Un método de imagen óptica compatible con microscopía electrónica de barrido para el mapeo cerebral mesoscópico de todas las células

Summary

Introdujimos una técnica de imagen novedosa llamada Tomografía de Interferencia Óptica Multicapa (OMLIT), que permite la imagen imparcial de todas las células en muestras cerebrales a mesoescala y puede integrarse perfectamente en el flujo de trabajo de imagen de la microscopía electrónica de barrido serial basada en cinta en la misma muestra.

Abstract

Comprender las relaciones estructurales y funcionales dentro de las complejas redes neuronales del cerebro requiere la construcción de atlas cerebrales que posean tanto un amplio campo de visión como una resolución subcelular. Sin embargo, los métodos actuales de imagen óptica y microscopía electrónica presentan limitaciones, lo que dificulta la obtención de imágenes de todas las células dentro de una sola muestra. Este protocolo introduce una técnica de imagen llamada Tomografía de Interferencia Óptica Multicapa (OMLIT), que permite la obtención indiscriminada de imágenes ópticas de todas las células en muestras cerebrales realizadas tras la preparación de muestras en microscopía electrónica, reconstruyendo así un atlas cerebral completo de todas las células neuronales. Además, la imagen OMLIT puede integrarse perfectamente con el flujo de trabajo de imagen de la microscopía electrónica de barrido automatizada de ultramicrotomía con recogida de cinta (ATUM-SEM). Esto permite a los investigadores obtener información estructural a mesoescala de las células antes de la microscopía electrónica, facilitando la selección precisa de regiones de interés y reduciendo significativamente el área y el volumen de datos necesarios para la imagen microscopía electrónica (EM) de alta resolución. Validamos la precisión y compatibilidad de este método en muestras reales de la corteza cerebral del ratón adulto, demostrando sus amplias posibilidades de aplicación en la construcción de atlas cerebrales a múltiples escalas.

Introduction

El mapeo exhaustivo de los circuitos neuronales a resolución celular y subcelular es esencial para revelar la estructura y función del cerebro. Los métodos tradicionales de imagen óptica, como la microscopía de dos^{fotones 1}, la tomografía micro-óptica de sección de fluorescencia (fMOST^)2,3,4 y el sistema^{VISoR 5}, han permitido la imagen neuronal a mesoescala y la imagen funcional in vivo. Sin embargo, debido a su dependencia de un marcado escaso, no logran capturar a toda la población celular. Por otro lado, las técnicas de imagen óptica sin marcador, como la microscopía fotoacústica funcional (fPAM^)6,7, la tomografía de coherencia óptica (OCT⁾⁸ y la microscopía de fase^{cuantitativa 9}, tienen el potencial de visualizar simultáneamente todas las neuronas dentro del campo de visión. No obstante, estos métodos suelen estar limitados por una baja resolución axial y una profundidad de imagen poco profunda, y su complejidad hardware dificulta su aplicación generalizada en la construcción de atlas cerebrales. En contraste, las técnicas de microscopía electrónica de sección en serie (ssEM), incluyendo el SEB de cara de bloque en serie (SBF-SEM^)10,11, el SEM de haz de iones enfocado (FIB-SEM⁾12,13,14 y la ultramicromicrotomía automática de recogida de cinta (ATUM-SEM^)15,16,17, puede revelar redes densas de conectividad sináptica a resolución nanométrica, proporcionando herramientas esenciales para la conectómica de alta resolución. Sin embargo, estas técnicas sufren de bajo rendimiento, largos tiempos de adquisición, campos de visión limitados y altos costes de procesamiento y hardware de^datos.

Para superar las limitaciones anteriores, desarrollamos un método de imagen llamado Tomografía de Interferencia Multicapa Óptica (OMLIT), que ofrece una solución de bajo coste y alto rendimiento para la imagen indiscriminada, de alto contraste y campo amplio de todas las células en secciones ultrafinas, logrando una resolución submicronática en grandes áreas tisulares. Al mismo tiempo, OMLIT es inherentemente compatible con los flujos de trabajo de SEB en secciones seriales: antes de la microscopía electrónica de alta resolución, OMLIT proporciona información estructural sobre las mismas secciones, permitiendo una navegación precisa por ROI y reduciendo significativamente el área y el volumen de datos necesarios para la imagen electromagnética posterior. OMLIT ofrece ventajas únicas a nivel de imagen a mesoescala y sirve como un puente crítico que conecta mapas estructurales neuronales a diferentes escalas espaciales. Su naturaleza no destructiva preserva el potencial para futuras integraciones con estrategias específicas de marcado, como el uso de proteínas fluorescentes resistentes al^{osmio 19} para la preparación y obtención de imágenes de muestras. Este método permite la obtención de imágenes a mesoescala de regiones cerebrales seleccionadas, lo que permite la adquisición rápida de la morfología, cantidad, distribución y densidad neuronal en las regiones. También facilita la caracterización cuantitativa de proyecciones axonales y la distribución de dendritas entre neuronas en diferentes áreas cerebrales. Para regiones específicas de interés en los resultados de imagen, se pueden investigar más a fondo los detalles ultraestructurales in situ mediante microscopía electrónica.

El principio de imagen de OMLIT ha sido descrito en el trabajo de Hao^{Fan 20}. Brevemente, durante la imagen, la sección ultrafina, la capa recubierta, la cinta de recogida, la cinta conductora y la oblea forman una estructura de película fina multicapa. Cuando una onda plana interactúa con esta estructura, se generan ondas reflejadas en varias interfaces y se solapan en el espacio de detección, lo que resulta en interferencias ópticas debido a diferencias en reflectancia, índice de refracción y absorción entre los materiales. Un programa de simulación basado en MATLAB desarrollado según este principio demostró una concordancia razonable con los resultados experimentales.

El esquema de imagen OMLIT puede clasificarse en dos tipos según la estrategia de procesamiento de cintas. La primera es la estrategia de alta reflectividad, en la que se utilizan metales como Cr, Cu, Al o Ag para recubrir la superficie de la cinta, lo que resulta en mayores intensidades ópticas en regiones citoplasmáticas y en lumenes vasculares rellenos de resina en comparación con las áreas circundantes. La segunda es la estrategia de baja reflectividad, que emplea cinta Kapton sin recubrimiento, cinta D-50 o cinta PET recubierta con CNT. En este caso, el resultado de imagen óptica es el inverso del primero: regiones libres de membrana ricas en resina (por ejemplo, citoplasma y lumenes vasculares) aparecen con menor intensidad.

Resumimos y establecemos sistemáticamente protocolos estandarizados adaptados a dos estrategias de imagen distintas. Los protocolos presentados aquí ofrecen procedimientos experimentales completos y detallados. Además, se resumen los problemas comunes encontrados durante los experimentos, junto con las soluciones propuestas. Nos centramos en presentar un conjunto de datos de corteza de ratón adquirida mediante la estrategia de baja reflectividad (805 × 857,5 × 11,66 μm³), ilustrando las características distintivas y ventajas del enfoque de imagen OMLIT.

Protocol

Todos los procedimientos animales se realizaron conforme a las directrices institucionales de la Universidad de Ciencia y Tecnología de China y a las normativas nacionales pertinentes. La preparación de la muestra para la imagen OMLIT sigue el mismo protocolo que el utilizado en la EM convencional, y el procedimiento específico que empleamos ha sido descrito en otro^{lugar 21}. En resumen, tras la anestesia, los ratones fueron perfundidos transcárdicamente secuencialmente con tampón de cacodilato de sodio, líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) y finalmente un fijador que contenía glutaraldehído y paraformaldehído. Se extrajo cuidadosamente el cerebro y se seccionaron alrededor de 1 × 1 × bloques de 1 mm³ de tejido cerebral. Las muestras se fijaban químicamente, se sometían a manchas seriadas de metales pesados, se deshidrataban e incrustaban en resina. El flujo de trabajo general del protocolo se presenta en la Figura 1.

Figura 1: Resumen del flujo de trabajo. (A) Cintas de recogida mencionadas en el protocolo (de izquierda a derecha: poliimida, D-50 y PET recubierto de CNT). (B) Seccionamiento en serie y recogida de las muestras recortadas. (C) Montaje de cintas que contienen secciones recogidas sobre una oblea circular de silicio. (D) Imagen fotográfica, barra de escala 100 μm. (E) Recubrimiento de carbono. (F) La imagen por microscopía electrónica corresponde a la región descrita en la Figura 1D, barra de escala: 10 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

1. Preparación de la cinta

NOTA: Los siguientes procedimientos deben realizarse en una sala limpia para evitar la contaminación de la cinta por polvo.

1. Estrategia de alta reflectividad
   1. Selecciona Kapton (en adelante llamada cinta de poliimida, 50 μm de espesor) o película Panlite (en adelante D-50, 50 μm de espesor) y móntala sobre el sistema motorizado de bobinado. Aquí se utiliza la cinta de poliimida como ejemplo.
      NOTA: En este estudio se utilizó un dispositivo de bobinado motorizado, diseñado para ser accionado por un motor paso a paso controlado a través de una placa Arduino, para hacer pasar la cinta de un carrete a otro a través del cono de plasma de spitter. Para compensar el aumento de la velocidad de línea de la traslación de la cinta causado por la acumulación de cinta en el carrete de conducción, aumentando el diámetro del carrete de recogida, se escribía un programa para afinar en serie la velocidad angular del carrete tras cada giro de 360°.
   2. Deposita una película fina uniforme de Cr (u otros metales como Al, Ag o Cu) sobre la superficie de la cinta utilizando un sistema de sputtering magnetrón (sputter de doble cabeza). Coloca la cinta a una distancia de 80 mm del objetivo de sputtering para una deposición óptima. Realizar el proceso bajo energía continua y a una presión de 1,0 Pa regulada por un 99,99% de gas argón.
   3. Ajusta la velocidad de bobinado de la cinta a 0,6 mm/s para lograr un espesor metálico de 50 nm. Tras la deposición, enfría lentamente la cámara hasta alcanzar la temperatura ambiente (RT) bajo alto vacío para minimizar el esfuerzo del recubrimiento.
      NOTA: El grosor óptimo del recubrimiento para la misma cinta puede variar según el tipo de metal utilizado. Ajusta la velocidad de traslación de la cinta para lograr una variedad de grosores de recubrimiento, como 50, 70, 100, 150 y 200 nm.
   4. Evalúa el grosor y la uniformidad del recubrimiento utilizando un perfilador de aguja, microscopía de fuerza atómica o microscopía electrónica de barrido.
   5. Limpia y vuelve la cinta hidrofílica usando un limpiador de plasma a 80 W de potencia, con una velocidad de movimiento de la cinta de 7 mm/s. Tras el tratamiento, las gotas de agua colocadas sobre la superficie de la cinta deben extenderse rápidamente en una película fina (Figura 2A).
2. Estrategia de baja reflectividad
   NOTA: Este protocolo permite el uso de cinta D-50 o de una cinta comercial de nanotubos de carbono (CNT) recubierta con polietileno tereftalato (PET). Dado que esto último puede introducir algo de ruido de fondo durante la imagen microscopica electrónica —aunque no fuerte—, podría afectar potencialmente la segmentación de imágenes electromagnéticas. Por lo tanto, la siguiente descripción seguirá usando la cinta D-50 como ejemplo.
   1. Prepara las películas D-50 y corta la hoja completa en cintas de aproximadamente 7 mm de ancho. Utiliza un lado expuesto de la cinta para recoger secciones, mientras proteges el otro lado con una capa de película mate para evitar arañazos y contaminaciones. Retira la película mate durante el siguiente paso de montaje de la oblea de silicio.
   2. Para un mayor número de secciones, une diferentes secciones de cinta D-50 entre sí. Asegura las uniones entre los segmentos de cinta usando cinta adhesiva de doble cara.
      NOTA: Al adherir segmentos de cinta, asegúrate de que la cinta principal se solape con la de arriba a abajo con la cinta de doble cara. Minimiza la superficie adhesiva y deja un margen a lo largo de los bordes de la cinta para evitar que el pegamento se exprima durante el enrollado, lo que podría contaminar la cinta (Figura 2B).
   3. Limpia y vuelve la cinta hidrofílica usando un limpiador de plasma, siguiendo el mismo procedimiento y logrando el mismo efecto que se describió anteriormente.
      NOTA: Excepto por el recubrimiento metálico y los pasos de pulverización de carbono, los otros pasos de ambas estrategias son los mismos.

2. Sección ultrafina en serie y colección basada en cinta

1. Usando una pequeña amoladora o herramienta de corte similar, recorta la resina en el lateral con la muestra, retirando la resina en blanco circundante para exponer el área de la muestra.
2. Coloca el bloque incrustado en resina en el portamuestras y aprieta el mando del soporte para asegurar firmemente el bloque.
3. Monta el portamuestras en el brazo móvil del microtomo. Instala un cuchillo de cristal o un cuchillo de recorte de diamante (en un ángulo de 45°) en el soporte del cuchillo. Bajo el microscopio, recorta la superficie de la muestra en forma de pirámide y alisa la superficie.
   NOTA: Los bordes delantero y trasero del bloque de muestra recortado deben ser lo más paralelos posible (véase la Figura 2C).
4. Recorta y alisa los cuatro lados del bloque de muestra para eliminar cualquier exceso de resina alrededor de los bordes, evitando posibles colisiones con el cuchillo de diamante. Gira el pomo para asegurarte de que los bordes delantero y trasero del bloque recortado estén alineados en posición horizontal.
5. Quita el cuchillo de recorte y reemplácelo por uno de diamante colocado en un ángulo de 45°. Ajusta el ángulo de inclinación de la base del microtomo a 6°. Mueve lentamente el portacuchillos usando el mando hasta que el filo delantero del cuchillo de diamante esté a 1-2 mm de la superficie de la muestra.
6. Observa la banda brillante entre la superficie de la muestra y el filo de la cuchilla, y ajusta el ángulo de inclinación para que la banda quede uniforme de arriba a abajo y de lado a lado. Esto ayuda a asegurar que la primera sección incluya toda la superficie de la muestra, no solo una esquina.
7. Inyecta agua destilada en la ranura del cuchillo de diamante, permitiendo que el nivel del líquido suba y asegurando que la hoja esté húmeda. Luego, usa una jeringuilla para eliminar algo de agua hasta que el nivel del líquido baje y el reflejo parezca plateado.
8. Ajusta el grosor de la sección (avance), la velocidad de corte y la ventana de corte en la unidad de control. Ajusta la velocidad de sección a 0,6 mm/s y ajusta el grosor de la sección a 60 nm (la velocidad y el grosor específicos dependen de la calidad de la muestra).
9. Empieza a seccionar. Una vez que el microtomo funciona de forma estable y se producen secciones uniformes, se pausa el proceso de seccionado. Usa un pincel fino para eliminar las secciones cortadas y cualquier resto.
10. Instala tanto el carrete de cinta recubierta como el carrete vacío de recogida en el sistema automático de recogida de secciones ultrafinas. Fija el mecanismo de bloqueo y realiza una prueba para asegurar que la cinta se mueva suavemente a velocidad constante y se recoge correctamente en el carrete vacío.
11. Sumerge la cabeza de recogida del dispositivo de recogida de cinta en el baño de agua del cuchillo de diamante. Ajusta la posición de la cabeza de recogida para que quede paralela al filo de la navaja, a una distancia de 1,5 veces la longitud de la muestra de corte, asegurando que las secciones cortadas se recojan suavemente sobre la cinta. Asegura el dispositivo de recogida y reanuda la sección mientras ejecutas simultáneamente el dispositivo de recogida de cinta.
12. Tras recoger un número suficiente de secciones continuas, se detiene el proceso de seccionamiento. Corta la cinta en la zona de sección donde no se recogieron secciones y continúa usando el dispositivo de recogida de cinta hasta que toda la cinta restante se recoja en el carrete.
13. Retira el carrete que contiene las secciones recogidas y colócalo en un horno electrónico de secado. Limpia el dispositivo de recogida de cinta y el microtomo, y devuelva todos los accesorios a su lugar correspondiente.

Figura 2: Preparativos antes de seccionar. (A) Gotas de agua en la superficie de la cinta D-50 antes (arriba) y después del tratamiento hidrofílico (inferior). (B) Vistas esquemáticas superiores y laterales de la zona de unión de la cinta D-50. Azul: cinta D-50; naranja: adhesivo de doble cara; Flecha verde: dirección de movimiento de la cinta. (C) Vista frontal de la muestra tras el recorte, mostrando bordes paralelos superior e inferior. (D) Dispositivo automatizado de recogida de cintas. a: Carrete de cinta para la alimentación de la cinta D-50; b: Carrete de cinta para la recuperación de cinta; Flecha roja: dirección del movimiento de la cinta. (E) Posición de la cabeza de recogida en el dispositivo automatizado de recogida de cintas. La caja amarilla en la esquina inferior derecha indica una sección recién cortada a punto de ser recogida por el dispositivo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

3. Montar en una oblea de silicio

NOTA: Asegúrese de que el espacio de trabajo esté limpio para evitar la contaminación de la cinta por polvo durante los siguientes pasos.

1. Utiliza una oblea redonda de silicio de 4 pulgadas prelimpiada e hidrofilizada en un sistema de tratamiento de plasma (a 80 W de potencia, 3 min).
2. Ponte guantes limpios, coloca la oblea de silicona sobre una superficie plana y corta un trozo de cinta de carbono conductora de doble cara a la longitud adecuada (con un voladizo de 2-3 cm en ambos extremos). Quita la capa protectora blanca de un lado de la cinta conductora de doble cara y aplícala de arriba a abajo sobre la oblea de silicio.
   NOTA: Los dos lados de la cinta conductora deben estar separados unos 2 mm entre sí, y los bordes de la cinta deben ser visibles en la oblea de silicio. Para una cinta conductora de doble cara de 25 mm de ancho, se pueden aplicar tres segmentos de cinta a una oblea de silicio de 4 pulgadas.
3. Dibuja un contorno de la oblea de silicio de 4 pulgadas en el banco de trabajo y marca la longitud aproximada de cada segmento de cinta que se aplicará a la oblea. Corta la cinta que ha recogido las secciones según las longitudes previamente marcadas.
   NOTA: La cinta cortada no debe superar el borde de la oblea de silicio y no cortar las secciones.
4. Despega la película protectora transparente de la cinta conductora de doble cara y, para la cinta D-50, retira la película protectora de la parte trasera de la cinta en este punto. Aplica la cinta paralela a la cinta conductora de doble cara. Aplica hasta tres segmentos de cinta a cada pieza de cinta conductora de doble cara.
   NOTA: Para reducir el riesgo de que la cinta D-50 se desalinee o se contamine con polvo, cubra parte de la cinta conductora con la película transparente que previamente se había despegado, dejando solo una pequeña parte de la cinta conductora expuesta para unir el extremo de la cinta D-50. Esto facilita el ajuste de la dirección de la cinta. Después, despega lentamente la película transparente restante, permitiendo que el resto de la cinta D-50 caiga suavemente y se adhiera a la cinta conductora.
5. Tras montar la cinta, pueden formarse burbujas de aire entre la cinta y la cinta conductora, lo que puede interferir con el proceso de imagen posterior. Coloca la oblea de silicio en una cámara de vacío (u otro equipo de vacío) y aplica un vacío. Una vez completado el proceso de vacío, asegúrate de que las burbujas de aire hayan desaparecido.

4. Post-tinción

1. Prepara un 4% de acetato de uranilo y un 3% de citrato de plomo, y precaliéntalos a 50°C usando una olla de baño maria.
   PRECAUCIÓN: El acetato de uranilo es radiactivo y tiene una toxicidad significativa para el hígado y los riñones. El citrato de plomo puede causar intoxicación por plomo, afectando al sistema nervioso, los riñones y el sistema hematopoyético. El trabajo con estos reactivos debe realizarse en una campana extractora, y debe llevarse el equipo de protección individual (EPI) adecuado, incluyendo bata de laboratorio, guantes de nitrilo, mascarilla y gafas de seguridad. En caso de contacto visual o de piel, lávate inmediatamente con grandes cantidades de agua, informa al personal de seguridad del laboratorio y busca atención médica.
2. Coloque la oblea de silicio, que ha sido aspirada y está libre de burbujas, en un sistema de hidrofilización de plasma para su hidrofilización y limpieza.
3. Utilizando una jeringuilla de 10 mL sin aguja, coloca un filtro de jeringuilla de 0,22 μm y filtra el acetato de uranilo al 4%. Deja caer la solución sobre la sección hasta que toda la superficie de la sección de la oblea de silicio esté cubierta, y luego espera 3 minutos.
4. Lava con agua destilada durante 3 minutos, repitiendo 3 veces, y luego seca la superficie de la muestra con nitrógeno.
5. Usando una jeringuilla de 10 mL con la aguja retirada, coloca un filtro de jeringuilla de 0,22 μm y filtra el citrato de plomo al 3%. Deja caer la solución sobre la sección hasta que toda la superficie de la sección de la oblea de silicio esté cubierta, y luego espera 5 minutos.
6. Lava con agua destilada durante 3 minutos, repitiendo 3 veces, y luego seca la superficie de la muestra con nitrógeno.

5. Adquisición de datos

1. Microscopía óptica
   NOTA: En esta sección, se utiliza un escáner de portaobjetos de investigación (VS200, Olympus) como ejemplo para la microscopía óptica. Otros microscopios, como el Axio Imager.A2 Vario (Zeiss, Alemania), también son adecuados para la imagen óptica descrita aquí. Los pasos para otros microscopios ópticos son generalmente los mismos.
   1. Coloca la oblea de silicio en el escenario del microscopio óptico y fíjala con cinta adhesiva que no deje residuos.
   2. Utiliza una lente objetivo 5x para obtener una imagen general de la oblea de silicio, la cinta y la muestra.
   3. En la imagen de resumen, haz un esquema de cada sección y ordénalas, luego añade puntos de enfoque y puntos de exposición para realizar imágenes automáticas a 20x o 50x de aumento en toda la oblea de silicio con todas las secciones.
   4. Una vez completada la imagen, guarda las imágenes y luego comprueba la calidad de la imagen. Si hay imágenes desenfocadas o de mala calidad, reenfoca y cambia la imagen.
2. Microscopía electrónica
   NOTA: Varios tipos de microscopios electrónicos pueden realizar imágenes continuas de secciones ultrafinas colocadas sobre obleas de silicio. Aquí se utiliza el Multibeam 505 (Zeiss) como ejemplo.
   1. Realizar un recubrimiento de carbono en la superficie de la muestra usando un recubrimiento por pulverización de alto vacío, con un espesor de carbono de 5,7 nm.
      NOTA: Este paso puede saltarse para cintas que hayan sido recubiertas con metal en una estrategia de alta reflectividad o recubiertas con nanotubos de carbono (CNT) en una estrategia de baja reflectividad.
   2. Utiliza un microscopio óptico (Axio Imager.A2 Vario, Zeiss) para capturar el mapa óptico de navegación de la oblea de silicio.
   3. Coloca la oblea de silicio en la cámara de muestra del SEM. Asocia el mapa óptico de navegación con la imagen del microscopio electrónico identificando secuencialmente los dos marcadores anidados en forma de L en la etapa de muestra.
   4. Utiliza el módulo SAT en el software de microscopía (v3.2, 64 bits) para identificar de forma semiautomática las posiciones de las secciones y las áreas de imagen a partir del mapa óptico de navegación.
   5. Ajusta el tamaño del píxel de imagen a 4 nm, el tiempo de permanencia a 0,8 μs, puntos y posiciones de enfoque, y ubicaciones de almacenamiento.
   6. Comienza la imagen continua.

6. Procesamiento de datos

NOTA: La unión 2D de las imágenes OMLIT se realiza automáticamente por el software. Para el registro y segmentación 3D a gran escala de imágenes OMLIT, existen otros algoritmos de IA más potentes. Aquí, para la comodidad de la mayoría de los laboratorios para verificar el proceso, se demuestran la costura, el registro y la segmentación usando Fiji (v1.54p, 64 bits) y VAST (v1.5.0, 64 bits).

1. Abre el conjunto de datos de imágenes en Fiji arrastrando la carpeta que contiene todos los archivos de imagen a la interfaz de Fiji y selecciona Stack Virtual cuando se lo solicite.
2. Utiliza la Herramienta de Rectángulo para seleccionar la región de interés (ROI), luego recorta el conjunto de datos mediante Imagen > Recorte.
3. Alinea la pila de imágenes usando el plugin Register Virtual Stack Slices (Plugins > Registration > Register Virtual Stack Slices).
4. Guarda el conjunto de datos alineado en formato TIFF (Archivo > Guardar como > Tiff).
5. Importa la pila de imágenes TIFF a VAST²² usando Importar > Importar volumen de imágenes a . Archivo VSV.
   NOTA: Para un tutorial más detallado, por favor consulta la página web: https://lichtman.rc.fas.harvard.edu/vast/
6. Al conectar una tableta externa, utiliza la herramienta pincel en Modo Dibujar Segmento para iniciar la segmentación y trazado manual (usa las teclas de acceso directo A y Z para navegar rápidamente entre las porciones de imagen).
7. Visualiza la estructura segmentada en 3D usando Window > 3D Viewer > View > Update.
8. Guarda los resultados de la segmentación mediante File > Save Segmentation.

Results

El flujo de trabajo general del protocolo (Figura 1) comienza con la preparación de diferentes cintas de colección. La Figura 1 muestra los tres tipos de cintas mencionadas en el protocolo (de izquierda a derecha: Kapton, D-50 y PET recubierta de CNT), que presentan propiedades ópticas distintas cuando se colocan sobre el mismo sustrato de fondo. Tras la preparación de la muestra y el recorte de bloques, primero deben recogerse ...

Discussion

Aquí desarrollamos un enfoque de imagen óptica, denominado OMLIT, que permite la imagen mesoscópica y es compatible con los flujos de trabajo de microscopía electrónica de barrido serial basados en cinta. Mediante el método OMLIT, se puede emplear la microscopía óptica para capturar características estructurales mesoscópicas de muestras cerebrales, incluyendo vasos sanguíneos, cuerpos celulares, núcleos, ramas dendríticas principales y algunos axones mielinizados grandes. Además, OMLIT p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cinta adhesiva	3M	B5005094008	Adhesivo de doble cara
Microscopio de Fuerza Atómica	Bruker	Icono de dimensión
Sistema automático de recogida de secciones ultrafinas	Lehua	AutoCUTS II
Cinta adhesiva conductora	Ted Pella	FP16084-8
Dektak Stylus Profilers	Bruker	DektakXT
Cuchillo de diamante para seccionar	Diatomea	DUJ3530	Cuchillo Jumbo de diatomeas
Cuchillo de diamante para recortar	Diatomea	DTB90	Cuchillo de cristal
Microscopio electrónico	Zeiss	MultiSEM505	Alternativa: GeminiSEM 300, Zeiss
FIJI (v1.54p, 64 bits)	Código abierto	https://fiji.sc
Cuchillo de recorte de vidrio	Hecho por él mismo
Citrato de plomo	Leica	T534/2
Microscopio óptico	Olympus	VS200	Alternativa: Axio Imager. A2 Vario, Zeiss
Microscopio óptico	Zeiss	Axio Imager.A2 Vario
Limpiador de plasma	Tecnologías Yidon	Hydro-S4	Alternativas: Ted Pella Pelco u otro limpiador de plasma para bancada
Cinta polimérica	Melton	Kapton	La página web de la empresa ya no está disponible. Recomendamos que los investigadores prueben cintas KAPTON disponibles localmente.
Cinta polimérica	Teijin	PET	https://www.teijin.com/
Cinta polimérica	Teijin	D-50	https://www.teijin.com/
Oblea de silicio	Saichi	912303	La oblea se pule en un lado.
Pulverizador de pulverización	Leica	ACE600	Alternativa: Sputter de doble cabeza, Yujie
Ultramicrotomo	Leica	UC7	Alternativa: RMC PT-PC
Uranilacetato	EMS	22400
VAST (v1.5.0, 64 bits)	Instituto Médico Howard Hughes	https://software.dvid.io/vast/	VAST A1:D32Lite es una herramienta gratuita para la anotación manual y segmentación de grandes conjuntos de datos de microscopía 3D.
Software ZEN (v3.2, 64 bits)	Zeiss	https://www.zeiss.com/microscopy/zh/products/software/zeiss-zen.html