Artículo de método

Detección por sonda fluorescente por PCR de Aspergillus Spp., Cryptococcus neoformans y Pneumocystis jirovecii

DOI:

10.3791/68819

⸱

8 de mayo de 2026

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Laboratory, Foshan Sanshui District People's Hospital, 2Organization and Personnel Department and Neurology Department, Foshan Sanshui District People's Hospital

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí presentamos un protocolo de pruebas clínicas basado en el método de sonda fluorescente PCR para la detección simultánea de Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans y Pneumocystis jirovecii.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un procedimiento estandarizado para la detección cualitativa de Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans y Pneumocystis jirovecii en muestras clínicas de esputo utilizando un kit de detección de ácidos nucleicos con sonda fluorescente por PCR. El procedimiento implica la recogida de muestras clínicas, el pretratamiento por licuefacción alcalina, la extracción automática de ácidos nucleicos y la detección por PCR en tiempo real por multiplexación. Aspergillus spp., C. neoformans y P. jirovecii se detectan utilizando sondas fluorescentes específicas de cada objetivo (canales FAM, VIC y CY5, respectivamente), con un control interno (canal ROX) integrado para garantizar la calidad. La validez del ensayo y la interpretación del resultado de la muestra se basan en valores de corte definidos del umbral del ciclo (Ct). Un control positivo debe mostrar curvas de amplificación en forma de S con Ct ≤ 33,7 en todos los canales, mientras que el control negativo no debe mostrar amplificación. Para muestras clínicas, un valor de Ct ≤ 33,7 en el canal FAM indica positividad para Aspergillus spp., y un valor de Ct ≤ 36 en los canales VIC o CY5 indica positividad para C. neoformans o P. jirovecii, respectivamente.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las infecciones fúngicas invasivas, como las causadas por Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans y Pneumocystis jirovecii, representan una amenaza significativa para los pacientes inmunodeprimidos, lo que conduce a una alta morbilidad y mortalidad. Un diagnóstico oportuno y preciso es fundamental para iniciar la terapia antifúngica adecuada y mejorar los resultadosclínicos 1. Los métodos diagnósticos convencionales, como el cultivo, la microscopía y la detección de antígenos, presentan limitaciones notables. El cultivo es laborioso y presenta baja sensibilidad, la microscopía carece de identificación a nivel de especie y depende del operador, mientras que los ensayos de antígenos (por ejemplo, galactomanano, β-D-glucano) pueden mostrar reactividad cruzada y un rendimiento inconsistente. El diagnóstico molecular, especialmente la PCR en tiempo real, puede cubrir algunas de estas lagunas al ofrecer tiempos de respuesta más rápidos y el potencial de alta sensibilidad y especificidad. Los avances en la PCR multiplex permiten además la detección simultánea de múltiples patógenos a partir de una sola muestra, mejorando la eficiencia diagnóstica.

Este protocolo describe un ensayo PCR con sonda fluorescente multiplex para detectar cualitativamente ADN de Aspergillus spp., C. neoformans y P. jirovecii en muestras de esputo humano, atacando regiones conservadas del gen de ARNr 18S (Aspergillus spp.), el gen ITS (C. neoformans) y el gen de ARNr mtLSU (P. jirovecii). Las características clave de este método incluyen una sensibilidad analítica definida: el límite de detección para Aspergillus spp., C. neoformans y P. jirovecii es de 1.500 copias/mL; Especificidad de cebador/sonda: Los cebadores y sondas específicos del objetivo minimizan la reactividad cruzada con ADN humano u otra flora común; Control robusto de la contaminación: la incorporación de sistemas dUTP-UDG (uracil-ADN glicosilasa) previene eficazmente la contaminación acumulada de amplicones PCR previos, una característica crítica para mantener la fiabilidad del ensayo en un entorno de laboratorioclínico 2; control integrado del proceso: un control interno endógeno dirigido al gen RP (proteína ribosómica) humana, marcado con fluoróforo ROX, se coamplifica para monitorizar la integridad de la extracción de ácidos nucleicos e identificar posibles inhibiciones por PCR, reduciendo así los falsosnegativos 3. Este enfoque está respaldado por directrices establecidas para el aseguramiento de la calidad en el diagnósticomolecular 4,5. El protocolo es aplicable principalmente a muestras respiratorias (esputo/BALF) de poblaciones de alto riesgo, como pacientes de hematología-oncología o receptores de trasplantes. También se discuten posibles limitaciones, incluyendo falsos positivos por contaminación ambiental o una menor sensibilidad debido a una dilución excesiva de la muestra, junto con estrategias de mitigación.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El uso de muestras clínicas fue aprobado por el comité de ética correspondiente (Número de Aprobación: ZYS-GCP-2025006). Todos los participantes proporcionaron un amplio consentimiento informado para el uso de sus datos y especímenes en la investigación. Todos los reactivos y consumibles utilizados en este protocolo están listados en elT de Materiales.

1. Recogida de muestras

  1. Recoge entre 3 y 5 mL de líquido de esputo o lavado broncoalveolar en recipientes estériles y preséntalo para análisis con prontitud.

2. Preparación de reactivos

NOTA: Estos pasos se realizaron en la sala de preparación de reactivos.

  1. Saca el kit de detección del congelador a -28 °C y descongela completamente a temperatura ambiente (25–30 °C) durante 30 minutos.
  2. Calcular el número total de reacciones (N): N = número de muestras de prueba (n) + controles positivos/negativos (2) + 1
  3. Prepara la mezcla de reacción en un tubo estéril de microcentrífuga. Para una reacción única: 35 μL de mezcla de amplificación de ácidos nucleicos + 5 μL de mezcla cebador-sonda, vórtice a fondo y centrifugar brevemente.
  4. Alicuota de 40 μL de la mezcla de reacción en cada tubo de PCR (según el protocolo del fabricante del kit) y transfiere a la ventana de paso de la sala de procesamiento de muestras.

3. Procesamiento de muestras

NOTA: Estos pasos se realizaron en la Sala de Procesamiento de Muestras. Eliminación de residuos: Descarta el sobrenadante del paso 3.2.2 y otros residuos líquidos que contienen NaOH en un contenedor designado para residuos químicos.

  1. Licuefacción
    1. Añade líquido de lavado esputo/broncoalveolar (BALF) a un tubo de tapón roscado de 50 mL.
    2. Añadir 1–2 volúmenes de solución digestiva con NaOH al 4% (en relación con la viscosidad del esputo).
      PRECAUCIÓN: NaOH es corrosivo. Evita el contacto con la piel y los ojos.
    3. Aprieta la tapa, usa el vórtice durante 1 minuto e incuba en un armario de bioseguridad a temperatura ambiente durante 15–20 minutos.
  2. Enriquecimiento
    1. Centrifugar muestras licuadas a 3.000 rpm durante 5 minutos.
    2. Descartar el sobrenadante usando una pipeta, reteniendo 1.000 μL de sedimento.
    3. Pulveriza bien el sedimento.
  3. Lisis
    1. Transfiere 500 μL de sedimento a un tubo de lisis. Vórtice durante 10 minutos y centrifugación breve.
  4. Extracción
    NOTA: Eliminación de residuos: Las placas, puntas y tubos de extracción usados que contactaron con muestras biológicas deben ser descartados en un contenedor aprobado para residuos biopeligrosos.
    1. Transfiere todo el sobrenadante lisato y 100 μL de controles negativos/positivos a la Columna 2 de la placa de extracción.
    2. Realizar la extracción de ácidos nucleicos utilizando un sistema automatizado de extracción de ácidos nucleicos con el programadesignado 6.
  5. Carga de muestras
    1. Transfiere 10 μL de ácido nucleico extraído (Columna 6) y controles a tubos de PCR. Centrifugar brevemente y transferirlo a la ventana de paso de la sala de amplificación.

4. Amplificación de ácidos nucleicos

NOTA: Estos pasos se realizaron en la Sala de Amplificación.

  1. Carga los tubos de PCR en el instrumento automatizado de amplificación nucleica y selecciona la plantilla de amplificación adecuada.
  2. Asignar canales de detección: Aspergillus spp.: canal FAM; C. neoformans: canal VIC; P. jirovecii: canal CY5; Control interno: ROXcanal 7, 8 y 9.
  3. Establece nombres de ejemplo y ejecuta el programa.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las curvas de amplificación representativas obtenidas mediante este ensayo de PCR fluorescente multiplex se muestran en las Figuras 1 y 2. La validez del ensayo se determinó en función de criterios de control predefinidos. En una ejecución válida, el control positivo produjo curvas de amplificación características en forma de S en los canales FAM, VIC, CY5 y ROX, con valores de umbral de ciclo (Ct) ≤ 33,7 en todos los canales de...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo multiplex de PCR en tiempo real establecido en este estudio proporciona un procedimiento estandarizado para la detección simultánea y rápida de tres patógenos fúngicos invasores clave (Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans y Pneumocystis jirovecii) en muestras clínicas de esputo. Este método permite la detección directa del ADN patógeno a partir de muestras clínicas. A diferencia de los enfoques diagnósticos tradicionales como el cultivo, la microscopía o la prueba serol...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Queremos agradecer al Departamento de Laboratorio Clínico del Hospital Popular del Distrito de Shanshui en Foshan por proporcionar el equipo y el apoyo técnico.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10 & mu; Puntas extendidas estériles de pipeta con punta de filtro en L (trasvasadas)Xiaorui BiotecnologíaS20221126
1000 y mu; Puntas de pipeta estériles LJiangsu Xinkang Medical Instrument Co., Ltd241101
200 & mu; Puntas estériles de pipeta con filtro extendido LXiaorui Biotecnología241001
Tubos de LisisCentro de Ciencias Biocientíficas y Ciencias del Centro Público de Pekín ZC Technology CoF1040
Kit de detección de ácidos nucleicos para Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans y Pneumocystis jiroveciiCentro de Ciencias Biocientíficas y Ciencias del Centro Público de Pekín ZC Technology Co.CT8143-48T
Reactivo de extracción de ácidos nucleicosCentro de Ciencias Biocientíficas y Ciencias del Centro Público de Pekín ZC Technology CoCN8053-B40T
Buffer de dilución de muestrasCentro de Ciencias Biocientíficas y Ciencias del Centro Público de Pekín ZC Technology CoSP7065

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morrissey, C. O., et al. Aspergillus fumigatus—a systematic review to inform the World Health Organization priority list of fungal pathogens. Med Mycol. 62 (6), 6(2024).
  2. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., Watson, R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y). 11 (9), 1026-1030 (1993).
  3. Longo, M. C., Berninger, M. S., Hartley, J. L. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in PCR. Gene. 93 (1), 125-128 (1990).
  4. Vandesompele, J., et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 3 (7), research0034.1-research0034.12 (2002).
  5. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  6. Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
  7. Loeffler, J., et al. Quantification of fungal DNA by using fluorescence resonance energy transfer and the LightCycler system. J Clin Microbiol. 38 (10), 3463-3466 (2000).
  8. Bovers, M., et al. Six monophyletic lineages identified within Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii by multi-locus sequence typing. Fungal Genet Biol. 43 (5), 353-359 (2008).
  9. Wakefield, A. E., et al. Detection of Pneumocystis carinii with DNA amplification. Lancet. 336 (8726), 751-753 (1990).
  10. Schrader, C., et al. PCR inhibitors—occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
  11. White, T. J., et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, J. J. , Academic Press. 315-322 (1990).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Detecci n por PCRPCR multiplex en tiempo realextracci n de cidos nucleicosmuestras cl nicas de esputociclo umbralcontrol interno

Artículos relacionados