Detección por sonda fluorescente por PCR de Aspergillus Spp., Cryptococcus neoformans y Pneumocystis jirovecii

Summary

Aquí presentamos un protocolo de pruebas clínicas basado en el método de sonda fluorescente PCR para la detección simultánea de Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans y Pneumocystis jirovecii.

Abstract

Este protocolo describe un procedimiento estandarizado para la detección cualitativa de Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans y Pneumocystis jirovecii en muestras clínicas de esputo utilizando un kit de detección de ácidos nucleicos con sonda fluorescente por PCR. El procedimiento implica la recogida de muestras clínicas, el pretratamiento por licuefacción alcalina, la extracción automática de ácidos nucleicos y la detección por PCR en tiempo real por multiplexación. Aspergillus spp., C. neoformans y P. jirovecii se detectan utilizando sondas fluorescentes específicas de cada objetivo (canales FAM, VIC y CY5, respectivamente), con un control interno (canal ROX) integrado para garantizar la calidad. La validez del ensayo y la interpretación del resultado de la muestra se basan en valores de corte definidos del umbral del ciclo (Ct). Un control positivo debe mostrar curvas de amplificación en forma de S con Ct ≤ 33,7 en todos los canales, mientras que el control negativo no debe mostrar amplificación. Para muestras clínicas, un valor de Ct ≤ 33,7 en el canal FAM indica positividad para Aspergillus spp., y un valor de Ct ≤ 36 en los canales VIC o CY5 indica positividad para C. neoformans o P. jirovecii, respectivamente.

Introduction

Las infecciones fúngicas invasivas, como las causadas por Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans y Pneumocystis jirovecii, representan una amenaza significativa para los pacientes inmunodeprimidos, lo que conduce a una alta morbilidad y mortalidad. Un diagnóstico oportuno y preciso es fundamental para iniciar la terapia antifúngica adecuada y mejorar los resultados^{clínicos 1}. Los métodos diagnósticos convencionales, como el cultivo, la microscopía y la detección de antígenos, presentan limitaciones notables. El cultivo es laborioso y presenta baja sensibilidad, la microscopía carec....

Protocol

El uso de muestras clínicas fue aprobado por el comité de ética correspondiente (Número de Aprobación: ZYS-GCP-2025006). Todos los participantes proporcionaron un amplio consentimiento informado para el uso de sus datos y especímenes en la investigación. Todos los reactivos y consumibles utilizados en este protocolo están listados en elT de Materiales.

1. Recogida de muestras

1. Recoge entre 3 y 5 mL de líquido de esputo o lavado broncoalveolar en recipientes estériles y preséntalo para análisis con prontitud.

2. Preparación....

Results

Las curvas de amplificación representativas obtenidas mediante este ensayo de PCR fluorescente multiplex se muestran en las Figuras 1 y 2. La validez del ensayo se determinó en función de criterios de control predefinidos. En una ejecución válida, el control positivo produjo curvas de amplificación características en forma de S en los canales FAM, VIC, CY5 y ROX, con valores de umbral de ciclo (Ct) ≤ 33,7 en todos los canales de.......

Discussion

El protocolo multiplex de PCR en tiempo real establecido en este estudio proporciona un procedimiento estandarizado para la detección simultánea y rápida de tres patógenos fúngicos invasores clave (Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans y Pneumocystis jirovecii) en muestras clínicas de esputo. Este método permite la detección directa del ADN patógeno a partir de muestras clínicas. A diferencia de los enfoques diagnósticos tradicionales como el cultivo, la microscopía o la prueba serol.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 & mu; Puntas extendidas estériles de pipeta con punta de filtro en L (trasvasadas)	Xiaorui Biotecnología	S20221126
1000 y mu; Puntas de pipeta estériles L	Jiangsu Xinkang Medical Instrument Co., Ltd	241101
200 & mu; Puntas estériles de pipeta con filtro extendido L	Xiaorui Biotecnología	241001
Tubos de Lisis	Centro de Ciencias Biocientíficas y Ciencias del Centro Público de Pekín ZC Technology Co	F1040
Kit de detección de ácidos nucleicos para Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans y Pneumocystis jirovecii	Centro de Ciencias Biocientíficas y Ciencias del Centro Público de Pekín ZC Technology Co.	CT8143-48T
Reactivo de extracción de ácidos nucleicos	Centro de Ciencias Biocientíficas y Ciencias del Centro Público de Pekín ZC Technology Co	CN8053-B40T
Buffer de dilución de muestras	Centro de Ciencias Biocientíficas y Ciencias del Centro Público de Pekín ZC Technology Co	SP7065