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Artículo de método

Modelo murino de leucemia Recaída a quimioterapia de inducción para la leucemia linfoblástica aguda

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DOI:

10.3791/68797

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17 de octubre de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Leukemia Biology Laboratory, Boldrini Children's Center, 2Graduate Program in Genetics and Molecular Biology, University of Campinas, 3Boldrini Children's Center, 4Department of Translational Medicine, Faculty of Medical Sciences, University of Campinas

En este artículo

Resumen

El protocolo tiene como objetivo describir un modelo de ratón para generar recaídas de leucemia linfoblástica aguda, basado en la dinámica de la respuesta a la quimioterapia de inducción.

Resumen

La leucemia linfoblástica aguda (LLA) es una neoplasia de células precursoras linfoides inmaduras y una de las neoplasias malignas infantiles más comunes. Aunque las tasas de curación en la LLA pediátrica se acercan al 90%, la recaída y la resistencia a los medicamentos siguen siendo desafíos. En este contexto, el estudio de la biología del cáncer in vivo es esencial, y los xenoinjertos derivados de pacientes (PDX) que utilizan modelos murinos se utilizan ampliamente para este propósito. Sin embargo, los PDX de muestras en recaída, o en comparación con los diagnósticos, no evalúan completamente los mecanismos detrás del inicio y la progresión de la recaída. Este protocolo se basa en la generación de recaídas de B-ALL PDX en ratones, lo que permite la recolección de células leucémicas durante todo el proceso de adquisición de resistencia a los medicamentos. Los animales injertados con células PDX de la ALL se tratan con una combinación de cuatro fármacos que se usan comúnmente en el tratamiento de la LLA, que representan distintos mecanismos de acción: dexametasona, vincristina, L-asparaginasa y daunorrubicina. Después de una fase de inducción de remisión de 4 semanas, los animales son monitoreados para detectar recaídas durante un período de descanso. El ciclo de tratamiento y recaída se repite hasta que el tiempo de recaída se acorta, sirviendo como sustituto para el aumento de la resistencia a los medicamentos in vivo. Para explorar los mecanismos subyacentes a la recaída y la resistencia, las células leucémicas se recolectan antes y después de cada ciclo de tratamiento para su análisis fenotípico y genético. Para validar el modelo, se analizaron diferentes muestras de LLA pediátrica, incluidas las que respondieron bien y mal, según la presencia de blastocitos en sangre periférica después de 7 días de tratamiento con corticosteroides y la enfermedad residual mínima (ERM) en los días 15, 33 y 78/96. Los resultados observados en ratones fueron consistentes con los datos de los pacientes, lo que confirma la precisión del modelo para imitar la respuesta clínica a la quimioterapia. Este enfoque permite el estudio dinámico de la recaída y la resistencia a los fármacos en la LLA-B, apoyando las investigaciones mecanicistas y el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.

Introducción

La leucemia linfoblástica aguda (LLA) es el cáncer más prevalente en los niños. A pesar de las altas tasas de curación alcanzadas en las últimas décadas con una supervivencia global a 5 años que alcanza el 90% en los países de altos ingresos1 y de los grandes esfuerzos en la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas, en los países desarrollados, el 15%-20% de los pacientes recaen de la enfermedad, a los que la tasa de supervivencia varía entre el 30%-60% dependiendo de si la primera recaída ocurre temprano (menos de 18 meses) o más tarde (36 meses) después del diagnóstico2, 3. En vista de esto, la LLA refractaria y la recaída siguen siendo desafíos que deben superarse. En términos de diagnóstico, la LLA resistente al tratamiento se distingue de la recaída por la sensibilidad precaria a la quimioterapia, mientras que la LLA recidivante se caracteriza por la recidiva de la enfermedad después de un período de remisión. Al igual que con otros cánceres, la LLA se caracteriza por anomalías genéticas, que incluyen aneuploidías, reordenamientos cromosómicos y varias mutaciones genéticas que se asocian con diferentes respuestas terapéuticas y riesgo de recaída4. Dado que las recaídas de la LLA ocurren con mayor frecuencia en pacientes de riesgo alto, que ya han recibido quimioterapia de máxima intensidad, es poco probable que sean suficientes ajustes adicionales en las dosis o combinaciones de medicamentos. En cambio, los esfuerzos deben dirigirse a identificar los mecanismos subyacentes a la resistencia a los medicamentos y la recaída.

A la luz de esto, los investigadores han intentado comprender cómo la presión de selección ejercida por la quimioterapia contribuye a la aparición de células resistentes. La mayoría de la literatura existente atribuye la recaída a la propagación de un subclon maligno resistente que ya estaba presente en el momento del diagnóstico5. Sin embargo, un estudio reciente sugiere la existencia de mecanismos alternativos, como las modificaciones epigenéticas que regulan los programas transcripcionales, que también pueden contribuir a la recaída6.

Se ha dedicado un esfuerzo sustancial a crear modelos in vivo precisos para estudiar las recaídas de la LLA. Los ratones inmunodeficientes se han utilizado con éxito para el injerto de LLA, preservando las características originales de la enfermedad 7,8, lo que lleva al desarrollo de xenoinjertos derivados del paciente (PDX). Este modelo permite el injerto y la proliferación de células tumorales / leucémicas originales en un microambiente compatible. Una de sus principales ventajas es la capacidad de evaluar la respuesta de las células de LLA trasplantadas a la quimioterapia9.

Los modelos PDX también se han empleado para imitar y estudiar las recaídas de la LLA. Por ejemplo, un protocolo desarrollado por Samuels et al.10 utilizó ratones diabéticos/inmunodeficientes combinados graves (NOD/SCID) no obesos trasplantados con células leucémicas de pacientes para investigar los mecanismos de resistencia a un régimen de quimioterapia similar a la inducción. Los autores describieron el tratamiento con vincristina, dexametasona, L-asparaginasa y daunorrubicina (VXLD) y proporcionaron ejemplos del número de ciclos de tratamiento y el momento de la recaída. Sin embargo, el modelo se centró en analizar las células inmediatamente después del tratamiento, aquellas que sobrevivieron a la terapia inicial, probablemente representando una enfermedad residual mínima (ERM) en lugar de una recaída.

En un estudio más reciente, se evaluó si el tratamiento a corto plazo de la NOD trasplantada de LLA. Los ratones inmunodeficientes Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NOD scid gamma o NSG) podrían predecir la recaída en los pacientes correspondientes11. Las muestras de LLA de riesgo intermedio, tanto de pacientes con recaída como de pacientes sin recaída, se trasplantaron a ratones y se trataron con un régimen similar a la inducción que consistía en vincristina, dexametasona y L-asparaginasa (VXL). Se midió y comparó el tiempo hasta el injerto y las recaídas posteriores al tratamiento. Los resultados sugirieron que este modelo PDX podría servir como una herramienta pronóstica para predecir los resultados de los pacientes. Este hallazgo respalda la utilidad de los modelos de ratones PDX en el estudio de la biología de las recaídas de la LLA. Por ejemplo, las células recurrentes podrían haberse examinado en diferentes momentos para descubrir los mecanismos subyacentes a la recaída.

En este manuscrito, presentamos mejoras en el modelo de ratones PDX para estudiar la recaída de B-ALL. Nuestro objetivo es estudiar la recurrencia de la enfermedad y las características de las células recidivantes después de su conformación mediante quimioterapia de inducción. Se estandarizó un régimen similar a la inducción de cuatro fármacos: vincristina, dexametasona, L-asparaginasa y daunorrubicina, utilizando la cepa de ratones NSG. Se sabe que esta cepa tiene limitaciones para soportar ciclos repetidos de quimioterapia debido a la mutaciónPrkdc scid y una mayor sensibilidad al estrés genotóxico12. Por lo tanto, se controló el peso corporal de los animales como marcador de toxicidad del tratamiento. El modelo de recaída de B-ALL se puede dividir en tres pasos principales: (1) trasplante de células de LLA en ratones, con el objetivo de un umbral de injerto de 0,2-1% de células CD45⁺ humanas en sangre periférica; (2) 4 semanas de tratamiento de quimioterapia, seguidas de un período de descanso hasta la primera recaída (R1); y (3) tras la detección de R1, ciclos de tratamiento repetidos de tipo inducción de 1 semana. Las recaídas posteriores (R2, R3... RN) y se registra el intervalo entre el tratamiento y la recaída (Δt). Un acortamiento progresivo de Δt se interpreta como una indicación de resistencia adquirida a los medicamentos. Como parte de investigaciones más profundas sobre los mecanismos de recaída, las células B-ALL se pueden recolectar antes y después de las diferentes etapas del protocolo. Es importante enfatizar que, dependiendo del tiempo entre la aparición de la recaída y la recuperación celular, los mecanismos inherentes a este fenómeno pueden no conservarse. En vista de esto, es extremadamente importante que las células de recaída se recolecten rápidamente después de la confirmación de la recaída. Las células recolectadas se pueden utilizar para futuros análisis fenotípicos y genéticos, incluidas evaluaciones de la dinámica del ciclo celular, la migración celular, la frecuencia celular iniciadora de la leucemia, las alteraciones cromosómicas y las modificaciones epigenéticas, entre otros.

Para los fines de este artículo, nos centraremos en describir el modelo de ratón de recaída. Se proporcionará información detallada para las tres fases experimentales: trasplante, tratamiento hasta la primera recaída (R1) y tratamiento cíclico hasta múltiples recaídas (R2, R3...). Esperamos que este modelo permita a los investigadores generar células B-ALL resistentes a la quimioterapia a partir de diversos subtipos, lo que permitirá una investigación más profunda de los cambios celulares y moleculares asociados con la recaída. En última instancia, esto puede contribuir a una mejor comprensión de los mecanismos de resistencia y facilitar el desarrollo de terapias más efectivas y personalizadas.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las regulaciones y directrices éticas de la Comisión de Ética no Uso de Animales del Centro Infantil Boldrini (CEUA/Boldrini 0047-2024). Las muestras de leucemia utilizadas en este estudio se obtuvieron de viales bioalmacenados de pacientes tratados en el Centro Infantil Boldrini, quienes permitieron el uso de sus células a través de un consentimiento informado. El proyecto fue aprobado por el Comité de Ética Institucional (CAAE 34601120.7.0000.5376).

1. Trasplante de células leucémicas y monitoreo del injerto

  1. Preparación de muestras de leucemia para trasplante de ratón
    1. Descongele muestras previamente criopreservadas de células de ALL tomadas del aspirado de médula ósea del paciente. Utilice un baño de agua a 37 ° C. Descongele las muestras moviendo el criotubo con un movimiento circular.
    2. Transfiera la muestra descongelada a un tubo de centrífuga de 15 ml. Agregue 14 ml de 1x PBS estéril a la muestra para lavar las células y eliminar la solución de criopreservación. Centrifugar el tubo a 300 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante.
  2. Preparación de la solución de trasplante
    1. Vuelva a suspender las células descongeladas en PBS estéril 1x. Utilice 5-10 x 106 células viables en un volumen de 100 μL de PBS para cada animal a trasplantar. Mantenga la solución de trasplante en hielo hasta el trasplante.
      NOTA: Las células se contaron siguiendo el método semiautomático13.
  3. Trasplante de ratones
    1. Seleccione NOD masculino o femenino de 2 meses. Ratones Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) para trasplante de leucemia.
      NOTA: Para mantener un diseño experimental homogéneo libre de interferencia sexual animal, las muestras de LLA se trasplantaron a ambos sexos de ratón, asegurando que todas las leucemias de respuesta buena y mala estuvieran representadas por igual en ambos sexos. Como resultado, encontramos que los ratones hembra se injertan antes que los ratones machos. Teniendo en cuenta que, para evitar posibles interferencias del sexo del ratón en futuros análisis (como la cinética del injerto), sugerimos usar solo un sexo de ratón cuando se trabaja con la misma muestra de leucemia. No se utilizaron otros parámetros para elegir preferentemente un sexo sobre el otro.
    2. Coloque un ratón a la vez en una trampa para ratones segura y aprobada para garantizar la contención adecuada del animal. Asegúrese de que la cola del animal esté fuera de la trampa y sea de fácil acceso para el trasplante.
      NOTA: Las células leucémicas se trasplantan a ratones mediante inyección intravenosa (i.v.). Los protocolos establecidos utilizan las venas laterales de la cola para este propósito11.
    3. Use luz infrarroja para asegurar una expansión adecuada de las venas. Inyecte 100 μL de la solución de trasplante con una aguja de inyección estéril, afilada y de un solo uso. Mantenga a los ratones trasplantados en una instalación específica libre de patógenos. Déjelos reposar durante 15 días.
      1. Para usar la luz infrarroja, mantenga al animal ya inmovilizado fuera de la jaula y a 30 cm de distancia de la luz. Dependiendo de la potencia de luz potencial, ajuste el tiempo de exposición. Cuando se utiliza una luz de potencia media, un período de 5 minutos es suficiente para asegurar la expansión de las venas. Dejar la cola expuesta durante un período más largo puede causar quemaduras y estrés al animal.
      2. Para la inyección, use una jeringa de insulina con una aguja adjunta, con un volumen de 1 ml y un tamaño de aguja de 12,7 mm x 0,33 mm. La especificación de la aguja utilizada se puede encontrar en la Tabla de Materiales. Mantenga a los ratones en un régimen de ciclo de luz / oscuridad de 12 h / 12 h. Además, aloje a los animales utilizados en este estudio en una jaula de policarbonato ámbar translúcido esterilizable en autoclave con enriquecimiento ambiental para crear nidos.
  4. Extracción de sangre periférica
    1. Recoger una muestra de sangre periférica de 50 μL de cada ratón 2 semanas después de la inoculación y cada semana a partir de entonces.
    2. Sujete manualmente al animal con la mano izquierda, asegurándose de que su cabeza esté bien sujeta. Con la mano derecha, use una lanceta estéril, afilada y desechable para perforar la vena facial del plexo submandibular del animal.
      NOTA: Este es un procedimiento potencialmente dañino para los ratones y debe hacerse con cuidado.
      1. Asegúrese de que el animal pueda respirar fácilmente durante la sujeción. Esté atento a los cambios en la frecuencia respiratoria (dificultad para respirar) y los cambios en el color de la boca (no debe volverse púrpura o azul oscuro). Si el plexo submandibular no se perfora correctamente, puede producirse sangrado en el oído debido a la punción del canal auditivo. Para guiar a los futuros experimentadores, la Figura complementaria 1 está disponible para garantizar la ubicación adecuada del plexo.
        NOTA: Como alternativa, las hemorragias de las venas de la cola también se pueden usar para recolectar muestras de sangre.
    3. Después de la recolección, no deje al animal desatendido. Debe estar activo e ileso. Si el ratón muestra signos de caída (cabeza o cuerpo) e inactividad, debe ser sacrificado. No exceda los 50 μL de volumen, ya que mayores cantidades de sangre pueden provocar la muerte del animal.
    4. Mantenga la muestra de sangre recolectada en un tubo de centrífuga de 1,5 ml que contenga 8 μl de EDTA 50 mM para evitar la coagulación de la muestra.
      NOTA: Aquí, utilizamos una solución de EDTA previamente preparada como anticoagulante. Si lo prefiere, también se pueden usar tubos de EDTA de bajo volumen disponibles comercialmente para la extracción de sangre en este paso. Las muestras de sangre deben procesarse el mismo día.
  5. Preparación de muestras de sangre periférica para su procesamiento
    1. Homogeneizar la sangre con EDTA. Transfiera 50 μL de la mezcla a un tubo de citometría de flujo.
    2. Preparar una mezcla de anticuerpos para añadir a cada muestra que consista en anticuerpos anti-CD45 de ratón (mCD45), anticuerpo anti-CD45 humano (hCD45), anticuerpo anti-CD19 humano (hCD19) y 1x PBS estéril como diluyente.
  6. Procesamiento de muestras de sangre
    1. Agregue 10 μL de la mezcla de anticuerpos a cada muestra de sangre. Homogeneizar dando golpecitos suaves con el dedo índice. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente, protegido de la luz.
      NOTA: Seleccione los anticuerpos apropiados descritos anteriormente, considerando los canales disponibles del citómetro. Para determinar la cantidad de anticuerpo utilizado por muestra, considere realizar una curva de titulación para cada anticuerpo. Los anticuerpos utilizados en nuestro estudio, los fluorocromos y el volumen elegido para las muestras se enumeran en la Tabla complementaria 1. En la Tabla de materiales se enumera una descripción completa de los números de catálogo de anticuerpos y los nombres de los clones.
    2. Agregue 1 ml de solución comercial de lisis de glóbulos rojos (RBC) 1x a cada muestra. Homogeneizar vigorosamente con el dedo índice. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente, protegido de la luz.
      NOTA: La solución de lisis utilizada en este paso es una solución de lisis de glóbulos rojos 10x disponible comercialmente. Si se utiliza un reactivo diferente, se debe ajustar el volumen de trabajo 1x para la lisis.
    3. Agregue 2 ml de 1x PBS estéril a cada muestra para el primer paso de lavado. Centrifugar muestras a 200 x g (en un rotor oscilante) durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche suavemente el sobrenadante invirtiendo y seque cualquier líquido restante en la parte superior del tubo secando suavemente con toallas de papel.
      NOTA: En los pasos de lavado, las células leucémicas se peletizarán en la parte inferior del tubo del citómetro y se desechará el líquido restante. Es imperativo tener cuidado al manipular las muestras, ya que en ciertos casos, el gránulo puede no ser discernible. Para garantizar la integridad del gránulo, evite agitar la muestra, ya que esto puede provocar su pérdida.
    4. Repita el paso 1.6.3. Vuelva a suspender las células leucémicas con 200 μL de PBS 1x estéril golpeando suavemente el tubo de citometría con el dedo índice. Las muestras están listas para ser analizadas por citometría de flujo. El control del injerto debe realizarse el mismo día de la extracción de sangre.
  7. Monitorización del injerto mediante citometría de flujo
    1. Emplear metodologías estándar de citometría de flujo 9,14 para determinar el porcentaje de células CD45+ humanas en la sangre periférica en relación con las células CD45+ de ratones (% hCD45+).
    2. Recopilar datos generados por citometría de flujo para su posterior análisis del porcentaje de hCD45+ sobre el total de células CD45 (hCD45+ más mCD45+) utilizando un software de análisis de citometría de flujo.
      NOTA: Para garantizar un seguimiento adecuado del injerto, los siguientes pasos de análisis deben realizarse el mismo día. Esta secuencia diaria es particularmente importante cuando se considera el inicio del programa de tratamiento futuro, que sugerimos comenzar el lunes. En la imposibilidad de comenzar el lunes, el tratamiento puede comenzar cualquier día de la semana, dependiendo de la consecución del hCD45+% (0,2%-1%) en sangre periférica.
  8. Preparación del entorno para el análisis de datos de citometría de flujo
    1. Inicie el software de análisis de citometría de flujo. Importe los datos recopilados y espere su reconocimiento por parte de la herramienta.
    2. Abra los datos de la muestra inicial para crear la puerta etiquetada Linfocitos. Verifique la configuración del eje: seleccione FSC-A para el eje X y SSC-A para el eje Y. En el panel superior de creación de puertas, seleccione la herramienta poly-liner y delinee la población de celdas principal.
      NOTA: Los linfocitos suelen aparecer entre 50,000-100,000 en el eje X y 0-50,000 en el eje Y. Los valores pueden variar dependiendo de las características de cada leucemia.
    3. Haga doble clic en Población cerrada para crear una nueva puerta. Para excluir dobletes de celda, establezca FSC-A en el eje X y FSC-H en el eje Y. Utilice la herramienta poly-liner para aislar la población de células primarias. Dibuje la puerta cerca de la población, excluyendo los eventos distantes a lo largo del eje X.
      NOTA: Este paso distingue los eventos de celda individuales.
  9. Creación del panel de citometría para distinguir las poblaciones celulares
    1. Haga doble clic en la población seleccionada para diferenciar las células CD45 humanas de las de ratón. Establezca el eje X en el fluoróforo mCD45 y el eje Y en SSC-A. Con la herramienta de forma, dibuje un cuadrado alrededor de la población mCD45 negativa.
    2. Haga doble clic en la población resultante para distinguir las celdas hCD19+ y/o hCD45+. Establezca el eje X en el fluoróforo hCD19 y el eje Y en hCD45. En el panel de creación de puertas, seleccione Líneas perpendiculares para separar las distintas poblaciones.
      NOTA: Como alternativa, el investigador puede usar la puerta o la posibilidad de discriminar células hCD45 y mCD45. Esta posibilidad considera la suma de eventos como 100%, creando una estrategia más precisa para identificar poblaciones.
  10. Aplicación de estadísticas al panel creado
    1. Calcule el porcentaje de cada población de células aisladas en relación con todos los eventos adquiridos. En la ventana principal del software, haga clic con el botón derecho en el icono Subgraph derivado del gráfico principal de cada muestra y seleccione Crear estadísticas. En la ventana abierta, haga clic en Frecuencia de y seleccione Celdas individuales. Realice este paso individualmente para cada subgrafo.
    2. Seleccione todas las modificaciones realizadas para aplicar la estrategia de compuerta y las estadísticas asociadas a todas las muestras. Luego, con el botón izquierdo del mouse, arrastre las modificaciones seleccionadas a la opción Todas las muestras en la ventana principal del software.
    3. Haga clic en Editor de tablas en la ventana principal para generar una tabla con todas las frecuencias calculadas. En la ventana emergente, elija el formato de archivo .xls, designe la carpeta de destino y haga clic en Crear tabla.
      NOTA: Todos los pasos realizados con el software de análisis de citometría de flujo se pueden visualizar en la Figura complementaria 2. La tabla final generada por este paso contiene el porcentaje de hCD45+ necesario para generar gráficos para analizar la progresión del injerto a lo largo del tiempo.
  11. Trazado de la progresión del injerto
    1. Inicie un software de análisis y trazado de gráficos. Seleccione el formato de tabla XY. En la ventana principal, elija Introducir o Importar datos en una nueva tabla, establezca X en Números e Y en Introducir valores replicados en subcolumnas en paralelo.
    2. En la tabla abierta, organice los títulos de las columnas: ingrese Días de injerto para la columna X y % hCD45+ en PB para el primer grupo de subcolumnas Y. Complete la columna X con los días posteriores a la inyección correspondientes a los días de extracción de sangre para el monitoreo del injerto. Introduzca manualmente el porcentaje semanal recopilado de datos de hCD45+ para cada ratón en las subcolumnas Y.
    3. En el menú de software, en el subconjunto Familia, seleccione Datos 1. En la ventana emergente, elija la segunda opción de gráfico llamada Puntos y línea de conexión con barras de error, y habilite el trazado de barras de media y error.
    4. Ajuste los ejes del gráfico a los rangos deseados. Haga clic en Exportar en la esquina superior derecha del menú para descargar el gráfico final.
      NOTA: Todos los datos recopilados durante los experimentos con cualquier ALL individual deben trazarse en el mismo gráfico para facilitar los análisis a lo largo del tiempo desde el inicio del experimento. Un ejemplo descriptivo de trazado de gráficos se puede encontrar en la Figura complementaria 3.

2. Tratamiento de ratones

  1. Preparación de soluciones de trabajo farmacológico
    1. Prepare una solución de trabajo de vincristina a una concentración de 1 mg / ml. Prepare una solución de trabajo con dexametasona a 4 mg/ml. Prepare la solución de trabajo de L-asparaginasa a 2,000 UI / ml. Prepare la solución de trabajo de daunorrubicina a 2 mg/ml.
      NOTA: Los fármacos utilizados en este protocolo son equivalentes a los empleados en el tratamiento clínico de los pacientes15. El vehículo de solución de trabajo de dexametasona está compuesto por creatinina, citrato de sodio dihidratado, hidróxido de sodio, bisulfito de sodio, metilparabeno, propilparabeno y agua para inyección. El vehículo de solución de trabajo de vincristina está compuesto de manitol, ácido sulfúrico, hidróxido de sodio y agua para inyección. La L-asparaginasa y la daunorrubicina están disponibles con frecuencia en forma liofilizada. En tales casos, el vehículo recomendado para la reconstitución es agua estéril para inyecciones, que debe usarse para lograr la concentración correcta. Para evitar la pérdida de actividad del fármaco debido a ciclos repetidos de descongelación, los medicamentos deben dividirse en alícuotas de trabajo utilizadas no más de 3 veces.
  2. Pesaje de animales cuando se detecta leucemia
    1. Iniciar el tratamiento en el punto en el que el porcentaje de células hCD45+ en la sangre periférica de ratones alcanza un rango medio entre 0,2% y 1%. Al alcanzarlo, divida los ratones trasplantados en dos grupos distintos: uno para recibir tratamiento y otro para servir como control.
    2. Al alcanzar el umbral establecido, persistir en el seguimiento semanal de la progresión de la leucemia. Recopile continuamente datos de hCD45% para monitorear la capacidad de respuesta al tratamiento, la aparición de recaídas y la detección de resistencia a los medicamentos.
    3. Pesar los animales a tratar. Utilice la media aritmética de los pesos para determinar la dosis de cada fármaco que se administrará al grupo. Pese los animales del grupo de control para comparar el aumento / pérdida de peso entre los grupos.
      1. Use las siguientes dosis de medicamentos: vincristina, 0,15 mg / kg; dexametasona, 5 mg/kg; L-asparaginasa, 1.000 UI/kg; y daunorrubicina, 1,2 mg/kg. Pese a todos los animales al menos 3 veces por semana: los lunes, miércoles y viernes. Utilice las pesas para ajustar las dosis de tratamiento de los medicamentos y para controlar el nivel de toxicidad del tratamiento.
  3. Preparación de las soluciones de administración de medicamentos a partir de las alícuotas de la solución de trabajo
    NOTA: Las soluciones de administración de medicamentos consisten en 1x PBS estéril como diluyente y el volumen correcto (según el peso del animal) de soluciones farmacológicas de trabajo (el agua estéril se usa exclusivamente para reconstitución y no para inyección) administradas todos los días de la semana. Los medicamentos que se administran por vía intraperitoneal se pueden unir en la misma solución; sin embargo, si se administra algún medicamento por vía intravenosa, debe colocarse en una solución individual. El volumen de la solución de administración del fármaco que se administrará a cada animal es de 100 μL.
    NOTA: En el paso descrito anteriormente se utilizó una jeringa de insulina estéril con aguja adjunta (1 ml, con dimensiones de aguja de 12,7 mm X 0,33 mm). Se puede encontrar una descripción completa de la jeringa en la Tabla de materiales.
    1. El lunes, prepare una solución de administración de medicamentos que consiste en dexametasona, vincristina y PBS. Administrar los medicamentos por vía intraperitoneal.
    2. El martes y el jueves, prepare una solución de administración de medicamentos que consiste en dexametasona, L-asparaginasa y PBS. Administrar los medicamentos por vía intraperitoneal.
    3. El miércoles, prepare una solución de administración de medicamentos que consiste en dexametasona y PBS y adminístrela por vía intraperitoneal. Preparar una segunda solución de administración de fármacos que consista en daunorrubicina y PBS. Administrarlo por vía intravenosa.
    4. El viernes, prepare una solución de administración de medicamentos que consiste en dexametasona y PBS. Administrar el fármaco por vía intraperitoneal.
    5. Permita que los animales descansen durante los días de fin de semana. Repita el ciclo de tratamiento durante 4 semanas.
      NOTA: Se puede encontrar un programa de tratamiento completo en la Tabla complementaria 2. Es importante aclarar que se probaron otros protocolos ya establecidos para el tratamiento con ratones, pero dieron como resultado altos niveles de toxicidad para la cepa NSG. Por lo tanto, el esquema de tratamiento propuesto se sometió primero a un proceso de estandarización para la reducción de la toxicidad, lo que resultó en las dosis y frecuencia de administración presentadas en este protocolo. Se espera que el porcentaje de hCD45+ en el grupo tratado disminuya en comparación con el porcentaje de hCD45+ en el grupo control debido a la administración del tratamiento.
  4. Administración de medicamentos y monitoreo de la capacidad de respuesta a la leucemia
    1. Sujete manualmente al animal con la mano izquierda para administrar medicamentos por vía intraperitoneal. Mantenga al animal con la porción ventral hacia arriba. En la porción ventral, ubique el cuadrante inferior derecho.
    2. Con la mano derecha, use una aguja de inyección estéril, afilada y de un solo uso e inyecte 100 μL de la solución de administración del fármaco en el cuadrante inferior derecho de los ratones.
      NOTA: Tenga cuidado al sujetar al animal; no debería ser un procedimiento dañino para los ratones. Al igual que en la extracción de sangre, tenga en cuenta cualquier complicación respiratoria. En el caso de inyecciones intraperitoneales, sujete siempre la aguja perpendicularmente para evitar la perforación de órganos.
    3. Siga las mismas instrucciones que se usan para trasplantar células leucémicas para administrar medicamentos por vía intravenosa. Deje que los ratones descansen después de 4 semanas de administración del tratamiento hasta la reaparición de las células de ALL, aquí llamada primera recaída (R1).
      NOTA: A pesar de la diferencia en la vía de administración, la inyección intravenosa utiliza el mismo volumen que la inyección intraperitoneal.
  5. Monitoreo de la capacidad de respuesta a la leucemia y detección de la primera recaída (R1)
    1. No suspenda el monitoreo semanal de la leucemia por citometría de flujo durante las fases de tratamiento o reposo.
      NOTA: Teniendo en cuenta el tratamiento de 5 días a la semana, se recomienda encarecidamente que el control se realice al comienzo de la semana. En nuestro estudio, la recolección de sangre, el procesamiento de muestras y el análisis siempre se realizaron los lunes.
    2. Realice la extracción de sangre y cualquier procedimiento posterior requerido para el monitoreo de acuerdo con los pasos 1.4 a 1.11.
      NOTA: Después del período de reposo dado, las células R1 se detectarán por el aumento repentino en el porcentaje de hCD45+ en la sangre periférica de ratones. El período entre el final del tratamiento y la aparición de la recaída es variable y puede ser distinto para cada leucemia sometida a exámenes de detección. En la detección de R1, se debe realizar la tercera y última fase del modelo de ratón propuesto de recaída. Para mejorar el seguimiento y los análisis de respuesta, sugerimos utilizar medidas de respuesta objetivas como enfermedad progresiva, enfermedad estable, nivel de respuesta (parcial, completa o mantenida), remisión y resistencia, siguiendo las pautas descritas por Randall et al. (2024)16.

3. Ciclos repetidos de tratamiento hasta la aparición de células resistentes

  1. Detección de la primera recaída
    1. Administrar una semana completa de tratamiento de tipo inducción a cualquier ratón que tenga recaída de leucemia (llamada R1), es decir, cuando se alcanza el umbral de 0,2% de hCD45+ en sangre periférica. Durante 1 semana, de lunes a viernes, siga el programa de administración de medicamentos utilizado para el tratamiento de inducción de 4 semanas.
      NOTA: La administración de solo 1 semana de tratamiento en este punto tiene como objetivo probar in vivo si las células leucémicas han ganado resistencia a la quimioterapia y, finalmente, han impulsado la progresión de la leucemia a recaídas sucesivas a lo largo del tiempo, bajo presión de quimioterapia. Optamos por no administrar un segundo programa de 4 semanas como un medio para evitar la toxicidad excesiva y la pérdida de animales.
    2. Deje que los ratones descansen al final de la semana completa de administración del medicamento. Continuar el monitoreo semanal de la respuesta a la leucemia mediante citometría de flujo siguiendo los pasos 1.4 - 1.11.
      NOTA: En este punto, se espera que las células leucémicas sigan respondiendo al tratamiento. En consecuencia, al monitorear la leucemia, el porcentaje de hCD45+ en los ratones debe disminuir y permanecer negativo durante un cierto período.
  2. Monitoreo de la apariencia de R2
    1. Espere a que aparezca la recaída R2 (células hCD45+ ≥ 0,2%). Cuando aparezca, cuente el tiempo transcurrido entre el final del tratamiento y la aparición de R2. Llame a este período Δt1.
    2. Proceda a una segunda semana completa de administración de tratamiento de tipo inducción. Siga las mismas pautas que la primera administración de este programa.
    3. Deje que los ratones descansen al final del tratamiento. Continuar con el control de la leucemia.
  3. Monitoreo de la apariencia R3
    1. Espere a que aparezca la recaída R3. Cuente el tiempo de la misma manera que en el paso 3.2.1. Llámalo Δt2.
    2. Compare Δt1 y Δt2. Repita los pasos anteriores N veces para obtener múltiples recaídas de leucemia (R1, R2... RN) si el período Δt sigue siendo el mismo. Suspenda los ciclos de tratamiento una vez que se acorte el período Δt.
      NOTA: Una disminución de Δt a la recaída es una indicación de la resistencia a los medicamentos ganada por las células leucémicas. Este resultado refuerza la capacidad del modelo de recaída de ratones para generar células de LLA resistentes a la quimioterapia.
    3. Recupere las células leucémicas como se describe en el paso 4 a continuación. Guárdelos vivos mediante criopreservación o mediante cualquier conservante compatible con los análisis posteriores previstos.
      NOTA: El evento recomendado para la recuperación de células leucémicas es de hasta el 25% de hCD45+ en sangre periférica, según lo descrito por la literatura reciente16.

4. Recuperación de células leucémicas mediante la extracción de órganos

  1. Eutanasia en ratones con sobredosis de anestésicos químicos
    1. Eutanasia a ratones mediante sobredosis de anestésicos químicos, seguida de luxación cervical para confirmar la eutanasia como se describe a continuación.
    2. Prepare una mezcla que contenga tres anestésicos diluidos en estéril 1x PBS para anestesia profunda. Use 150 μL de maleato de acepromazina comercial, 50 μL de xilacina comercial, 80 μL de ketamina comercial y 220 μL de PBS para cada animal que se vaya a sacrificar.
    3. Administrar 500 μL de la mezcla preparada por inyección intraperitoneal. Siga las mismas pautas de restricción e inyección que se describen en el paso 2.4.
    4. Bajo el efecto de una sobredosis de anestésicos químicos, los ratones se acostarán en el fondo de la jaula. Después de unos minutos, observe si los ratones tienen un paro respiratorio. Si es así, espere a que cese el esfuerzo respiratorio. Para verificar que el procedimiento de eutanasia fue efectivo, verifique la presencia de un reflejo involuntario aplicando presión en una de las patas traseras del animal. Para confirmar la eutanasia, proceda a la luxación cervical.
  2. Luxación cervical
    1. Sostenga al animal con la parte trasera del cuerpo contra la rejilla de alimentación de la jaula. Usa los dedos índice y pulgar de la mano izquierda para formar la forma de unas pinzas. Coloque los dedos en forma de pinzas directamente debajo de la cabeza del animal. Presione firmemente contra la parte cervical de la columna vertebral.
    2. Agarra la cola del animal con la mano derecha. Tire de él hacia atrás con un movimiento firme y constante hasta que la cabeza del animal se separe del resto de su cuerpo.
      NOTA: La luxación cervical es uno de los métodos aceptados para confirmar la eutanasia 17,18,19. Otros métodos, como la exposición continua al CO2 durante al menos 15 minutos después del paro respiratorio, se pueden utilizar como alternativa.
  3. Preparación animal para la sustracción de órganos
    1. Desinfecte a los ratones aplicando alcohol al 70% en todo su cuerpo. Coloque el cuerpo del animal sobre una plataforma quirúrgica para roedores con la porción ventral hacia arriba. Afeita la parte abdominal del cuerpo.
      NOTA: Puede encontrar una descripción completa de la plataforma de operaciones quirúrgicas para roedores en la Tabla de materiales.
  4. Recolección del bazo
    1. Haga una pequeña incisión con tijeras quirúrgicas estériles y pinzas en la piel abdominal. Retirarlo de la zona abdominal, exponiendo el peritoneo.
    2. Hacer una pequeña incisión en el peritoneo. Córtelo hasta obtener acceso completo a los órganos ubicados en el abdomen.
    3. Ubique el bazo, justo debajo del estómago del animal. Extirpa el bazo. Colóquelo en un recipiente que contenga 1x PBS estéril para su posterior procesamiento.
  5. Recolección de fémur
    1. Proceda a abrir la cavidad peritoneal para acceder a las patas traseras del animal.
    2. Localiza el fémur. Retirarlo cortando las articulaciones que lo unen con el hueso de la pelvis y con la tibia y el peroné. Realice este proceso para ambos huesos del fémur.
    3. Limpie los huesos eliminando cualquier músculo, piel o tejido restante. Colóquelos en un recipiente que contenga 1x PBS estéril para su posterior procesamiento. Deseche el cadáver del animal de acuerdo con las pautas del Comité de Ética Animal.
      NOTA: Dependiendo de los objetivos del estudio, también se podrían recolectar células de ALL del hígado, el sistema nervioso central, el timo, los ganglios linfáticos, etc. En este manuscrito, como ejemplo, describimos la colección de células de ALL del bazo y la médula ósea.
  6. Preparación para el procesamiento de órganos
    1. Reúna un tubo de centrífuga estéril de 50 ml, dos jeringas estériles de 1 ml, una aguja hipodérmica estéril de 25 mm x 0,6 mm y dos filtros celulares estériles de 70 μm.
  7. Procesamiento del bazo
    1. Coloque un colador de células en la parte superior de un tubo de centrífuga abierto de 50 ml. Coloque el bazo en la superficie del colador celular. Macerar el órgano con la parte plana del émbolo de la jeringa hasta que no se vean grandes porciones.
    2. Agregue 1x PBS estéril al bazo macerado. Realice movimientos circulares con la parte plana del émbolo de la jeringa para asegurar la filtración celular.
      NOTA: El vertido de PBS se puede hacer gradualmente; sin embargo, el volumen final utilizado no puede exceder los 6 ml. Una vez finalizado el procesamiento del bazo, el colador celular debe estar limpio y desprovisto de tejido residual. En caso de saturación del filtro celular, es posible emplear un filtro celular alternativo. El contenido del colador inicial se puede transferir al segundo colador y luego se puede continuar con el procesamiento. Para acceder a la carga tumoral dentro de este órgano, se puede separar una porción del bazo para su evaluación histopatológica.
  8. Procesamiento de médula ósea
    1. Incorpore un nuevo filtro celular para el procesamiento de médula ósea en el tubo de centrífuga ya utilizado. Corta los bordes del hueso del fémur hasta que las aberturas de la médula ósea sean accesibles. Inserte la aguja hipodérmica en una jeringa nueva. Agregue 1 ml de 1x PBS estéril a la jeringa.
      NOTA: Dependiendo de los objetivos del estudio, las células de ALL obtenidas del bazo y la médula ósea deben recolectarse por separado. En este caso, se debe usar un tubo de centrífuga separado para cada tejido. Se puede separar una porción del fémur para una evaluación histopatológica para evaluar la carga tumoral dentro de este órgano.
    2. Ejecute el lavado de médula ósea sobre el colador celular. Inserte la punta de la aguja en un lado de la abertura de la médula ósea. Empuje el émbolo de la jeringa con un movimiento firme y constante. Repita el procedimiento con el otro hueso del fémur.
    3. Desacople la aguja. Utilice la parte plana de la jeringa para macerar la médula ósea enrojecida. Agregue 1x PBS estéril a la médula ósea macerada. Realice movimientos circulares con la parte plana del émbolo de la jeringa para asegurar la filtración celular. Una vez finalizado el procedimiento de procesamiento, el tubo de centrífuga de 50 ml contendrá un volumen total de 10 ml, que comprende una mezcla de células esplénicas y de médula ósea que se han diluido en PBS.
      NOTA: El proceso de vertido de PBS se puede ejecutar gradualmente; sin embargo, es imperativo asegurarse de que el volumen final utilizado no exceda los 2 ml.

5. Aislamiento de células leucémicas por centrifugación en gradiente

  1. Preparación para el aislamiento de células leucémicas
    1. Reúna un tubo de centrífuga de 15 ml, pipetas Pasteur desechables estériles, el tubo de centrífuga de 50 ml que contiene los órganos que se han procesado y el medio de gradiente de densidad para el aislamiento de linfocitos.
      NOTA: El medio facilita el aislamiento de las células mononucleares creando un gradiente de densidad a través de la centrifugación. Las células mononucleares (linfocitos, monocitos y células LLA) forman una capa en la interfaz entre el medio y el plasma.
  2. Aislamiento de células leucémicas
    1. Agregue 5 ml del medio de gradiente de densidad para el aislamiento de linfocitos al tubo de centrífuga de 15 ml con una pipeta Pasteur desechable. Agregue gradualmente los 10 ml de la mezcla de células esplénicas y de médula ósea sobre la capa media. Sostenga el tubo en un ángulo poco profundo, alrededor de 30 ° o menos, y agregue lentamente la mezcla celular a lo largo de la pared del tubo para que la capa de densidad media no se altere.
      NOTA: Tenga cuidado durante este proceso para asegurarse de que las celdas no se mezclen con el medio de densidad. La perturbación durante este proceso puede provocar la falla de la formación de gradiente de densidad durante la centrifugación.
    2. Centrifugar el tubo de 15 ml a 420 x g en un rotor de cubeta oscilante, durante 30 min, sin aceleración y sin interrupción, para evitar perturbar las fases formadas.
      NOTA: Las células leucémicas formarán una capa entre el medio de densidad y las fases acuosas.
    3. Retire y deseche la fase acuosa superior con una pipeta Pasteur desechable estéril. Recoja la capa de células leucémicas formada con una pipeta Pasteur desechable estéril. Transfiéralo a un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml.
      NOTA: No se preocupe si parte de la capa media de menor densidad se pipetea junto con las células leucémicas.
  3. Lavado de células leucémicas
    1. Agregue 1x PBS estéril al tubo que contiene las células recolectadas hasta alcanzar el límite de 15 ml.
    2. Centrifugar las células a 300 x gdurante 5 min. Restaura la aceleración y el frenado máximos. Retire y deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en un nuevo frío estéril 1x PBS.5.3.3.Proceda a la verificación de la viabilidad celular y celular. Siga las pautas estándar del procedimiento de recuento de células13. Las células lavadas se pueden teñir con anticuerpos anti-CD45 de ratón (mCD45), anticuerpos anti-CD45 humanos (hCD45) y anticuerpos anti-CD19 humanos (hCD19), seguidos de pasos de lavado y adquisición de datos.
      NOTA: En caso de procesar las células del bazo y las células de la médula ósea en diferentes tubos de centrífuga, una parte de estas muestras se puede utilizar para acceder a la carga tumoral dentro de estos órganos a través de la citometría de flujo.
  4. Criopreservación de células leucémicas
    1. Sedimentar las celdas por centrifugación a 300 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante. Mantenga las celdas en hielo.
    2. Prepare un medio de congelación compuesto por un 90% de suero bovino fetal frío estéril (FBS) y un 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Use 1 ml de esta solución para cada vial de criopreservación.
    3. En hielo, vuelva a suspender las células en la solución preparada a una concentración de 2 x 107 células/ml. Alícuota las células en los tubos de criopreservación. Criopreservar células siguiendo las pautas estándar de criopreservación de cultivos celulares20.
      NOTA: Estas celdas se pueden utilizar para análisis adicionales. En lugar de congelar células viables, también se pueden alícuotas y preservar células en diferentes conservantes para análisis posteriores de ADN, ARN, proteínas y metabolitos.

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Resultados

En el contexto de nuestros estudios, se seleccionaron muestras precursoras de LLA de células B de dos grupos de pacientes: uno que exhibió una respuesta favorable, según lo determinado por la ausencia de células leucémicas en la sangre periférica del día 8 y la ausencia de células leucémicas residuales en la médula ósea en los días 15, 33 y 78/96. El otro grupo estuvo formado por LLA que coincidieron con los subgrupos moleculares de los anteriores, obteni...

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Discusión

Comprender los mecanismos biológicos subyacentes a las enfermedades neoplásicas es esencial para el desarrollo de terapias más efectivas y para mejorar los resultados de los pacientes. En afecciones como la leucemia linfoblástica aguda pediátrica, estos enfoques de investigación no solo son relevantes para aumentar las tasas de curación, sino que también tienen un valor particular para los pacientes en los que los tratamientos estándar han alcanzado los límites de intensidad terapéutica ...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos al Centro Infantil Boldrini y a todos los pacientes que donaron sus muestras para el estudio. Manuella M. Hoff recibió una beca de la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) de la Fundación de Investigación de São Paulo (FAPESP, 2024/ 03383-2). José A. Yunes recibió una beca de productividad del Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq, 308399/2021-8). Este trabajo fue apoyado por la financiación de la investigación del Ministerio de Salud de Brasil por el programa PRONON (Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica, NUP 25000.211174/2019-45).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1 mL  jeringaBD #309628Extracción de órganos
10 mL de agua estéril para inyecciónHalex Istar Indú stria Farmaceutica LTDAhttps://www.medstoremaringa.com.br/produtos/agua-destilada-10ml-pack-c-5un-isofarma/Reconstitución de drogas
Solución de lisis 10X para glóbulos rojosBioLegend#420302Procesamiento de muestras de sangre de ratones
Analizador de celdas de 5 canalesBD Biociencias658226R1Citómetro de flujo  
Colador de celdas de 70 uMFalcom#352350Extracción de órganos
Maleado acepromazina Inj Vetnil LTDAhttps://vetnil.com.br/produto/acepran-r-1Anestesia de ratones
APC antihumano CD45 - isotipo de ratón IgG1 - clon HI30BioLegend#304037Tinción linfocitiva
Asparaginasa 10000 UAginasa/medac#88660100Tratamiento con ratones
Brilliant-Violet 605 anti-ratón CD45 - isotipo IgG2 - clon 30-F11BioLegend#103139Tinción linfocitiva
DaunorubicinaFarmarin#116880025Tratamiento con ratones
DexametasonaAqué#00000066Tratamiento con ratones
DimetilsulfóxidoSigma-Aldrich#589569Criopreservación de linfocitos
Aguja desechable - 0,60 x 25 mm (23G x 1' ’)BD#300388Extracción de órganos
Lanceto estéril desechable  Yancheng Huida Instrumentos Médicos  https://www.cralplast.com.br/produto/lanceta-manual/Recogida de sangre de ratones
Ácido etilendediaminetetracéticoTecnologías vitales#15576-O28Solución EDTA
Suero fetal bovinoCultilab#F083Criopreservación de linfocitos
Análisis de software de citometría de flujo - Versión 10.10.0BD Biocienciashttps://www.flowjo.com/Análisis de citometría de flujo
Análisis de software de gráficos y gráficos - Versión 9.5.1Dotmaticshttps://www.graphpad.com/featuresGraficado y análisis de gráficos
Jeringuilla de insulina con aguja acoplada 1 mL FX 12,7 mm X 0,33 mmDescarpacke0342101Trasplante de ratones y administración de fármacos
Ketamine InjSespo Indú stria e Comé rcio LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/dopalen-pecuaria/Anestesia de ratones
Plataforma Quirúrgica Multifuncional para roedoresCorporación Científica de Kenthttps://www.kentscientific.com/products/surgisuite/Procedimientos quirúrgicos en ratones
PE antihumano CD19 - isotipo de ratón IgG1 - clon de HIB19BioLegend#302208Tinción linfocitiva
Cloruro de potasioSigma-AldrichP3911-1KGSolución PBS
Dibásico fosfato de potasioSigma-AldrichP0662-1KGSolución PBS
Reactivo para el aislamiento de linfocitosCytiva#17-1440-02, paquete de 6 y más veces; 100  MlAislamiento de linfocitos de órganos extraídos
Cloruro de sodioSigma-AldrichS9888-1kgSolución PBS
Fosfato de sodio dibásico  Sigma-AldrichS9763-1KGSolución PBS
Pinzas de disección anatómica estériles - 12 cm ABC 0170Laboratorio Lí Der120Procedimientos quirúrgicos en ratones
Tijeras estériles 12 cm - ABC 0321Laboratorio Lí Der136Procedimientos quirúrgicos en ratones
VincristineLibbs#7896094208483Tratamiento con ratones
Xylazine InjSespo Indú stria e Comé rcio LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/anasedan-10-ml-bovinos-e-equinos/Anestesia de ratones

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