Artículo de método

Investigación del mecanismo de modulación del LINC00511 mediada por β-elemene para suprimir la resistencia al cisplatino en el cáncer de pulmón

DOI:

10.3791/68825

⸱

19 de agosto de 2025

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1School of Pharmacy, Changchun University of Traditional Chinese Medicine, 2Health Care Department, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 3Teaching Department, The Third Affiliated Clinical Hospital of Changchun University of Chinese Medicine, 4The Research Center of The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 5Northeast Asia Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine, 6Affiliated Hospital of Changchun University of Chinese Medicine

En este artículo

Resumen

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La resistencia al cisplatino (DDP) limita la eficacia de la quimioterapia en el cáncer de pulmón. Este estudio tuvo como objetivo dilucidar cómo β-Elemene (β-Ele) revierte la resistencia en las células A549 / DDP al regular a la baja LINC00511. Los análisis in vitro y RNA-seq mostraron que esta regulación inhibe la glucólisis aeróbica y la señalización de Wnt / β-catenina, lo que ofrece una estrategia potencial para superar la quimiorresistencia.

Resumen

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La resistencia al cisplatino limita significativamente la eficacia de la quimioterapia en el cáncer de pulmón de células no pequeñas, lo que requiere el desarrollo de nuevas estrategias para superar esta barrera. Este estudio in vitro tuvo como objetivo dilucidar el mecanismo por el cual β-Ele revierte la resistencia al cisplatino en células de adenocarcinoma de pulmón a través de la glucólisis mediada por LINC00511 y las vías de señalización Wnt / β-catenina. La línea celular de adenocarcinoma de pulmón humano resistente al cisplatino (A549/DDP), con sobreexpresión LINC00511 o eliminación, se estableció mediante transfección de plásmidos. La eficiencia de la transfección se evaluó mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR) para detectar los niveles de expresión de LINC00511. La evaluación mediante el ensayo de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) indicó una inhibición significativa mediada por β-Ele de la proliferación de células A549 / DDP. Un análisis adicional de RNA-seq reveló que el efecto inhibidor de β-Elemene sobre la resistencia al cisplatino estaba estrechamente asociado con la interferencia de la glucólisis celular y la supresión de la activación de la vía de señalización Wnt / β-catenina. El análisis de Western blot de proteínas clave, incluido el transportador de glucosa 1 (GLUT1), la piruvato quinasa M2 (PKM2), la lactato deshidrogenasa A (LDHA), la β-catenina y la glucógeno sintasa quinasa 3β (GSK-3β), mostró que β-Elemene revirtió la resistencia al cisplatino al inhibir la glucólisis aeróbica y bloquear la activación de la vía de señalización Wnt / β-catenina a través de la regulación a la baja de LINC00511. En conjunto, estos resultados demuestran que β-Elemene supera la resistencia al cisplatino en el cáncer de pulmón al dirigirse a LINC00511 y su vía de glucólisis aeróbica / Wnt / β-catenina asociada. Esto establece un marco teórico para futuras investigaciones preclínicas y clínicas, al tiempo que revela posibles objetivos terapéuticos.

Introducción

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Entre los tumores malignos en todo el mundo, el cáncer de pulmón presenta tasas de incidencia y mortalidad excepcionalmente altas, caracterizadas por la transformación maligna y el crecimiento invasivo de las células epiteliales bronquiales 1,2. Según las características histopatológicas, el cáncer de pulmón se clasifica como carcinoma de células no pequeñas (CPCNP) o carcinoma de células pequeñas (CPCP)3. Cabe mencionar que el CPNM representa aproximadamente el 85% del total de casos de cáncer de pulmón 4,5. Como estándar quimioterapéutico de primera línea para el CPCNP, el cisplatino (DDP) es clínicamente indispensable6. Sin embargo, las observaciones clínicas han revelado que las células tumorales pueden desarrollar resistencia a los medicamentos a través de múltiples mecanismos, principalmente la activación de las vías de escape inmunológico, las mutaciones en los genes diana de los medicamentos y la desregulación de las vías del metabolismo de los medicamentos 7,8,9.

Los ARN largos no codificantes (lncRNA) representan transcripciones > 200 nucleótidos (nt) que carecen de capacidad codificante de proteínas10. La evidencia acumulada indica que el lncRNA puede revertir la resistencia al cisplatino en las células tumorales a través de múltiples mecanismos, como funcionar como ARN endógenos competidores (ARNce) para esponjar los miARN y liberar sus genes diana11, modular las vías de señalización de la apoptosis12, participar en la reparación del daño del ADN13 y regular la autofagia celular14. Además, con el avance de la investigación sobre la reprogramación metabólica tumoral, ha surgido evidencia sustancial que demuestra que el lncRNA juega un papel regulador crítico en este proceso. El efecto Warburg, que denota glucólisis aeróbica, constituye una característica metabólica fundamental de las células malignas15. No solo suministra energía para la rápida proliferación celular, sino que también genera metabolitos intermedios que sirven como precursores para la biosíntesis, apoyando la síntesis de proteínas y lípidos para satisfacer las demandas del crecimiento tumoral maligno16. En el cáncer de pulmón, se ha confirmado que el lncRNA influye significativamente en la progresión tumoral y la resistencia a la quimioterapia al regular la vía de la glucólisis aeróbica17,18.

Entre estos, se ha informado que LINC00511, una molécula de lncRNA ampliamente estudiada en los últimos años, está estrechamente asociada con el inicio y desarrollo de diversos tumores malignos19. Estos hallazgos no solo aclaran los mecanismos específicos de la participación del lncRNA en la reprogramación metabólica tumoral, sino que también proporcionan una base teórica para las estrategias de tratamiento tumoral dirigidas al lncRNA, abriendo posibles vías terapéuticas.

Derivado de los rizomas de Curcuma zedoaria, β-Ele es un sesquiterpenoide bioactivo con eficacia antitumoral establecida. Nuestros estudios anteriores han demostrado que β-Ele sirve como un inhibidor selectivo de la vía de señalización PI3K / Akt / mTOR y produce un efecto sinérgico con el cisplatino al dirigirse al metabolismo tumoral. Suprimió significativamente el crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto de ratón NSCLC20. Investigaciones posteriores demuestran la capacidad de β-Ele para atenuar la glucólisis aeróbica en células de CPNM mediante la modulación del eje de señalización miR-301a-3p/AMPKα, lo que da lugar a resultados oncostáticos21. Sobre la base de nuestros hallazgos anteriores, hemos confirmado que LINC00511 atenúa la resistencia al cisplatino en el cáncer de pulmón; Sin embargo, el mecanismo de acción molecular exacto aún no se ha dilucidado por completo.

Teniendo en cuenta el papel fundamental de la glucólisis aeróbica en la reprogramación metabólica tumoral y el papel crítico de la LINC00511 en el desarrollo y la progresión tumoral, este estudio tiene como objetivo investigar si β-Ele puede revertir la resistencia al cisplatino en el cáncer de pulmón mediante la modulación de la vía de glucólisis aeróbica mediada por LINC00511.

La evidencia previa indica que β-Ele puede revertir la resistencia al cisplatino y mejorar sus efectos antitumorales al activar las vías apoptóticas22, regular la secreción de exosomas23 y detener el ciclo celular24. Sin embargo, estos mecanismos conocidos suelen exhibir efectos amplios y carecen de una regulación precisa de objetivos moleculares específicos, lo que limita su traducibilidad clínica. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de explorar estrategias novedosas que sean más específicas, tengan mecanismos bien definidos y demuestren un gran potencial de traducción clínica para superar la resistencia al cisplatino. En contraste con investigaciones anteriores que enfatizan las acciones biológicas inmediatas de β-Ele, este estudio caracteriza el impacto de β-Ele en el metabolismo de Warburg y la vía de señalización Wnt / β-catenina en células A549 / DDP a través de la regulación de vías moleculares mediadas por lncRNA, con el objetivo de dilucidar un mecanismo novedoso que subyace a su reversión de la quimiosensibilización en el cáncer de pulmón. Este artículo no solo descubre un nuevo enfoque para que β-Ele revierta la quimiorresistencia al dirigirse al lncRNA, sino que también proporciona una nueva base teórica y posibles objetivos de intervención para el tratamiento clínico del cáncer de pulmón. Estos hallazgos, a través de su elucidación detallada de un objetivo molecular específico (LINC00511) y vías de señalización clave (Warburg y Wnt / β-catenina), demuestran un potencial traslacional clínico significativamente mejorado. Se espera que proporcionen una base científica sólida para mejorar la sensibilidad a la quimioterapia en pacientes con cáncer de pulmón y mejorar su calidad de vida, así como para avanzar en el desarrollo de estrategias de tratamiento de precisión para el cáncer de pulmón.

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Protocolo

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1. Preparación del disolvente

  1. Preparación de la solución de medio para células A549/DDP: Cultivar células A549/DDP en el medio completo F-12K de Ham (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles), complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS, consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles), solución de penicilina-estreptomicina al 1% (P/S, consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) y 2 μg/ml de cisplatino (DDP, consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles).
    1. Preparación de la solución de medio completo: Prepare una solución de medio completo agregando 50 ml de FBS y 5 ml de P/S a 500 ml de medio F-12K de Ham, seguido de una mezcla completa.
    2. Preparación de una solución media completa que contenga cisplatino: Pese 1 mg de cisplatino en polvo (DDP, consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) y disuélvalo en 1 ml de agua doble destilada (ddH2O) para preparar la solución madre. Añadir 200 μl de la solución madre a 100 ml de medio completo (preparado de acuerdo con el paso 1.1.1) y mezclar bien para preparar una solución de trabajo de medio completo que contenga 2 μg/ml de cisplatino.
      NOTA: Dado que el cisplatino es una sustancia citotóxica, realice todos los procedimientos en una campana extractora o gabinete de bioseguridad y use equipo de protección como guantes, batas de laboratorio y gafas.
  2. Solución de administración de β-Ele: La concentración del fármaco utilizada en este estudio se basó en los resultados de experimentos previos realizados por nuestro equipo de investigación20,21. Disuelva 1 mg de β-Ele (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) en 20 μL de dimetilsulfóxido (DMSO, consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) para preparar la solución madre. Diluir la solución madre a 25 ml utilizando medio completo para obtener una solución de trabajo β-Ele de 40 μg/ml.
    NOTA: Dado que el DMSO puede mejorar la absorción de otras sustancias a través de la piel, realice todos los pasos de la operación en una campana extractora o gabinete de bioseguridad y use equipo de protección como guantes, ropa de laboratorio y gafas.

2. Cultivo celular 

  1. Utilice la línea celular resistente al cisplatino para adenocarcinoma de pulmón humano (A549/DDP, Procell, consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) en este estudio. Confirme que esta línea celular ha sido identificada mediante análisis de repeticiones cortas en tándem (STR) y se ha emparejado con éxito con linajes estándar en ATCC y otras bases de datos.
    1. Para el método de análisis STR, recolecte aproximadamente 1 x 106 células y extraiga ADN genómico utilizando un kit de extracción de ADN comercial (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles).
    2. Emplear un sistema STR multiplex validado adecuado para la tipificación de ADN para amplificar 20 loci STR junto con el locus determinante de género. Realice la amplificación por PCR en las siguientes condiciones de ciclo térmico: desnaturalización inicial a 95 °C durante 2 min, seguida de 29 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 s, recocido a 59 °C durante 45 s y extensión a 72 °C durante 45 s, con un paso de extensión final a 72 °C durante 10 min.
    3. Analice los productos de PCR resultantes mediante electroforesis capilar utilizando un analizador genético automatizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Aquí, la tipificación de alelos se realizó utilizando un software de análisis de fragmentos (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles), con un umbral de detección de pico establecido en 150 unidades de fluorescencia relativa (RFU).
      NOTA: El perfil STR de 20 locus generado se comparó con los perfiles de referencia de las líneas celulares A549/DDP disponibles en bases de datos públicas. Una tasa de compatibilidad superior al 80% se consideró indicativa de homología. La ausencia de picos de alelos extraños confirmó aún más la ausencia de contaminación cruzada.
  2. Recupere las células del nitrógeno líquido y colóquelas en un baño de agua a 37 °C para una rápida descongelación hasta que el líquido se derrita por completo. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 5 ml, agregue dos volúmenes de solución de medio completo y vuelva a suspender suavemente la mezcla. Después de la centrifugación (358 × g, 5 min, temperatura ambiente), deseche el sobrenadante con cuidado.
    NOTA: Cuando utilice tubos de criopreservación celular de nitrógeno líquido, use guantes anticongelantes y gafas protectoras o una mascarilla, y no mire hacia la boca del tubo.
  3. Vuelva a suspender el sedimento celular en 1 ml de medio completo con un pipeteo suave, luego diluya la suspensión a 10 ml agregando 9 ml de medio completo. Siembre las células en placas de cultivo celular de 100 mm y cultívelas en una incubadora (consulte la tabla de materiales para obtener más detalles) a 37 ° C y 5% de CO2. La relación de paso celular se mantuvo entre 1:2 y 1:3.
    NOTA: El cisplatino es un fármaco quimioterapéutico de platino con citotoxicidad. En este método, las células A549/DDP se cultivan con un medio que contiene cisplatino. Por lo tanto, recoja el medio de cultivo de residuos que contiene cisplatino en un barril especial de líquido residual y envíelo regularmente a la empresa de tratamiento de residuos peligrosos para su eliminación profesional.

3. Transfección de plásmidos 

  1. Emplee una construcción de plásmido para la sobreexpresión de LINC00511 y un LINC00511 de selección de ARNip específico del gen (ID del gen: 400619; ID de transcripción: NR_033876.1) para la transfección celular. Las secuencias de ARNip utilizadas se proporcionan en la Tabla 1.
Secuencias de ARNip
NombreSentido 5'-3'Antisentido 5'-3'
LINC00511-Homo-1625
CAGCUGUGAACUUCCUUUATT
UAAAGGAAGUUCACAGCUGTT

Tabla 1: lista de secuencias de ARNip

  1. Seleccione al azar las células A549/DDP que hayan pasado a la tercera generación después de la reanimación y las inocule uniformemente en placas de 6 pocillos a una densidad de 1 x 105 células/pocillo. Cada pozo se numeró al azar y los pozos se asignaron a grupos experimentales en función de estos números aleatorios.
  2. Transfecte las células con un reactivo de transfección (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) cuando su densidad alcance aproximadamente el 70%.
    1. Prepare la solución de transfección de ARNip.
      1. Mezcle 250 μL de medio esencial mínimo optimizado (Opti-MEM, consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) con 5 μL de reactivo de transfección, agite suavemente 3-5x para garantizar la homogeneidad e incube a temperatura ambiente durante 5 min.
      2. Diluya 5 μL de siRNA (50 nM) en 250 μL de Opti-MEM, vórtice suavemente de 3 a 5 veces para mezclar bien. Combine el reactivo de transfección diluido con la solución de ARNip e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos para formar el complejo de transfección de ARNip.
    2. Prepare la solución de transfección de plásmidos.
      1. Mezcle 250 μL de Opti-MEM con 5 μL de reactivo de transfección, agite suavemente 3-5x para garantizar la homogeneidad e incube a temperatura ambiente durante 5 min.
      2. Diluya 2 μg de plásmido en 250 μL de Opti-MEM, vórtice suavemente de 3 a 5 veces para asegurar una mezcla completa. Combine el reactivo de transfección diluido con la solución plásmida e incube a temperatura ambiente durante 20 min para preparar la solución de transfección plásmida.
      3. Agregue la solución de transfección de ARNip y la solución de transfección de plásmidos a las placas de 6 pocillos, respectivamente. Agregue 1.500 μL de medio completo a cada pocillo. Mezcle suavemente las placas celulares antes y después de la adición para garantizar una distribución uniforme. Incubar las placas a 37 °C, 5% de CO2 durante 24 h después de la transfección antes del análisis.

4. Detección de la eficiencia de la transfección mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR)

NOTA: Tome las células después de la transfección durante 24 h en el paso 3.3 para la detección de qRT-PCR de acuerdo con el siguiente procedimiento. Todos los experimentos se realizaron en tres réplicas biológicas independientes (n = 3).

  1. Extracción de ARN
    1. Utilice un kit de extracción de ARN ultrapuro (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles). Deseche el medio en la placa de 6 pocillos de acuerdo con las instrucciones del kit y lave las celdas con PBS. Posteriormente, agregue 500 μL de solución reactiva de lisis a base de fenol-guanidina a cada pocillo, sople suavemente las células con la punta de la pistola para suspenderlas completamente y transfiera la mezcla a un tubo de centrífuga. Déjelo durante 5 minutos para asegurar la lisis completa de la muestra celular.
    2. Agregue 100 μL de reactivo de lisis de isotiocianato de fenol-guanidina, agite bruscamente durante 15 s y déjelo durante 2 min a temperatura ambiente. Finalmente, aspirar cuidadosamente la fase acuosa superior, transferirla a la columna de adsorción y centrifugar a 13.400 x g durante 10 min a 4 °C.
    3. Unir el ARN a la membrana de gel de sílice. Lávelo con Buffer RW1 y Buffer RW2 para eliminar las proteínas. Posteriormente, agregue DNasa I para digerir el ADN residual y realice un lavado secundario con Buffer RW2 para garantizar la eliminación completa de las impurezas. Finalmente, recolecte muestras de ARN eluyendo ARN con agua libre de ARNasa y centrifugando a 13,400 x g durante 1 min.
  2. Mida la concentración de ARN.
    1. Coloque cada 1,5 μl de solución de ARN de muestra en un detector de microácidos nucleicos (consulte la tabla de materiales para obtener más detalles) y lea los valores A260/A280.
      NOTA: Si los valores medidos de A260/A280 están dentro del rango de 1,8 a 2,0 y la concentración de ARN está entre 20 ng/μL y 200 ng/μL, esto indica que la calidad del ARN es aceptable y puede utilizarse para experimentos posteriores.
    2. Con base en las mediciones, diluya la solución de ARN con agua de pirocarbonato de dietilo (DEPC) para garantizar concentraciones de ARN consistentes para todas las muestras, utilizando la concentración mínima de ARN medida como punto de referencia, seguida de experimentos de PCR.
  3. Transcripción inversa de ARN
    1. Utilice el ARN total extraído como plantilla y sintetice ADNc de acuerdo con las instrucciones del kit de transcripción inversa (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles). Prepare el sistema de reacción de acuerdo con los requisitos del kit.
    2. Agregue la solución de ARN extraída y el sistema de reacción a un tubo de ocho filas y coloque dos pocillos replicados en cada grupo. Inicie la reacción con condiciones secuenciales: 15 min de incubación a 37 °C, 5 s de desnaturalización térmica a 85 °C, 5 min de enfriamiento a 4 °C.
  4. Reacción de PCR
    1. Realice la amplificación de PCR en un sistema de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) utilizando la mezcla maestra de PCR premezclada a base de SYBR Green (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles). Utilice GADPH como gen de referencia, con las secuencias de cebadores enumeradas en la Tabla 2, y prepare la mezcla de reacción de la siguiente manera: agregue secuencialmente 0,4 μL del cebador correspondiente, 2 μL de plantilla de ADNc y la mezcla de reacción a un tubo de tira de ocho pocillos para lograr el volumen de reacción final.
    2. Amplificación de PCR de ejecución: 95 °C 30 s (1 ciclo), 95 °C 5 s (40 ciclos), 60 °C 20 s (40 ciclos). Calcule los niveles de expresión relativa de los genes diana utilizando el método 2 -ΔΔCt 25. Repita de forma independiente todos los experimentos tres veces para garantizar la confiabilidad de los datos.
      NOTA: Los desechos químicos generados durante los procedimientos experimentales deben recolectarse en contenedores designados para desechos peligrosos y ser eliminados por servicios certificados de manejo de desechos peligrosos de acuerdo con las políticas institucionales.
Secuencias de cebadores
CebadorSecuencia (5'-3')
humano-LINC00511-FTTTCCCAGCACAGCTCAATC
humano-LINC00511-RTCCCTTCTCCCTCGGTCA
GAPDH-FAATCCCATCACCATCTTCCA
GAPDH-RAAATGAGCCCCAGCCCCTTCT

Tabla 2: Secuencias de cebadores para ensayos de PCR

5. Detección de EdU

  1. Evalúe el efecto de la expresión alterada de LINC00511 en la proliferación de células A549 / DDP utilizando un kit de ensayo EdU (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles).
    1. Seleccione aleatoriamente células A549 / DDP que hayan pasado a la tercera generación después de la reanimación e inocularlas uniformemente en placas de 24 pocillos a una densidad de 2 x 104 células / pocillo.
      NOTA: Aquí, todos los experimentos se realizaron en tres réplicas biológicas independientes (n = 3).
    2. Numere aleatoriamente cada pocillo y asigne los pocillos a uno de los cuatro grupos experimentales en función de estos números aleatorios: grupo de control, grupo de β-Ele, grupo de β-Ele + LINC00511 sobreexpresión (β-Ele + OV-LINC00511) y grupo de β-Ele + LINC00511 derribo (β-Ele + si-LINC00511).
  2. Cuando la densidad celular alcanza aproximadamente el 70%, realice la transfección de plásmidos y el tratamiento de interferencia de acuerdo con el paso 3.3. Después de 24 h de transfección, deseche el medio original y agregue 1 ml de solución de medio que contenga β-Ele (40 μg/mL) a cada pocillo del grupo de tratamiento farmacológico.
  3. Incubar las células con EdU para su etiquetado después de tratarlas con 40 μg/mL de β-Ele durante 24 h. Luego fije las células con paraformaldehído al 4% durante 10 min y permeabilice con Triton X-100 al 0,5%.
  4. Agregue la solución de reacción de clic (preparada disolviendo un vial del reactivo Click Additive provisto por el kit en 1,3 ml de agua desionizada con una mezcla completa) en la oscuridad y mantenga la reacción en la oscuridad durante 30 min. Lave las células con PBS después de que se complete la reacción, seguido de la tinción de Hoechst durante 5 min. Finalmente, observe los resultados utilizando microscopía de fluorescencia (Figura 1 y Figura 2).
    NOTA: El DMSO es altamente permeable y un líquido inflamable. En este esquema, la solución de administración de β-Ele contiene DMSO. Por lo tanto, recoja la solución de administración de β-Ele en un barril especial de líquido residual después de su uso y entréguelo a la empresa de tratamiento de residuos peligrosos para su eliminación profesional de forma regular.

6. Detección del contenido de glucosa 

NOTA: Todos los experimentos se realizaron en tres réplicas biológicas independientes (n = 3).

  1. Seleccione al azar las células A549/DDP que hayan pasado a la tercera generación después de la reanimación y las inocule uniformemente en placas de 6 pocillos a una densidad de 1 x 105 células/pocillo. Numere aleatoriamente cada pocillo y asigne los pocillos a grupos experimentales en función de estos números aleatorios.
  2. Cuando la densidad celular alcance aproximadamente el 70%, proceda con la transfección e interferencia de plásmidos como se describe en el paso 3.3. Después de 24 h de transfección, tratar las células de los grupos tratados con 40 μg/mL de β-Ele.
  3. Después de 24 h de tratamiento farmacológico, recoja el medio de cultivo superior de las células y centrifugue a 1000 × g durante 5 min. Recoge el sobrenadante. De acuerdo con las instrucciones del kit de prueba de glucosa (consulte la tabla de materiales para obtener más detalles), prepare la solución de reacción y mézclela bien con el sobrenadante.
  4. Coloque las muestras en placas de 96 pocillos con cinco pocillos replicados por grupo. Agitar suavemente las placas e incubarlas a 37 °C durante 10 min. Mida la absorbancia de cada pocillo utilizando un lector de microplacas a una longitud de onda de 505 nm y calcule el contenido de glucosa utilizando la fórmula proporcionada en el kit de prueba:
    figure-protocol-1
    Aquí, Cestándar = 5,55 mmol / L, N = factor de dilución.
    NOTA: Los desechos químicos generados durante los procedimientos experimentales deben recolectarse en contenedores designados para desechos peligrosos y ser eliminados por servicios certificados de manejo de desechos peligrosos de acuerdo con las políticas institucionales.

7. Detección del contenido de ácido láctico 

NOTA: Todos los experimentos se realizaron en tres réplicas biológicas independientes (n = 3).

  1. Seleccione al azar las células A549/DDP que hayan pasado a la tercera generación después de la reanimación y las inocule uniformemente en placas de 6 pocillos (1 × 105 células/pocillo). Numere aleatoriamente cada pocillo y asigne los pocillos a grupos experimentales en función de estos números aleatorios. Cuando la densidad celular alcance aproximadamente el 70%, proceda con la transfección e interferencia de plásmidos como se describe en el paso 3.3. 24 h después de la transfección, tratar las células de los grupos tratados con 40 μg/mL de β-Ele.
  2. Después de 24 h de tratamiento farmacológico, recoger el medio de cultivo superior de las células y centrifugarlo a 1000 x g durante 5 min. Recoge el sobrenadante. De acuerdo con las instrucciones del kit de prueba de ácido láctico (consulte la tabla de materiales para obtener más detalles), prepare la solución de reacción y mézclela bien con el sobrenadante.
  3. Agregue un total de 250 μL de muestra a cada pocillo de una placa de 96 pocillos, estableciendo cinco pocillos replicados para cada grupo. Agitar suavemente el plato e incubarlo a 37 °C durante 10 min. Mida la absorbancia de cada pocillo a una longitud de onda de 530 nm utilizando un lector de microplacas (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) y calcule el contenido de lactato utilizando la fórmula proporcionada en el kit de prueba:
    figure-protocol-2
    Aquí, Cestándar = 3 mmol / L, N = factor de dilución.
    NOTA: Los desechos químicos generados durante los procedimientos experimentales deben recolectarse en contenedores designados para desechos peligrosos y ser eliminados por servicios certificados de manejo de desechos peligrosos de acuerdo con las políticas institucionales.

8. Secuenciación de ARN a granel

  1. Establecer una base de datos de ejemplo
    1. Seleccione las células A549/DDP para el experimento y divídalas en los siguientes grupos: grupo de control, grupo DDP, grupo β-Ele (40 μg/ml) + grupo DDP (48 μM), grupo β-Ele+ DDP + OV-LINC00511 y grupo β-Ele + DDP + LINC00511 si-. Incluya 3 muestras en cada grupo.
    2. Extraiga el ARN total de cada grupo celular. Utilice un kit de aislamiento de ARNm basado en perlas magnéticas (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) para enriquecer el ARNm eucariota, en el que las perlas recubiertas de Oligo (dT) se unen selectivamente a las colas de poli (A) del ARNm a través del emparejamiento de bases A-T. Agregue tampón de fragmentación (1 μL / μg de ARN, consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) e incube a 94 ° C durante 7 min para fragmentar el ARNm en segmentos cortos.
    3. Proceda con la síntesis de ADNc de la primera cadena utilizando cebadores hexámeros aleatorios de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la síntesis de ADNc de segunda cadena, agregue cantidades adecuadas de tampón de reacción, ARNasa H y ADN polimerasa I para completar el proceso.
    4. Realice la reparación final y la cola A en ADNc bicatenario mediante incubación a 25 °C durante 30 min (reparación final), seguida inmediatamente de 72 °C durante 30 min (cola A). Ligar adaptadores de secuenciación a los fragmentos reparados en el extremo.
    5. Purifique y seleccione el tamaño de los productos ligados con perlas de sílice magnéticas modificadas con carboxilo (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles). Finalmente, construya la biblioteca de secuenciación mediante amplificación por PCR.
    6. Después de la preparación de la muestra, analice la biblioteca de secuenciación en la plataforma DNBSEQ-T7 (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles). Cargue la muestra en un chip de micromatriz de matriz con patrones para la secuenciación.
      NOTA: El instrumento recopiló, leyó e identificó señales ópticas utilizando un sistema de imágenes de alta resolución para determinar la información de secuencia de bases individuales. Posteriormente, realice ciclos de secuenciación adicionales para obtener la secuencia de las siguientes bases. Después de varios ciclos, se generaron los datos de secuenciación sin procesar.
  2. Análisis bioinformático
    1. Secuenciar las muestras en la máquina para obtener los datos sin procesar, también conocidos como datos fuera de la máquina. Además, procese los datos de secuenciación usando fastp (v 0.21.0). Elimine las lecturas que contengan secuencias de adaptador de 3' y elimine las lecturas de baja calidad con una puntuación de calidad media inferior a Q20 como parte de los criterios de filtrado primarios. Realice todos los análisis posteriores basados en los datos limpios y de alta calidad.
      NOTA: Realice el filtrado inicial de los datos de secuenciación utilizando fastp. Consulte la documentación oficial de conjuntos de datos transcriptómicos (https://github.com/OpenGene/fastp#rna-seq-processing) para conocer los parámetros específicos de la línea de comandos.
    2. Utilice FastQC (v 0.12.0) para evaluar la calidad de los datos de secuenciación limpios. Los requisitos de calidad son los siguientes: al menos el 90% de las bases deben tener una puntuación de calidad superior a Q20, y el porcentaje de secuencias adaptadoras restantes no debe exceder el 1%. Los datos que cumplen estos criterios se consideran calificados y se pueden utilizar para el análisis posterior.
      NOTA: Evalúe la calidad de los datos de secuenciación limpiados utilizando FastQC, siguiendo las pautas oficiales (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/).
  3. Análisis de expresión génica
    1. Utilice el software DESeq2 para realizar análisis de expresión diferencial entre los dos grupos de comparación.
      1. Primero, ingrese los datos en el software para construir un conjunto de datos DESeq. Luego, filtre los genes con un recuento total de menos de 10 en todas las muestras.
      2. Finalmente, realice el análisis diferencial de genes y extraiga los resultados. Las condiciones para el cribado de genes expresados diferencialmente son las siguientes: el cambio de pliegue en la expresión |log2FoldChange| > 1, y la significación padj ≤ 0,05.
        NOTA: Para conocer los pasos de operación detallados del software DESeq2, consulte los pasos detallados en el sitio web oficial: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html.

9. Detección de cambios en el nivel de expresión de proteínas mediante Western blot (WB) 

NOTA: Todos los experimentos se realizaron en tres réplicas biológicas independientes (n = 3).

  1. Realice Western blot para cuantificar los niveles de expresión de proteínas celulares.
    1. Seleccione al azar las células A549/DDP que hayan pasado a la tercera generación después de la reanimación y las inocule uniformemente en placas de 6 pocillos a una densidad de 1 x 105 células/pocillo.
    2. Numere aleatoriamente cada pocillo y asigne los pocillos a uno de los seis grupos experimentales en función de estos números aleatorios: Control, β-Ele, OV-LINC00511, si-LINC00511, β-Ele + OV-LINC00511 y β-Ele + si-LINC00511.
    3. Cuando la densidad celular alcanza aproximadamente el 70%, realice la transfección de plásmidos y la interferencia como se describe en el paso 3.3. Después de 24 h de transfección, exponga al grupo de tratamiento a β-Ele (40 μg/mL), mientras proporciona medio fresco al grupo de control. Cultiva ambos grupos durante 24 h adicionales.
    4. Posteriormente, recoger los pellets celulares por centrifugación a 1675 × g durante 5 min. Lisar cada grupo de células con 500 μL de tampón de lisis RIPA que contenga 1 mM de PMSF en hielo durante 30 min (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles).
  2. Centrifugar los lisados celulares a 13.400 × g durante 10 min a 4 °C y recoger el sobrenadante. Mida las concentraciones de proteínas con el kit de ensayo de concentración de proteínas BCA (consulte la tabla de materiales para obtener más detalles). Separe cantidades iguales de muestras de proteínas con un 10% de SDS-PAGE y transfiéralas a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) mediante electroforesis.
  3. Sumerja las membranas en una solución bloqueante (leche desnatada al 5%/solución salina tamponada con Tris con Tween-20 (TBST) al 0,1%) durante 2 h a temperatura ambiente e incube durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra GLUT1, PKM2, LDHA, β-catenina, GSK-3β (1:1000) y β-actina (1:2000, consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles).
    1. Al día siguiente, lave las membranas tres veces con TBST, 5 min cada una, a temperatura ambiente con agitación suave.
  4. Al día siguiente, incubar las membranas con soluciones de anticuerpos secundarios (IgG anti-conejo de cabra marcada con HRP, 1:2000) y agitar suavemente a temperatura ambiente durante 1 h.
  5. Finalmente, agregue 0,1 ml / cm2 de solución cromogénica ECL disponible comercialmente para cubrir completamente las membranas de PVDF. Incubar durante 1 min a temperatura ambiente antes de la exposición. Visualice y analice las bandas utilizando un sistema de quimioluminiscencia mejorado (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles). Consulte la Figura 4C y la Figura 5B.
    NOTA: Los desechos químicos generados durante los procedimientos experimentales deben recolectarse en contenedores designados para desechos peligrosos y ser eliminados por servicios certificados de manejo de desechos peligrosos de acuerdo con las políticas institucionales.

10. Análisis estadístico 

NOTA: Todos los experimentos se realizaron en tres réplicas biológicas independientes (n = 3).

  1. Organice los datos experimentales por grupo e ingréselos en el software GraphPad Prism (versión 8.0.2; consulte la tabla de materiales para obtener más detalles). Realizar visualización de datos y análisis de significación estadística de acuerdo con las pautas del software. Los datos de medición se expresaron como media ± desviación estándar. Las diferencias estadísticas entre los grupos se evaluaron mediante ANOVA de una vía con cálculo del tamaño del efecto η² (eta-cuadrado), seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey26. Considere **P < 0.01 como estadísticamente significativo.

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Resultados

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β-Ele suprime significativamente la proliferación de células A549/DDP

En este experimento, las concentraciones de administración de β-Ele y DDP se determinaron en base a los resultados de nuestros estudios previos20,21. Las células A549/DDP se trataron con β-Ele, solo o combinado con DDP, para diseccionar su impacto en la quimiorresistencia a DDP. El aná...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio se centró en el problema clínico crítico de la resistencia al cisplatino en el cáncer de pulmón. El cáncer de pulmón, responsable del mayor número de muertes por cáncer a nivel mundial, sigue teniendo una tasa de supervivencia a cinco años inferior al 20%29,30. El cisplatino, como piedra angular de los fármacos quimioterapéuticos basados en platino, es un agente anticancerígeno eficaz y de amplio espectro que inhibe ...

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Divulgaciones

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Todos los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La financiación de este estudio fue proporcionada por la Fundación Provincial de Ciencias Naturales de Jilin en virtud del Premio No. YDZJ202401058ZYTS.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Celdas A549 / DDPProcellCL-0519URL: https://www.procell.com.cn/p/a549-ddp--cl-0519
Un banco de trabajo excepcionalmente limpioSuzhou Antai AirtechSW-CJ-2FDURL: http://www.sz-antai.com
Kit de ensayo de concentración de proteínas BCASolarbioPC0020URL:https://www.solarbio.com
Centrífuga de sobremesaTermoPico17URL: https://www.thermofisher.com
Cámara de cultivo celularTermo3111URL: https://www.thermofisher.com
Plato de cultivo celularBIOFILTCD000100URL: http://www.biofil.com.cn
Analizador de quimioluminiscenciaInstrumentos Qinxiang 4300URL: https://www.clinx.cn/about_us
CisplatinoAladdinC295225-250 mgURL: https://www.aladdin-e.com/
Instrumento de secuenciación de genes DNBSEQ-T7MGI Tech CO., LtdT7URL: https://www.mgitech.cn/
EasyPure  Kit de ADN microgenómicoTransGen BiotechEE181-01URL: https://www.transgen.com/
Solución cromogénica ECLSolarbioPE0010URL:https://www.solarbio.com
Kit de detección EDUTiempo de beyo.C0071SURL: https://www.beyotime.com
Instrumento marcado con enzimasEquipo DetieHBS-1096AURL: https://www.detiebio.cn/
Suero fetal bovino FBS)CLARKFB15015URL: https://zn.clarkbio.com/
Amortiguador de fragmentación/cebado Sí11277ESURL: https://www.yeasen.com/products/detail/2151
GeneMapper  Software  6TermoVersión 6Software de análisis de fragmentos. URL: https://www.thermofisher.cn/   
Plataforma GenReaderTecnología genética de Beijing Yuewei Co., Ltd.https://yyigou.com/product/detail/0000037250.htmlAnalizador genético automatizado utilizado para la electroforesis capilar
Kit de prueba de glucosaBiografía de JianchengA154-1-1URL: http://www.njjcbio.com
GLUT1 Anticuerpo policlonalGrupo Proteintech21829-1-APURL: https://www.ptglab.com
Prisma GraphPadGraphPad SoftwareVersión 8.0.2URL: https://www.graphpad.com
GSK-3 y beta; AnticuerpoAfinidadAF5016URL: https://www.affbiotech.com
F-12K de HamProcellPM150910URL: https://www.procell.com.cn/
Selección de ADN NGS de HieffSí12601ESURL: https://www.yeasen.com/products/detail/939
Kit maestro de aislamiento de ARNm HieffNGSSí12603ZHURL: https://www.yeasen.com/products/detail/1119
IgG anti-conejo de cabra etiquetada HRPServicebioGB23303URL: https://www.servicebio.cn
Kit de prueba de lactatoBiografía de JianchengA019-2-1URL: http://www.njjcbio.com
Anticuerpo policlonal específico de LDHAGrupo Proteintech19987-1-APURL: https://www.ptglab.com
Ciclador de luz 96RocheLC96URL: https://lifescience.roche.com
Lipofectamina 2000Invitrogen11668-019URL: https://www.thermofisher.com/invitrogen
Opti-MEMGibco31985-070URL: https://www.thermofisher.com/gibco
Penicilina-estreptomicina (P / S)BiosharpBL505AURL: https://www.biosharp.cn/
Anticuerpo policlonal específico de PKM2Grupo Proteintech15822-1-APURL: https://www.ptglab.com
PMSF Tiempo de beyo.ST506URL: https://www.beyotime.com
Kit de reactivos PrimeScript RT (Perfect Real Time)TakaraRR037AURL: https://www.takarabio.com
Lisado de RIPATiempo de beyo.P0013BURL: https://www.beyotime.com
Plataforma de secuenciaciónBGIDNBSEQ-T7URL: https://www.bgi.com/global
TB Premezcla Verde Ex TaqTakaraRR420AURL: https://www.takarabio.com
Probador de trazas de ácido nucleicoInstrumento AoshengNano-100URL: http://www.hzaosheng.com
TRIzon PaICanvax BiotechCW0597SURL:https://www.canvaxbiotech.com
TripsinaBiosharpBL501AURL: https://www.biosharp.cn/
Kit de ARN ultrapuro (ADNasa I)Canvax BiotechCW0597SURL:https://www.canvaxbiotech.com
β-Anticuerpo de actinaGrupo Proteintech60008-1-IGURL: https://www.ptglab.com
β-catenina AnticuerpoAfinidadDF6794URL: https://www.affbiotech.com
β-ElemeneSigma63965-25MGURL:https://www.sigmaaldrich.com

Referencias

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