de microburbujas tendrá tres capas como se muestra en la Figura 5A: una capa de espuma, una capa de microburbujas monodispersa y un subnadante. Es mejor dejar la capa de espuma en el vial, ya que estudios anteriores informaron que las burbujas asociadas a la espuma pueden reducirse gradualmente a un tamaño monodisperso16,38. Las microburbujas producidas con este protocolo no han sido sometidas a una evaluación de seguridad reglamentaria. Sin embargo, los lípidos constituyentes (DSPC, DPPE-PEG5000) y el surfactante (Pluronic F68) se utilizan comúnmente en formulaciones inyectables aprobadas por la FDA y se consideran biocompatibles42,43. Se requiere una evaluación preclínica adicional para establecer la seguridad para uso médico.
  13. 2 h después de la producción (es decir, 2 h después de la producción de las microburbujas monodispersas), caracterizar el tamaño final y la concentración de las microburbujas utilizando una máquina de caracterización de partículas.
    NOTA: Las microburbujas monodispersas producidas por el método de enfoque de flujo requieren aproximadamente 90 min para estabilizarse a su tamaño final44. Por lo tanto, se recomienda dejar al menos 2 h de estabilización antes de usar las microburbujas.
  14. Conecte una aguja de 19 G a una jeringa de ml, en lo sucesivo denominada «jeringa de extracción».
  15. Inserte una aguja separada de 19 G en el vial de microburbujas como aguja de ventilación. Asegúrese de que la punta de la aguja permanezca cerca de la parte superior del vial para permitir la entrada de aire y mantener la presión interna durante la extracción de microburbujas.
  16. Agite suavemente el vial para homogeneizar la suspensión. La suspensión se separará en tres capas: una capa superior de espuma, una capa intermedia que contiene microburbujas monodispersas y una capa acuosa inferior.
  17. Inserte rápidamente la jeringa de extracción y coloque con cuidado la punta de la aguja en el centro de la capa de microburbujas monodispersas, evitando la espuma y la capa inferior de subnadante acuoso. Retire el volumen deseado de suspensión de microburbujas y retire la jeringa de extracción del vial. Cuando se complete la extracción de microburbujas, retire la aguja de ventilación.

8. Procedimiento de limpieza y apagado

NOTA: Después de la producción de microburbujas, la plataforma microfluídica y el chip deben limpiarse a fondo para garantizar un funcionamiento adecuado y permitir la reutilización del chip. Los siguientes pasos describen el proceso de limpieza.

  1. Para el chip, proceda de la siguiente manera:
    1. Reemplace el vial de lípidos con un vial de agua Milli-Q.
    2. Enjuague el chip microfluídico con una presión de gas de 800 mbar y un caudal de líquido de 40 μL/min durante 5 min.
    3. Detenga primero el flujo de líquido, seguido de detener el flujo de gas.
    4. Desconecte solo el tubo de entrada de gas del chip microfluídico.
    5. Llene el chip microfluídico con agua Milli-Q para mantener la hidrofilia de las superficies internas.
    6. Detenga el flujo de líquido y desconecte todos los tubos restantes del chip.
    7. Guarde el chip en agua Milli-Q hasta que lo necesite para uso futuro.
  2. Para el sistema microfluídico, proceda de la siguiente manera:
    1. Reemplace el vial de agua Milli-Q con un vial de etanol al 70% en la plataforma microfluídica.
    2. Enjuague el tubo de entrada de líquido con etanol al 70% a un caudal de 100 μL/min durante 5 min para eliminar cualquier residuo de lípidos.
    3. Reemplace el vial de etanol con un vial de agua Milli-Q en P-Pump1.
    4. Enjuague el tubo con agua Milli-Q a 100 μL/min durante 5 min para eliminar cualquier etanol residual del sistema. El sistema ahora está limpio.
    5. Apague la plataforma microfluídica y el sistema de cámaras de alta velocidad.

9. Pasos para solucionar problemas

  1. Bloqueo de la boquilla
    NOTA: Dado el pequeño tamaño de la boquilla (5 μm), pueden producirse bloqueos durante el proceso de producción. Para eliminar el bloqueo, siga los pasos a continuación.
    1. Detenga inmediatamente el flujo de líquido, seguido del flujo de gas.
    2. Vuelva a conectar la tubería de acuerdo con la configuración que se muestra en la Figura 3B.
    3. Reemplace el vial lleno de fosfolípidos con un vial lleno de agua Milli-Q en P-Pump1.
    4. Aplique una presión de gas de 1000 mbar y ajuste el caudal de líquido a 100 μL/min durante 5 min para enjuagar la boquilla.
      NOTA: En la mayoría de los casos, las obstrucciones se eliminan después de un enjuague de 5 minutos. Sin embargo, si el bloqueo persiste, puede ser necesario reemplazar el chip PDMS por uno nuevo.
    5. Una vez que se elimine el bloqueo, vuelva a conectar el tubo como se indica en la Figura 3C.
    6. Enjuague la viruta nuevamente con agua Milli-Q durante 5 minutos, utilizando una presión de gas de 1000 mbar y un caudal de líquido de 50 μL / min para garantizar una holgura completa.
    7. Reemplace el vial lleno de agua Milli-Q con el vial lleno de fosfolípidos en P-Pump1 y reanude la producción de microburbujas.
      NOTA: Si los bloqueos persisten durante la producción, esto puede indicar una limpieza insuficiente del tubo o del chip microfluídico. En este caso, desconecte el tubo del chip y siga el procedimiento de limpieza descrito en el paso 5. Si continúan ocurriendo bloqueos después de limpiar a fondo todo el sistema, podría sugerir una falla del filtro interno en la plataforma microfluídica. Reemplazar el filtro por uno nuevo puede resolver el problema.
  2. Reutilice el chip microfluídico si lo desea.
    NOTA: Si el chip no se almacena correctamente, puede perder hidrofilia. Si esto ocurre, el pellizco de la rosca de gas puede parecerse al patrón que se muestra en la Figura 5E. En tales casos, se recomienda cambiar a un nuevo chip que sea hidrófilo para garantizar una producción de microburbujas consistente y confiable.

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Resultados

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En este protocolo, presentamos un método para producir microburbujas estables y monodispersas a temperatura ambiente utilizando un chip microfluídico que se centra en el flujo. El chip PDMS se fabrica mediante fundición a partir de un molde maestro, como se muestra en la Figura 1. Para unir el chip PDMS a un portaobjetos de vidrio, se emplea un tratamiento con plasma. El tratamiento con plasma es crucial ya que altera la superficie del PDMS de hidrofóbica a hidrófila. Esta hidrofilia es esen...

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Discusión

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Este protocolo describe en detalle cómo producir y almacenar microburbujas monodispersas estables a temperatura ambiente utilizando un chip microfluídico de enfoque de flujo. La microburbuja monodispersa se puede utilizar para imágenes de ultrasonido mejoradas con contraste18, detección de presión no invasiva19 y administración de fármacos mediada por microburbujas22, tanto in vitro como in vivo.

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue financiado en parte por el Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (Acuerdo de subvención 805308) y en parte por el TTW de Ciencias Aplicadas y de la Ingeniería (proyecto VIDI 17543), parte del NWO, ambos otorgados a K.K. La Plataforma Microfluídica Horizon se desarrolló con fondos de subvenciones de EPSRC (subvenciones Nos. EP/I000623 y EP/K023845). Los autores agradecen al Consorcio de Microburbujas (http://www.microbubbles.leeds.ac.uk/) de la Universidad de Leeds por sus útiles discusiones, así como a Stuart Weston y Andrew Price por su ayuda en la conceptualización del instrumento y la producción de piezas para la Plataforma Microfluídica Horizon. El molde maestro para fabricar los chips PDMS fue amablemente proporcionado por la Universidad de Leeds. Los autores agradecen a Robert Beurskens del Departamento de Cardiología de Ingeniería Biomédica y Geert Springeling del Departamento de Instrumentación Médica Experimental, ambos del Erasmus MC de los Países Bajos, por la asistencia técnica durante los experimentos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Punzón de biopsia de 1 mmKai Medical143831
1,1'-dioctadecilo-3,3,3',3'-tetrametilindodicarbocinina (DiD)Thermo Fisher ScienticD307un colorante de carbocianina lipofílico
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[carbonil-metoxipolietilenglicol] (DPPE-PEG5000)LipoideaCAS-No. 384835-61-4
1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC)LipoideaCAS-No. 816-94-4
Cilindro medidor de vidrio de 100 mlBLAUBRAND
Matraces de vidrio aforados de 2 mlBLAUBRAND
Vaso Erlenmeyer de 250 mlBLAUBRAND
Vial de vidrio de 30 ml DWK Ciencias de la vidaSCERC40752700D0C2
70% de etanol
75 grados Placa C
Cinta adhesiva
Tapa de aluminioSigma-aldrich27016
Gas argón  Linde Gas Benelux
C4F10 gasProductos químicos F2
CloroformoMerck KGaA67-66-3
Clínicamente disponible  agente de contraste de ultrasonido (es decir, microburbuja)Bracco,
Plan-LesOuates, Suiza		SonoVueFigura 6A.
Aguja de recogida y ventilación 19G100 Sterican4657799
Contador de rejas Multisizer 3Beckman CoulterMáquina de caracterización de partículas
Agente de contraste de ultrasonido hecho a medida (es decir, microburbuja monodispersa)NAF1-10PFFigura 6A. Producido como lo describen por: Wang, Y. et al. Influencia de Pluronic F68 en la estabilidad del tamaño y el comportamiento acústico de microburbujas monodispersas recubiertas de fosfolípidos producidas a temperatura ambiente. ACS Appl. Mater. Interfaces 2025, 17, 8976−8986. (2025).
Agente de contraste de ultrasonido hecho a medida (es decir, microburbuja monodispersa)NAF2-10 PFFigura 6A. Producido como lo describen por: Wang, Y. et al. Influencia de Pluronic F68 en la estabilidad del tamaño y el comportamiento acústico de microburbujas monodispersas recubiertas de fosfolípidos producidas a temperatura ambiente. ACS Appl. Mater. Interfaces 2025, 17, 8976−8986. (2025).
Agua demi
Luz LED externaGSVITECGS02370
LiofilizadorMertin Christ GmbHAlfa 1– 2 LD plus
Generador de formas de onda de funcionesAgilent33220A
Vial de vidrio hermético al gasSigma-aldrichZ113964-288EA
Portaobjetos de cristalVWR631-1552
Cámara de alta velocidadFotronNova S16
Plataforma microfluídica HorizonUniversidad de Leeds, InglaterraLa plataforma está disponible comercialmente y se describe en detalle en: Abou-Saleh, R. H. et al. Horizon: Plataforma microfluídica para la producción de microburbujas y nanoburbujas terapéuticas. Revisión de instrumentos científicos. 92 (7), 074105 (2021).
MatlabLos MathWorksReferencia R2023a
MetanolMerck KGaA67-56-1
Agua Milli-Q
Gel PDMSSYLGARDSYLGARD®   184
Solución salina tamponada con fosfato (PBS 1x) Gibco10010023
Limpiador de plasmaHenniker CientíficoHPT-100
Plurónico F68Thermo Fisher Scientific24040032
Tapón de gomaSigmaZ166065-100EA
TuberíaMasterflexMFLX06407-41PTFE, 1/32" ID x 1/16 " OD; 25 pies
Pinzas
VórticeSigma-aldrichZ654779
Sonicador de baño de aguaEMAGEMMI 30HC

Referencias

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