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Artículo de método

Refinamiento de OnePot PURE y producción de ribosomas crudos para la síntesis de proteínas libres de células reproducibles

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DOI:

10.3791/68826

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22 de agosto de 2025

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1Centre for Engineering Biology, Institute of Quantitative Biology, Biochemistry and Biotechnology, School of Biological Sciences, University of Edinburgh, 2Biophoundry Inc.

En este artículo

Resumen

Presentamos un protocolo actualizado para la producción del sistema OnePot 'Protein synthesis Using Recombinant Elements' (PURE) y ribosomas crudos para la síntesis de proteínas libres de células, centrándonos en el control del crecimiento celular para minimizar las variaciones de lote a lote.

Resumen

Los avances recientes han permitido que el sistema libre de células de síntesis de proteínas mediante elementos recombinantes (PURE) se produzca en laboratorios individuales de forma económica y con una carga laboral reducida. Sin embargo, la preparación de los 36 componentes proteicos y ribosomas, que componen PURE, sigue siendo una tarea compleja, con mucho margen de variación y error. Presentamos un procedimiento detallado y actualizado para fabricar PURE basado en el protocolo OnePot recientemente publicado, que implica la regulación de una serie de pasos clave, en particular, la inoculación de cultivos utilizando existencias de glicerol normalizadas por densidad óptica (OD), el monitoreo cuidadoso del crecimiento celular y el control de las concentraciones finales de glicerol. Utilizando este enfoque, informamos preparaciones reproducibles de PURE de múltiples réplicas biológicas y usuarios. Este protocolo sirve como referencia y punto de partida para que otros laboratorios fabriquen y solucionen sus propios sistemas PURE, aumentando así la democratización de las muchas aplicaciones que permite PURE, como la construcción ascendente de sistemas biomoleculares y el desarrollo de células sintéticas.

Introducción

La síntesis de proteínas libres de células (CFPS) ha madurado como tecnología para diversas aplicaciones, incluida la biofabricación, la biodetección y el diagnóstico, la creación de prototipos de partes y vías genéticas y metabólicas, la ingeniería rápida de proteínas y la educación 1,2. Los sistemas CFPS que utilizan componentes purificados, desarrollados originalmente comoel sistema 3 de "Síntesis de proteínas mediante elementos recombinantes" (PURE), ofrecen una serie de ventajas sobre sus alternativas basadas en lisado. Los sistemas PURE tienen una composición definida, que consta de 36 factores proteicos, el ribosoma 70S E. coli y una mezcla definida de sustratos químicos que incluyen nucleósidos trifosfatos (NTP), aminoácidos y ARNt, que se pueden adaptar a voluntad a la aplicación requerida. Por lo tanto, son muy adecuados para estudios como la incorporación de aminoácidos no canónicos, el modelado mecanicista y la construcción ascendente de sistemas biomoleculares y células sintéticas1. Si bien PURE está disponible en proveedores comerciales, su costo ($ 0.34- $ 1.63 por reacción de 1 μL) es prohibitivo para la experimentación a gran escala; y la estrategia alternativa de producir PURE internamente se ha visto obstaculizada hasta ahora por protocolos intensivos en mano de obra que implican la purificación paralela de 36 proteínas y ribosomas4, que son difíciles de llevar a cabo de forma robusta y reproducible, especialmente para usuarios sin experiencia.

Los desarrollos recientes han ayudado a la producción casera de PURE. Por ejemplo, Wang et al. han diseñado cepas de E. coli para incluir etiquetas de hexahistidina genómicamente integradas en la maquinaria de traducción, lo que facilita una purificación de un solo paso5. Los genes que codifican todas las proteínas PURE se han ensamblado en un pequeño número de plásmidos, que se han utilizado de manera similar para reducir el trabajo de purificación6. Villareal et al. han diseñado elegantes consorcios de cepas PURE, que equilibran la expresión para producir proteínas en la proporción correcta, al mismo tiempo que permiten la purificación en un solo paso7.

El innovador sistema OnePot PURE desarrollado por Lavickova et al. es muy prometedor para la facilidad de uso 8,9. En este sistema, las cepas PURE originales se cocultivan y purifican mediante un solo paso de cromatografía. Aunque no es posible definir con precisión la composición del sistema PURE resultante, los autores demostraron que múltiples lotes del sistema son en gran medida reproducibles y se puede lograr un nivel grueso de control variando el volumen de inoculación de cada cepa. La compensación de un control preciso de la composición por la facilidad de producción es aceptable para muchos usuarios, dado que el rendimiento general de la síntesis de proteínas del sistema OnePot es similar al obtenido comercialmente. Sin embargo, si bien existen protocolos detallados para el sistema OnePot, ha sido un desafío reproducir completamente los resultados de Lavickova et al. en otros laboratorios. Por ejemplo, se ha observado inestabilidad del vector de expresión, cepas de crecimiento lento y proteólisis10.

En este trabajo, presentamos un protocolo OnePot PURE detallado y refinado, que controla el crecimiento celular mediante el uso de existencias de glicerol estandarizadas y ajustes de medios, brinda orientación sobre el monitoreo del crecimiento y la DO de cosecha, y normaliza la cantidad de glicerol en la purificación final. En segundo lugar, presentamos un procedimiento optimizado de purificación de ribosomas crudos utilizando solo ultracentrifugación diferencial, que equilibra la compensación entre la actividad de los ribosomas y el costo y la complejidad de métodos más sofisticados.

Aunque esto introduce más pasos en el protocolo OnePot, permiten al usuario una mayor oportunidad de solucionar problemas del procedimiento más a fondo si es necesario, así como modificarlo según sus necesidades. Demostramos la reproducibilidad del proceso mostrando múltiples réplicas biológicas realizadas por múltiples usuarios en el mismo laboratorio. Encontramos que el control sobre los componentes PURE y la preparación del ribosoma son cruciales para garantizar un alto rendimiento de CFPS del sistema.

La preparación de PURE y ribosoma dura 4 o 5 días cada una, respectivamente, y puede ser realizada secuencialmente por un usuario o simultáneamente por dos usuarios. La preparación PURE implica 4x500 ml de cultivo líquido, cada uno de los cuales produce ~2 g de pellets celulares y ~1 ml de proteínas PURE a una concentración de ~15 mg/ml. La preparación del ribosoma implica 4 × 500 ml = 2 l de cultivo líquido, lo que da lugar a un total de ~3 g de pellets celulares y produce ~1 ml de ribosomas crudos a una concentración de ~17 μM. El protocolo actual produce sistemas PURE con rendimientos de síntesis de hasta ~100 μg/mL GFP o ~130 μg/mL de mCherry durante 2 h de reacción por lotes11, lo que se compara favorablemente con el OnePot original, así como con los sistemas comerciales (~140-160 μg/mL)8,12. Por lo tanto, es un punto de partida adecuado para una mayor optimización mediante la suplementación o modulación de componentes sensibles como sales, agentes de aglomeración y factores proteicos individuales.

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Protocolo

El protocolo se divide en tres partes. En aras de la concisión y la claridad, destacamos los importantes cambios específicos de este trabajo, y por lo tanto, se hace referencia a detalles que son los mismos que los existentes en otras publicaciones.

El trabajo preliminar solo debe realizarse una vez. Las cuatro secciones implican la preparación de existencias de glicerol y placas de inicio para las proteínas PURE, así como la verificación y medición de los tiempos de expresión de las cepas. El uso de placas de inicio elimina la variabilidad asociada con la inoculación directa de las existencias de glicerol raspadas. Es crucial asegurarse de que este trabajo se realice a fondo antes de pasar a la etapa de fabricación. Debido a la gran cantidad de diferentes existencias de glicerol involucradas en la preparación de PURE, es esencial verificar la integridad y expresión del plásmido de cada cepa antes de intentar producir el sistema.

En la Figura 1 se proporciona un esquema del flujo de trabajo y un cronograma recomendado en la Tabla 1. Los materiales requeridos y los pasos en los que se utilizan se dan en la Tabla de materiales, y el esquema de los tampones y medios requeridos en cada etapa se resume en la Figura complementaria S1.

1. Trabajo preliminar

  1. Generación de existencias de glicerol
    NOTA: Todos los plásmidos están disponibles en Addgene.
    1. Genere existencias de glicerol del 25% p/v de todas las cepas enumeradas en la Tabla 2, siguiendo los procedimientos estándar9, y almacene en crioviales a -80 °C.
  2. Preparación de placas de inicio PURE (durante la noche)
    1. Prepare 20 ml de medios LB suplementados con 100 μg/ml de ampicilina (LB+AMP).
    2. Etiquete 36 tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 ml del #1 al #36.
    3. Agregue 500 μL de LB + AMP en cada tubo. Inocular cada tubo con la cepa correspondiente utilizando una punta de pipeta para raspar una pequeña cantidad del stock original de glicerol. Asegúrese de que las existencias de glicerol no se descongelen. Vórtice para mezclar bien.
    4. Alícuota de 300 μl de cada tubo inoculado en el pocillo correspondiente de una placa de pocillos profundos estéril de 1 ml 96 siguiendo el diseño que se muestra en la figura 2.
      NOTA: En todos los pasos posteriores relacionados con las placas, mantenga el mismo diseño de placas en todo momento.
    5. Incubar la placa durante la noche en un agitador de placas a 37 °C, 1.000 RPM durante 15 h.
    6. Al día siguiente, prepare 25 ml de medios LB suplementados con 100 μg/ml de ampicilina (LB+AMP) y 15 ml de glicerol estéril al 50% (v/v).
    7. Transfiera 30 μl de cada cultivo desde la placa de pocillos profundos al fondo de una placa óptica de 96 pocillos, utilizando una pipeta multicanal. Agregue 270 μL de medios LB+AMP en cada pocillo que contenga cultivos, para lograr una dilución de 10x de cada cultivo.
    8. Mida el DE600 de cada cultivo con un lector de placas. Calcule el volumen de cada cultivo necesario para inocular 650 μL de LB+AMP fresco a un DO600 inicial de 0,2. Se proporciona una hoja de cálculo para ayudar con los cálculos como Tabla complementaria S1.
    9. Prepare tres nuevas placas estériles de 1 ml 96 de pocillos profundos. En una placa, agregue 650 μL de LB+AMP a 36 pocillos e inocule cada pocillo con el volumen calculado de cultivo nocturno para obtener OD600 = 0,2.
    10. Transfiera 300 μL de cultivo inoculado a cada una de las otras dos placas. Una placa será el cultivo y la otra se utilizará para monitorear la OD. Incube las dos placas en un agitador de placas a 37 ° C, 1000 RPM, hasta que los cultivos alcancen OD600 ~ 1 (~ 1.5-2 h). Controle el OD a 1 h, y luego nuevamente según sea necesario, extrayendo muestras de 30 μL de la segunda placa y agregando 270 μL de LB+AMP para una dilución de 10x.
    11. A medida que los pocillos individuales alcancen OD600 ~ 1, retírelos del agitador. Agregue un volumen igual de glicerol estéril al 50% (v / v) a cada cultivo para lograr una concentración final de OD600 = 0,5 en glicerol al 25%. Mezcle bien y guarde estos tubos en hielo. Estos son los materiales de trabajo maestros.
    12. Alícuota un máximo de 40 μl de cada material maestro en placas de PCR de 96 pocillos, manteniendo el patrón original de pocillos. Distribuir en tantas placas como sea posible según la capacidad de almacenamiento. Selle con sellos de placa de aluminio y almacene estas placas de arranque PURE a -80 °C.
      NOTA: Estas placas de arranque deben descongelarse un máximo de 3 veces. Reemplácelo con placas nuevas si excede este límite para mantener la integridad y la reproducibilidad de la deformación.
  3. Determinación de los tiempos de crecimiento del cultivo iniciador (durante la noche)
    1. Descongele una placa de inicio PURE en hielo.
    2. Agregue 50 μL de 100 mg/mL de ampicilina a 50 mL de medios LB estériles en un tubo cónico estéril (LB+AMP).
    3. Etiquete 36 tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 ml del #1 al #36 y agregue 1 ml de LB + AMP a cada tubo.
    4. Agregue 10 μL de cada una de las existencias de glicerol al tubo etiquetado correspondiente y mezcle bien por vórtice.
    5. Agregue 300 μL del cultivo inoculado de cada tubo en el pocillo correspondiente de una placa de pocillos profundos estéril de 1 mL 96. Selle las placas con un sello de placa transpirable e incube la placa de cultivo en un agitador de placas a 1000 RPM, 37 °C. Determine y registre el tiempo que tardan los cultivos en alcanzar OD600 ~ 2-3 sin exceder OD600 = 3. Establezca este parámetro antes de continuar.
      NOTA: En nuestro laboratorio, esto toma 15 h.
  4. Prueba de expresión de cepas PURE
    1. Prepare 38 ml de medios LB suplementados con 100 μg/ml de ampicilina (LB+AMP), 10 mM de stock de IPTG y 1x reactivo de extracción de proteínas.
    2. Descongele una placa de inicio PURE en hielo.
    3. Agregue 1 ml de LB + AMP a cada uno de los 36 pocillos de una placa profunda estéril de 2 ml 96. Inocular cada pocillo con 20 μL del cultivo iniciador correspondiente. Incube la placa en un agitador de placas a 1000 RPM, 37 °C, durante aproximadamente 1 h, o hasta que se alcance OD600 = 2.
    4. Induzca la expresión de proteínas agregando 10 μL de IPTG de 10 mM a cada pocillo, para una concentración final de IPTG de 0,1 mM. Continúe la incubación durante 3 h a 1000 RPM, 37 °C.
    5. Al final del período de expresión de 3 h, transfiera 700 μL de cada cultivo a 36 tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mL. Centrifugar a 20.000 × g durante 10 min a 4 °C. Deseche con cuidado el sobrenadante.
    6. Vuelva a suspender cada sedimento en 70 μL de 1x reactivo de extracción de proteínas. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente bajo agitación suave para permitir la lisis celular.
    7. Centrifugar lisados a 20.000 × g durante 10 min a 4 °C para granular la fracción insoluble.
    8. Realice la purificación de etiquetas His a pequeña escala de cada proteína utilizando perlas magnéticas de Ni-NTA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    9. Analice las proteínas purificadas utilizando SDS-PAGE para confirmar la expresión de cada proteína y/o la contaminación cruzada entre cepas9.
      NOTA: Las cepas que expresan proteínas exhibirán bandas distintas en SDS-PAGE correspondientes al peso molecular esperado de la proteína diana. Si no se detectan bandas, es posible que la cepa no esté expresando la proteína. En tales casos, aísle y secuencie el plásmido para confirmar la identidad e integridad de la secuencia, y reemplace el plásmido si es necesario.

2. Purificación de proteínas OnePot PURE (4 días)

NOTA: Una sola preparación del sistema PURE requiere el procesamiento de 500 ml de cultivo líquido. Es aconsejable producir preparaciones de 4 x 500 ml simultáneamente para producir cuatro lotes PURE independientes en una sola ejecución. Estos lotes pueden cuantificarse de forma independiente o combinarse si procede. El protocolo de 4 días se puede acortar a 3 días llevando a cabo el paso de incubación de resina durante la noche, pero esto implica un tercer día largo. Ambas opciones se detallan a continuación.

  1. Día 1: preparación de materiales y crecimiento de cultivos iniciadores
    1. Preparar soluciones madre y tampones para la preparación PURE como se describe en la Tabla Suplementaria S2 y la Figura Suplementaria S1.
      NOTA: Prepare los medios y tampones relevantes necesarios inmediatamente antes de la ejecución de cada parte del protocolo y solo guárdelos durante el número máximo de días antes de su uso como se indica.
    2. Descongele una placa de inicio PURE en hielo.
    3. Agregue 50 μL de 100 mg/mL de ampicilina a 50 mL de medios LB estériles en un tubo cónico estéril de 50 mL (LB+AMP).
    4. Etiquete 36 tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 ml del #1 al #36 y agregue 1 ml de LB+AMP a cada tubo.
    5. Agregue 10 μL de cada una de las existencias de glicerol al tubo etiquetado correspondiente y mezcle bien por vórtice.
      NOTA: Para rastrear fácilmente la inoculación de cada cepa, después de agregar la cepa a cada tubo, expulse la punta de la pipeta en el pocillo correspondiente de la placa de inicio PURE. Repite este proceso para todas las cepas. Una vez completado, retire las puntas de las pipetas con cuidado de la placa antes de volver a sellarlas con papel de aluminio y cinta de autoclave, y guárdelas a -80 °C.
    6. Agregue 300 μL del cultivo inoculado de cada tubo en el pocillo correspondiente de una placa de pocillos profundos estériles de 1 mL 96, excepto la cepa #25 (EF-Tu). Sellar placas con un sello de placa transpirable. Incubar la placa de cultivo en un agitador de placas a 1.000 RPM, 37 °C, durante 14 h.
    7. Agregue 1 ml de cultivo inoculado del tubo # 25 a 10 ml de LB en un tubo cónico de 50 ml para preparar el cultivo iniciador EF-Tu. Incubar el tubo en una incubadora a 260 RPM, 37 °C durante 14 h.
      NOTA: La cepa #25, EF-Tu, se requiere a una concentración mucho más alta que los otros componentes y, por lo tanto, se procesa por separado, como se describe en el protocolo original8.
    8. Coloque 2 L de medios estériles 2x YTP en una botella de vidrio de 2 L y colóquelos en una incubadora estática a 37 ° C para precalentar durante la noche.
  2. Día 2: crecimiento y peletización
    1. Prepare los reactivos necesarios:
      1. 2 L de 2 medios YTP precalentados estériles (a partir del día 1)
      2. 2 ml de 100 mg/ml de ampicilina
      3. 100 mM IPTG, estéril
      4. 100 ml de PBS, estéril, helado
      5. 10 ml de LB
    2. Transfiera 30 μl de cada cultivo iniciador desde la placa de inicio de pocillos profundos y el tubo de inicio EF-Tu al fondo de una placa óptica de 96 pocillos, utilizando una pipeta multicanal.
    3. Agregue 270 μL de medios LB en cada pocillo que contenga cultivos, para lograr una dilución de 10x de cada cultivo.
    4. Mida el DE600 de cada cultivo con un lector de placas. Todas las cepas deben estar enOD 600 = 2-3.
      NOTA: Si un cultivo ha crecido demasiado por encima de OD600 = 3, diluya a OD600 = 3 usando 2x YTP + AMP (Tabla complementaria S1). La dilución de los iniciadores demasiado grandes puede llevar mucho tiempo y ser propensa a errores. Como tal, es aconsejable establecer el tiempo de incubación exacto requerido para alcanzar OD600 2-3 como se describe en la Sección 1.3 del trabajo preliminar.
    5. Transfiera 500 ml de medios 2x YTP precalentados y 500 μl de ampicilina de 100 mg/ml a un matraz con deflector estéril de 2,5 L (2x YTP+AMP).
    6. En un solo tubo cónico estéril de 15 ml, agregue 55 μl de cada cultivo de la placa de cultivo iniciador y 1675 μl del cultivo EF-Tu. Mezclar bien por vórtice.
      NOTA: Este es el cultivo OnePot que combina todas las cepas PURE. Es en esta etapa que se pueden crear sistemas knockout (ΔPURE) omitiendo algunas cepas, o se pueden agregar otros componentes que requieren copurificación.
    7. Agregue el contenido de este tubo al matraz deflector de 2,5 L que contiene 500 ml de 2x YTP+AMP. Repita los pasos 5-7 para obtener 4x cultivos independientes.
    8. Incubar los matraces a 260 RPM, 37 °C, durante 1,5-2 h, hasta OD600 = 0,2-0,3.
    9. Una vez alcanzado el DO600 = 0,2-0,3, inocular cada matraz con 500 μL de IPTG de 100 mM, para una concentración final de inducción de 0,1 mM de IPTG.
    10. Incubar los cultivos durante 3 h más a 260 RPM, 37 °C.
    11. Durante la incubación, pese y etiquete cuatro tubos cónicos estériles de 50 ml.
    12. Preenfríe las centrífugas a 4 °C según sea necesario, y etiquete y enfríe cuatro botellas de centrífuga de copolímero de polipropileno.
    13. Coloque cuatro botellas de vidrio etiquetadas de 500 ml en un baño de agua helada.
    14. Al final de las 3 h de incubación, decantar cuidadosamente cada cultivo en una botella de vidrio con hielo para terminar el crecimiento.
      NOTA: La transferencia de cultivos a botellas enfriadas es esencial para detener rápidamente el crecimiento: colocar matraces calientes directamente en el baño de agua helada no dará como resultado una terminación eficiente del crecimiento. Todos los pasos posteriores se realizan en hielo a menos que se indique lo contrario.
    15. Añadir 250 mL de cada cultivo en los frascos de centrífuga correspondientes, y centrifugar a 3.220 × g, 4 °C, durante 10 min, manteniendo los otros 250 mL en el baño de agua helada.
    16. Decanta con cuidado el sobrenadante y sécalo sobre toallas de papel.
    17. Añadir los 250 mL restantes de cada cultivo a los frascos de centrífuga correspondientes, y centrifugar de nuevo a 3.220 × g, 4 °C, durante 10 min.
    18. Decanta con cuidado el sobrenadante y sécalo sobre toallas de papel.
    19. Agregue 20 ml de PBS helado estéril en cada botella de centrífuga y vuelva a suspender bien el gránulo celular.
    20. Transfiera cada resuspensión a los tubos cónicos de 50 ml preparados.
    21. Centrifugar los tubos a 2.000 × g, 4 °C, durante 8 min.
    22. Retire el sobrenadante decantando con cuidado.
    23. Centrifugar los tubos de nuevo a 2.000 × g, 4 °C, durante 2 min.
    24. Elimine el sobrenadante residual pipeteando y mantenga los gránulos celulares en hielo.
    25. Cada tubo contiene ahora el sedimento celular de un solo cultivo de 500 ml. Pese cada tubo, calcule la masa de pellets de la célula (normalmente, ~2 g) restando el peso vacío de cada tubo y registre.
    26. Congele los gránulos de celda congelada y guárdelos a -80 °C hasta la lisis.
      NOTA: Opcionalmente, el protocolo puede completarse en 3 días, procediendo directamente a la etapa de lisis en este punto.
  3. Día 3: lisis, purificación y diálisis
    1. Prepare los reactivos necesarios:
      1. Prepare 50 ml de tampón de resplansión.
      2. Prepare TCEP de 0,5 M.
    2. Descongele los gránulos celulares en hielo.
    3. Alícuotas 50 ml de tampón de resuspensión en un tubo cónico de 50 ml y agregue 100 μl de TCEP de 0,5 M. Mezclar bien por vórtice.
    4. Resuspenda los gránulos celulares en Tampón de resuspensión + TCEP en una proporción de 2 ml por 1 g de gránulos celulares. Vórtice completamente para volver a suspender.
    5. Distribuya la resuspensión celular en tubos cónicos de 50 ml de modo que cada tubo tenga 5 ml de suspensión. Etiquete las trompas según sea necesario para realizar un seguimiento de los 4 cultivos independientes. Almacenar en hielo.
    6. Lisar las células mediante sonicación al 30% de amplitud, 20 s encendido, 20 s apagado, durante 10 ciclos en un baño de agua helada utilizando una sonda de sonicación refrigerada (Figura 3A, B).
      NOTA: Se deben transferir aproximadamente 1000 J de energía a cada tubo durante la sonicación. Utilice un soporte seguro para mantener el tubo en su lugar durante la sonicación para garantizar la consistencia de la transferencia de energía.
    7. Distribuya el lisado en tubos de microcentrífuga estériles de 2 ml, de modo que cada tubo contenga 1 ml de lisado. Repita los pasos 2.3.6 y 2.3.7 para lisar las cuatro referencias culturales. Los siguientes pasos se llevan a cabo para 4 lisados en paralelo.
    8. Centrifugar a 15.923 × g, 4 °C, durante 20 min.
    9. Durante la centrifugación, lavar y equilibrar 5 ml de resina de purificación de proteínas (preparar cuatro columnas para los cuatro lisados):
      1. Agregue 2 ml de resina de purificación de proteínas frescas a una columna de cromatografía de flujo por gravedad.
      2. Lave la columna con 30 ml de agua destilada estéril dos veces para eliminar el etanol de almacenamiento.
      3. Complemente 30 ml de tampón de resuspensión con 60 μl de TCEP 0,5 M hasta una concentración final de 1 mM.
      4. Como la columna tiene un volumen de 30 ml, vierta los tampones directamente en la columna para llenarla. Asegurándose de que la válvula esté cerrada, equilibre la columna agregando 30 ml de tampón de resuspensión + TCEP.
      5. Abra la válvula para permitir que fluyan ~ 25 ml de tampón, antes de cerrar la válvula de columna, dejando ~ 5 ml de tampón sobre el lecho de resina para evitar que se seque. La columna ya está lista para su uso.
    10. Después de la centrifugación, combine todo el sobrenadante clarificado sin pellets de cada cultivo en 4 tubos cónicos frescos de 50 ml sobre hielo.
    11. Vuelva a suspender la resina en los 5 ml restantes de tampón de resuspensión + TCEP dentro de cada columna, y agregue tampón y resina en cada uno de los tubos cónicos que contienen el sobrenadante lisado.
    12. Cerrar y sellar la tapa con Parafilm, e incubar en un agitador asador a 4 °C durante 5 h.
      NOTA: Si la lisis se realizó inmediatamente después del crecimiento, este lisado se puede incubar con resina durante la noche.
    13. Prepare los reactivos necesarios:
      1. Agregue TCEP a una concentración final de 1 mM a los tampones de lavado y elución y guárdelo a 4 ° C hasta su uso.
      2. Mantenga listo el etanol al 20% (v/v).
    14. Después de la incubación, pulse brevemente los tubos en una centrífuga para recoger la resina hasta el fondo del tubo.
    15. Vuelva a suspender la resina con una pipeta y vuelva a añadir la resina a la columna de purificación de proteínas.
    16. Una vez que la resina se haya asentado en un lecho en la parte inferior de la columna, deje que el amortiguador lo atraviese.
      NOTA: Opcionalmente, recopile el flujo y los lavados durante la purificación de proteínas para su análisis a través de SDS-PAGE para solucionar problemas del procedimiento de purificación
    17. Columna de lavado con un volumen de columna de tampón de lavado + TCEP.
    18. Agregue 5 ml de tampón de elución + TCEP en la columna, vuelva a suspender la resina varias veces con una pipeta e incube durante 10 min.
    19. Después de la incubación, recoja la elución en un tubo de bisutería de 5 ml etiquetado y guárdelo en hielo.
    20. Limpiar y almacenar la resina de purificación de proteínas:
      1. Una vez completada la elución, lave la columna con 30 ml de tampón de elución para eliminar las proteínas unidas restantes.
      2. Enjuague la resina con 30 ml de agua destilada estéril, repetida 3 veces.
      3. Pase 30 ml de etanol al 20% (v / v) a través de la columna una vez.
      4. Llene la columna con etanol al 20% y selle con una tapa o parafilm. Conservar a 4 °C hasta el próximo uso.
        NOTA: Solo se requiere limpieza, no intente quitar el níquel de la resina. La resina limpia es apropiada para su reutilización en preparaciones estándar del sistema PURE; sin embargo, para las variantes del sistema ΔPURE, utilice siempre resina fresca para evitar la contaminación cruzada.
    21. Remoje un casete de diálisis de 15 ml y 2 kDa en Buffer HT (sin TCEP) durante 10 min.
    22. Agregue 5 ml de solución de proteína eluida en el casete de diálisis.
    23. Retire la mayor cantidad de aire posible del casete antes de volver a colocar la tapa.
    24. Dializar 5 ml de proteína eluida contra 1 l de tampón HT (sin TCEP) durante 2 h, seguido de 1 l adicional de tampón HT fresco durante la noche a 4 °C con agitación suave.
      NOTA: Si se combinan eluciones de múltiples purificaciones, se pueden dializar hasta 10 ml de elución contra 2 L de tampón HT durante 2 h, seguidos de otros 2 L de tampón HT durante la noche a 4 °C. Si la incubación de resina se realizó durante la noche, la diálisis se puede realizar durante el día utilizando un protocolo de 2 h seguido de 4 h, seguido inmediatamente de los pasos de concentración de proteínas a continuación.
  4. Día 4: concentración y almacenamiento
    1. Preparación de los reactivos necesarios:
      1. Prepare Buffer HT Refresh + TCEP.
      2. Prepare Stock-60 + TCEP.
    2. Una vez finalizada la diálisis, retire 5 ml de la muestra dializada del casete y distribuya 500 μl de alícuotas en tubos de microcentrífuga estériles de 5 x 2 ml.
    3. Centrifugar para granular las proteínas precipitadas a 14.000 × g, 4 °C, durante 10 min.
    4. Vuelva a combinar el sobrenadante sin pellets y agréguelo a una unidad de filtro centrífugo MWCO de 3 kDa, y complete el volumen con 10 ml de Buffer HT Refresh + TCEP.
    5. Centrifugar a 3.220 × g, 4 °C, durante 30 min O hasta que el volumen de la muestra se haya reducido a 1,5 ml.
      NOTA: La precipitación de proteínas durante los pasos de concentración puede reducir significativamente el rendimiento general de CFPS. Después de cada ciclo de centrifugación de 30 minutos, utilice una pipeta de 1 ml para volver a suspender la muestra en el tubo del filtro centrífugo para desalojar las proteínas precipitadas del fondo del filtro.
    6. Retire la muestra de la unidad centrífuga y distribuya 500 μl de alícuotas en tubos de microcentrífuga estériles de 3 x 2 ml.
    7. Centrifugar para granular las proteínas precipitadas a 14.000 × g, 4 °C, durante 10 min.
    8. Vuelva a combinar el sobrenadante sin gránulos en un tubo de microcentrífuga estéril fresco con hielo.
    9. Determine la concentración de proteínas en solución utilizando un ensayo Bradford, siguiendo las instrucciones del fabricante.
    10. Concentre la solución proteica añadiéndola a un filtro MWCO nuevo de 3 kDa y centrifugando a 14.862 × g, 4 °C, durante 15 min O hasta alcanzar el volumen de la muestra para obtener una concentración final de 25-30 mg/mL.
    11. Retire la muestra de la unidad centrífuga y distribuya 500 μl de alícuotas en tubos de microcentrífuga estériles de 2 ml.
    12. Centrifugar para granular las proteínas precipitadas a 14.000 × g, 4 °C, durante 10 min.
    13. Determine la concentración de proteínas utilizando un ensayo de Bradford. Solo continúe con el siguiente paso si la concentración está entre 25 y 30 mg / ml.
    14. Vuelva a combinar el sobrenadante sin gránulos en un tubo de microcentrífuga nuevo sobre hielo.
    15. Agregue un volumen igual de Stock-60 + TCEP a la solución de proteína concentrada y mezcle mediante un pipeteo suave.
    16. Determine la concentración final de proteína utilizando un ensayo de Bradford.
      NOTA: La proteína ahora está en Buffer HT + 30% de glicerol, y cualquier dilución adicional con Stock-30 no cambia la concentración de glicerol.
    17. Si es necesario, diluya la muestra con Stock-30 + TCEP para lograr una concentración final de aproximadamente 12,5 mg/ml.
    18. Alícuota de la solución proteica PURE en tubos de PCR a 20 μL de alícuotas, congele rápidamente en nitrógeno líquido y almacene a -80 °C.
      NOTA: Es crucial determinar la concentración de proteína con precisión antes de agregar Stock-60, ya que la concentración de soluciones de proteína que contienen glicerol puede resultar en un rendimiento inconsistente de CFPS, debido a cantidades variables de glicerol en la reacción final de CFPS. Por lo tanto, Stock-60 solo debe agregarse después de confirmar que la concentración de proteína está dentro del rango óptimo de 25-30 mg / ml.

3. Preparación de ribosomas crudos (5 días)

NOTA: El protocolo de purificación de ribosomas se ha optimizado para el procesamiento de 2 L (4 matraces de 500 ml) de cultivo líquido, lo que lleva a un total de ~ 3 g de pellets celulares y produce ~ 1 ml de ribosomas crudos a una concentración de 15-24 μM.

  1. Día 1: preparación y crecimiento de cultivos iniciadores
    1. Prepare soluciones madre y tampones para la preparación de ribosomas como se describe en la Tabla complementaria S2 y la Figura complementaria S1.
      NOTA: prepare los medios y tampones relevantes necesarios inmediatamente antes de la ejecución de cada parte del protocolo y solo guárdelos durante el número máximo de días antes de su uso como se indica.
    2. Prepare dos tubos cónicos de 50 ml: agregue 10 ml de medio LB a un tubo y 5 ml de medio LB al otro.
    3. Retire el caldo de glicerol de BL21 (DE3) del congelador a -80 ° C y colóquelo en hielo, asegurándose de que se completen los siguientes pasos antes de que el caldo se descongele.
    4. Inocular los 10 ml de medios LB con un raspado de las células del stock de glicerol, para crear un "minicultivo" LB. Incubar a 37 °C, 220 RPM, junto con el otro tubo (no inoculado) para comprobar si hay contaminación del medio, ya que todos los crecimientos se realizan sin antibióticos.
    5. Vuelva a colocar el caldo de glicerol en el congelador a -80 °C.
    6. Coloque 2,2 L de Terrific Broth (TB) estéril en botellas de vidrio estériles y guárdelas en una incubadora estática a 37 ° C para precalentar durante la noche.
  2. Día 2: crecimiento y peletización
    1. Retire los cultivos de la incubadora y asegúrese de que no haya contaminación en el tubo no inoculado o en la botella de medio precalentada antes de continuar.
    2. Preparar una dilución de 10x añadiendo 100 μL del cultivo de minicultivo a 900 μL de LB en una cubeta de 1 cm, y medir el OD600 con un espectrofotómetro (comprobar que es ~4-6).
    3. Añadir 200 ml de TB precalentado a un matraz cónico estéril de 500 ml e inocular con el volumen adecuado de minicultivo para obtener una DO inicialde 600 = 0,05 (Tabla complementaria S1). Esta es la 'cultura midi'.
    4. Incubar el midicultivo a 37 °C, 220 RPM hasta OD600 = 1, lo que debería tomar aproximadamente 1.5-2 h.
    5. Agregue 500 ml de TB a cada uno de los 4 matraces estériles con deflectores de 2,5 L. Inocular cada uno con un volumen apropiado de midicultivo para obtener una DO inicialde 600 = 0.05 (Tabla complementaria S1). Estas son las 4 'maxi-culturas'.
    6. Incubar los maxicultivos a 37 °C, 220 RPM hasta OD600 = 0,7-0,8, lo que debería tomar aproximadamente 1,5-2 h.
    7. Mientras tanto, etiquete y coloque cuatro botellas de centrífuga de copolímero de polipropileno limpias y 4 botellas de vidrio limpias de 500 ml en hielo para que se enfríen.
      NOTA: Mida la densidad del cultivo maxi cada 15 min después de 1 h de crecimiento para evitar sobrepasar OD600 = 0,7.
    8. Una vez que se alcanza OD600 = 0.7, transfiera rápidamente los cultivos a botellas de vidrio enfriadas y colóquelos en un baño de agua helada durante 20 minutos para detener el crecimiento.
      NOTA: La transferencia de cultivos a botellas enfriadas es esencial para detener rápidamente el crecimiento: colocar matraces directamente en el baño de agua helada no dará como resultado una terminación eficiente del crecimiento. Todos los pasos posteriores se realizan en hielo a menos que se indique lo contrario.
    9. Mientras los cultivos se enfrían en el baño de agua helada, enfríe previamente la centrífuga para la granulación celular y coloque 500 ml de solución de PBS en hielo para que se enfríe.
    10. Después de 20 min, transfiera 250 ml de cada cultivo a la botella centrífuga preenfriada correspondiente y centrifugue a 3.220 × g, 4 °C, durante 10 minutos, mientras mantiene los otros 250 ml en hielo.
    11. Decanta con cuidado el sobrenadante y sécalo sobre toallas de papel.
    12. Añadir los 250 mL restantes de cada cultivo al frasco centrífugo correspondiente, y centrifugar de nuevo a 3.220 × g, 4 °C, durante 10 min.
    13. Retire el sobrenadante decantando y seque las botellas con toallas de papel antes de volver a colocar los gránulos de celda en hielo.
    14. Agregue 30 ml de PBS estéril helado en cada botella de centrífuga y vuelva a suspender completamente el sedimento celular.
    15. Pese y etiquete 4 tubos cónicos limpios de 50 ml.
    16. Transfiera la suspensión celular a los tubos cónicos de 4 x 50 ml.
    17. Centrifugar de nuevo a 3.220 × g, 4 °C, durante 10 min.
    18. Retire el sobrenadante por decantación y seque los tubos sobre toallas de papel antes de volver a colocar los gránulos de células en hielo.
    19. Agregue 30 ml de PBS estéril helado en cada tubo cónico y vuelva a suspender el sedimento celular completamente mediante vórtice.
    20. Centrifugar de nuevo a 3.220 × g, 4 °C, durante 10 min.
    21. Retire el sobrenadante por decantación y seque los tubos sobre toallas de papel antes de volver a colocar los gránulos de células en hielo.
    22. Agregue 30 ml de PBS estéril helado en cada tubo cónico y vuelva a suspender el sedimento celular completamente mediante vórtice.
    23. Centrifugar de nuevo a 3.220 × g, 4 °C, durante 10 min.
    24. Retire el sobrenadante decantando y seque las botellas con toallas de papel antes de volver a colocar los gránulos celulares en hielo.
    25. Centrifugar una última vez a 3.220 × g, 4 °C, durante 2 min.
    26. Elimine cualquier exceso de sobrenadante pipeteando.
    27. Pesar y registrar la masa de cada tubo cónico. La masa de pellets celulares es la diferencia entre estos valores y el peso vacío de los tubos (debe ser ~ 1 g).
    28. Congele rápidamente los gránulos de celda de congelación con nitrógeno líquido y guárdelos a -80 °C.
  3. Día 3: lisis, ultracentrifugación y remojo de tampón B
    1. Descongele los gránulos celulares en hielo.
    2. Agregue 50 ml de tampón de ribosoma A en un tubo cónico limpio.
    3. Tome 100 μL de tampón de ribosoma A del tubo cónico y agréguelo a un vial de DTT sin peso. Disuelva completamente el pellet de DTT para obtener un stock de DTT de 0,5 M.
      NOTA: Prepare las existencias de TDT de 0,5 millones de subsecuentes como se describe aquí, pero utilizando el tampón adecuado para cada paso.
    4. Vuelva a añadir 100 μl de DTT 0,5 M en el tubo cónico de 50 ml para obtener una concentración final de 1 mM de DTT en el tampón de ribosoma A de 50 ml. Mantenga la solución en hielo.
    5. Vuelva a suspender cada sedimento celular en Ribosome Buffer A + DTT, en una proporción de 2 ml por 1 g de sedimento celular, mediante un vórtice completo. Combine todas las células resuspendidas en un tubo cónico para verificar el volumen total de la suspensión resuspendida, que debe ser de 10 ml de 2 L de cultivo. Si es necesario, rellene el volumen a 10 ml con Ribosome Buffer A + DTT adicional.
    6. Divida la suspensión en muestras de 2 x 5 ml en tubos cónicos separados.
    7. Lisar las células de cada tubo mediante sonicación al 30% de amplitud, 20 s encendido, 20 s apagado durante 10 ciclos (3 min 20 s de duración total del programa), en un baño de agua helada, utilizando una sonda de sonicación refrigerada (Figura 3A, 3C).
      NOTA: Se deben transferir aproximadamente 1.000 J de energía por tubo durante la sonicación. Utilice un soporte seguro para mantener el tubo en su lugar durante la sonicación para garantizar la consistencia de la transferencia de energía.
    8. Rellene el volumen de cada muestra lisada a 25 ml con Ribosome Buffer A + DTT y mezcle brevemente en vórtice.
    9. Transfiera el contenido a 2 tubos de centrifugación S30 enfriados.
    10. Centrifugar a 30.000 × g durante 1 h a 4 °C (Figura 3E).
    11. Recupere un máximo del 75% del sobrenadante sin pellets (para evitar la contaminación de la membrana del pellet) de cada tubo S30 en dos tubos S30 limpios y preenfriados.
    12. Centrifugar a 30.000 × g durante 30 min a 4 °C.
    13. Recupere un máximo del 75% del sobrenadante sin gránulos en dos tubos cónicos limpios de 50 ml y rellene el volumen de cada uno a 25 ml con Ribosome Buffer A + DTT.
    14. Transfiera la muestra a dos tubos S100 preenfriados limpios.
      NOTA: Asegúrese de que los tubos estén equilibrados con precisión (diferencia máxima de 0,01 g entre tubos opuestos) antes de la ultracentrifugación y se llenen hasta un volumen de 25 ml (capacidad máxima del tubo S100).
    15. Centrifugar a 100.000 × g durante 4 h a 4 °C (Figura 3F).
    16. Treinta minutos antes del final de la ejecución del S100, prepare un stock de TDT de 0,5 M utilizando el tampón de ribosoma B helado según las instrucciones anteriores, y genere una solución final de 1 mM de DTT en 50 ml de tampón de ribosoma B.
    17. Retire el sobrenadante de los tubos de ultracentrífuga mediante decantación. Agregue 5 ml de tampón de ribosoma B + DTT helado en cada tubo S100 que contenga gránulos ribosómicos. Guarde el Ribosome Buffer B + DTT restante a 4 °C para usarlo al día siguiente.
    18. Incube los tubos en hielo en una cámara frigorífica para que el gránulo de ribosoma se remoje en Ribosome Buffer B + DTT durante la noche.
      NOTA: Asegúrese de que el gránulo de ribosoma esté completamente sumergido en Ribosome Buffer B + DTT. Esto se puede lograr colocando tubos en hielo en ángulo (Figura 3D).
  4. Día 4: ultracentrifugación y remojo de tampón C
    1. Al día siguiente, agregue otros 5 ml de tampón de ribosoma B + DTT helado en cada tubo S100 que contenga el gránulo de ribosoma remojado durante la noche.
    2. Intente suavemente la resuspensión del gránulo mediante pipeteo. Utilice la punta de la pipeta para raspar el gránulo de la pared del tubo y volver a suspenderlo de esta manera. Transfiera el contenido a dos tubos S30 limpios y preenfriados.
    3. Agregue otros 10 ml de tampón de ribosoma B + DTT helado en cada tubo S100 que contenga el gránulo de ribosoma y repita los pasos de resuspensión como se indicó anteriormente.
    4. Coloca la resuspensión en el mismo tubo S30 que antes.
    5. Centrifugar a 30.000 × g durante 1 h a 4 °C (Figura 3G).
    6. Recupere un máximo del 75% del sobrenadante sin gránulos en dos tubos cónicos limpios de 50 ml y complete el volumen a 25 ml con Ribosome Buffer B + DTT.
    7. Transfiera esta muestra a dos tubos S100 limpios y preenfriados.
      NOTA: Asegúrese de que los tubos estén equilibrados con precisión antes de la ultracentrifugación y se llenen hasta un volumen de 25 ml (capacidad máxima del tubo S100).
    8. Centrifugar a 100.000 × g durante 4 h a 4 °C (Figura 3H).
    9. Treinta minutos antes del final de la ejecución del S100, prepare un stock de DTT de 0,5 M utilizando el tampón de ribosoma C helado según las instrucciones anteriores, y genere una solución final de 1 mM de DTT en 5 ml de tampón de ribosoma C. Mantenga este tampón en hielo.
    10. Después de la ultracentrifugación, deseche el sobrenadante y elimine cualquier tampón residual mediante pipeteo. Trabaje rápidamente para evitar dejar el pellet descubierto por el tampón durante demasiado tiempo.
    11. Agregue 400 μL de tampón de ribosoma C + DTT helado en cada tubo de ultracentrífuga que contenga gránulos ribosómicos.
    12. Incube los tubos en hielo en una cámara frigorífica para que el gránulo de ribosoma se remoje en Ribosome Buffer C + DTT durante la noche.
      NOTA: Asegúrese de que el gránulo de ribosoma esté completamente sumergido en Ribosome Buffer C + DTT. Esto se puede lograr colocando tubos en hielo en ángulo.
  5. Día 5: recolección
    1. Al día siguiente, vuelva a suspender suavemente el gránulo de ribosoma con una pipeta de 1 ml y girando suavemente para disolver completamente el gránulo de ribosoma de halo transparente.
      NOTA: El gránulo de ribosoma debe disolverse completamente en el tampón en esta etapa: no debe haber ningún gránulo insoluble en este punto, pero si queda un gránulo amarillo insoluble, no intente volver a suspenderlo: solo vuelva a suspender el gránulo de ribosoma de halo transparente.
    2. Transfiera la solución de ribosoma a dos tubos de microcentrífuga estériles de 2 ml y centrifugue a 20.000 × g durante 10 min a 4 °C para granular cualquier material insoluble restante.
    3. Recoja el sobrenadante sin gránulos en un tubo limpio y guárdelo en hielo (Figura 3I).
    4. Cree una dilución de 100x de la solución de ribosoma agregando 2 μL a 198 μL de Ribosome Buffer C, por triplicado.
    5. Medir la concentración de ARN a 260 nm; 10 unidades de absorbancia de la muestra diluida equivalen a 24 μM de ribosomas13.
    6. Las soluciones de ribosomas alícuotas (por ejemplo, en alícuotas de 50 μl, según las necesidades del usuario), se congelan rápidamente en nitrógeno líquido a una concentración máxima de 24 μM y se almacenan a -80 °C hasta su uso.
      NOTA: El protocolo debe conducir a aproximadamente 1 ml de ribosomas a una concentración de 12-18 μM. Si los ribosomas están demasiado diluidos, la concentración se puede lograr utilizando un filtro MWCO de 3 kDa8.

4. Configuración de experimentos CFPS

  1. Trabajo preliminar
    1. Preparar la plantilla de ADN (lineal o plásmido) de acuerdo con los protocolos establecidos9.
      NOTA: En nuestro laboratorio, utilizamos plantillas de ADN basadas en el sistema de expresión T7p14 optimizado para la expresión libre de células14. Los productos de PCR purificados se pueden utilizar como plantillas lineales. Es importante tener en cuenta que los plásmidos deben limpiarse después de la minipreparación, y que los diferentes kits comerciales producen resultados variables15.
    2. Prepare una solución de energía 5x como se describe en la Tabla 3.
    3. Prepare la solución de matriz 6x como se describe en la Tabla 4.
  2. Configuración y monitoreo de una reacción PURE
    NOTA: Este protocolo describe la configuración de una medición por triplicado utilizando una mezcla maestra. El número de reacciones se puede escalar hacia arriba o hacia abajo según sea necesario, utilizando la hoja de cálculo que se proporciona en la Tabla complementaria S3, pero recomendamos un mínimo de repeticiones por triplicado para una sola condición experimental.
    1. La descongelación requirió alícuotas de PURE, ribosomas, solución energética y solución de matriz en hielo.
    2. Prepare una mezcla maestra para un solo conjunto de reacciones triplicadas en un tubo de PCR, con un total de 17 μL, como se muestra en la Tabla 5, ensamblando los componentes en el siguiente orden: solución energética, proteínas PURE, ribosomas, solución de matriz, agua libre de nucleasas a 17 μL.
    3. Ajuste la pipeta a 5,1 μl y aspire suavemente la solución 5-6 veces para mezclar, asegurando la homogeneidad.
    4. Con el mismo ajuste de pipeta (5,1 μl), cargue la mezcla maestra en tres pocillos individuales de una placa óptica de 384 pocillos. Evite empujar la pipeta más allá del primer tope para evitar la formación de burbujas. Deje un espacio de pocillo entre cada réplica para minimizar la diafonía de fluorescencia.
    5. Selle la placa con un sello de placa adhesivo.
    6. Proceda con las mediciones de incubación o lector de placas posteriores según sea necesario.
      NOTA: Al incorporar componentes adicionales que contengan glicerol (por ejemplo, proteínas potenciadoras), asegúrese de que el volumen final de dichos componentes no exceda el 10% del volumen de reacción. Por ejemplo, un componente con un 30% de glicerol debe limitarse a 1,7 μl por mezcla maestra de 17 μl.
      No centrifugue la placa de 384 pocillos después de cargarla. La centrifugación puede causar la separación de componentes ricos en glicerol (por ejemplo, el sistema PURE), lo que resulta en niveles de expresión inconsistentes. El diseño de la placa admite reacciones de pequeño volumen y un pipeteo cuidadoso garantiza una sedimentación adecuada sin centrifugación.

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Resultados

El flujo de trabajo para las preparaciones PURE y ribosomas se muestra en la Figura 1, y en la Tabla 1 se muestra un cronograma recomendado para el trabajo. Por lo general, las reacciones se monitorean a través de la producción de proteínas fluorescentes como GFP o mCherry, y las lecturas de RFU se pueden convertir en concentraciones mediante calibración11. Sin embargo, los rendimiento...

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Discusión

Hemos presentado un procedimiento detallado que nos ha permitido obtener sistemas PURE reproducibles en múltiples lotes y usuarios en el mismo laboratorio. Hay una serie de pasos críticos necesarios para lograr esto.

El primer paso importante es garantizar la integridad de las 36 cepas PURE: además de secuenciar todos los plásmidos, es esencial realizar un ensayo de expresión para verificar que todas las cepas se sobreexpresen correctamente, ya que la pérdida ...

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Divulgaciones

SL es cofundador y CTO de Biophoundry Inc., que desarrolla tecnología libre de células para la ingeniería de fagos.

Agradecimientos

NL, SL, AB y NZ cuentan con el apoyo de la Beca de Futuros Líderes UKRI de NL (MR/V027107/1). SL también cuenta con el apoyo de Biophoundry Inc. SY cuenta con el apoyo de una beca de doctorado de Darwin Trust de la Universidad de Edimburgo. CW cuenta con el apoyo de una beca de doctorado BBSRC Eastbio. Los autores agradecen a A. Pompa por su ayuda en el uso de la ultracentrífuga, que fue apoyada por fondos de la Plataforma de Investigación Wellcome Discovery para la Biología Celular Oculta [226791]. Además, agradecemos a B. Lavickova y S. J. Maerkl por su ayuda en la configuración del protocolo original de OnePot. Con el propósito de acceso abierto, el autor ha aplicado una licencia Creative Commons Attribution (CC BY) a cualquier versión de manuscrito aceptado por el autor que surja de esta presentación. La Figura 1 se creó parcialmente en BioRender. Laohakunakorn, N. (2025) [https://BioRender.com/wj65i81].

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2x YTSigmaY2377-250G
AminoácidosSigmaLAA21-1KT
Acetato de amonio libre de ARNasaTermo CientíficaAM9070G
Cloruro de amonioSigma09718-1KG
ampicilinaSigmaA8351-5G
BL21(DE3) competente en E. coliNEBC2527H
botella, centrífuga (Nalgene)Termo Científica3120-9500Botella de copolímero de polipropileno
botella, vidrio (Duran) 250 mL, 500 mL, 1 L, 2 LVWR215-1593, 215-1594, 215-1595, 215-1596
Ensayo Bradford, Quick Start 1x Reactivo de tinteBio-Rad5000205
centrífugaTermo CientíficaHeraeus Megafuge 16R
centrífuga, microEppendorf5424R 
Columna de cromatografíaBio-Rad7321010
Fosfato de creatinaSigma27920
Cubetas, semi micro 1,6 mLFisherbrandFB55147
Di-hidrógeno ortofosofofófobo disódicoFisher ChemicalS/4450/60
casete de diálisis, Slide-A-Lyzer G3, MWCO de 2 kDa, 15 mLTermo CientíficaA52962
Hidrógeno ortofosfato dipotásico anhidro anhidroFisher ChemicalP/5240/60
TDT Sin pesaTermo CientíficaA39255
unidad de filtro, centrífuga MWCO Amicon Ultra 15 de 3kDaEMD MilliporeUFC900324
cantimplor, 500 mLVWR214-1133
matraz, despejidos 2,5 L TunairSS-5013
Ácido folínicoSigmaF7878-100MG
glicerolSigmaG5516-1L
HclFisherbrandH/1200/PB17
Tampón HEPES, solución 1 M pH 7,3Termo CientíficaBP299
imidazolSigmaI2399-500G
incubadoraEppendorfNew Brunswick Innova® 42
IPTGTermo CientíficaR0392
Pastillas KOHTermo CientíficaP1767-500G
Ácido L-glutámico sal hemimagnesio tetrahidratoSigma49605-250G
Ácido L-glutámico sal monopotásica, monohidratoSigma49601-500G
tetrahidrato de acetato de magnesioSigmaM5661-50G
Cloruro de magnesioFluka63020-1L
Montaje de agitación magnéticaEstuardoUS152
NanodropTermo CientíficaNanodrop 2000
Cuentas de cargador NEBExpress Ni-NTANEBS1423S
ParafilmSigmaP7543-1EA
pipeta, multicanal Eppendorf Research Plus 30-300 y micro; LEppendorf3125000052
Sello adhesivo de placa para lector de placasExcelScientificSTR-SEAL-PLT (Estéril)
Sello transpirable de placaStarlabE2796-3005
Sello de lámina de placaExcelScientificFCS-25
Lector de placasBioTekSinergia H1
Agitador de placasAllshengMBI100-4A
Placa, pozo 384Termo Científica242764
placa, pozo profundo 96 1 mLTermo Científica736-0601
placa, pozo profundo 96 2 mLSarstedt82.1972.002
PCR de placas y 96 pozosSarstedt721,978
Placa, pozo óptico 96Termo Científica10057581
Cloruro de potasioSigmaP5405-500G
Dihidrógeno ortófosfato de potasioFisher ChemicalP/4800/53
Reactivo de extracción de proteínas (BugBuster)EMD Millipore70584-3
resina de purificación de proteínas (cOmplete)Roche5893682001
Coctelero de rosteríaStarlabRM-Multi 1
cloruro de sodioFisher ChemicalS/3105/70
Sonda de sonicación, FisherBrand 15-50 mLTermo Científica12931181
SonicadorFisher ScientificFB120
espectrofotómetroJenwayGenova Plus
espermidinaSigmaS2626-1G
TCEP 0,5 MSupelco646547
Thermo Fisher NTP, Tris con bufferTermo CientíficaR1481
ARNt de E. coli MRE600Roche10109541001
TriptonaFormediumTRP02
tubo, grado PCR de 0,2 mLSarstedt72,737,002
tubo, bijoux Sterilin 7 mL poliestirenoTermo Científica129A
tubo, cónico (Falcon) 15 mLSarstedt62.554.502
tubo, cónico (Falcon) 50 mLSarstedt62.547.254
tubo, microcentrífuga (Eppendorf) 1,5 mLSarstedt72.690.001
tubo, microcentrífuga (Eppendorf) 2 mLSarstedt72.695.700
tubo, centrifugación S100 y nbsp;Beckman-Coulter355619
tubo, centrifugación S30 y nbsp;Termo Científica3118-0050
UltracentrífugaBeckman-CoulterOptima XPN-100
Rotor de ultracentrífugaBeckman-CoulterRotor de ángulo fijo 70Ti
Agua destilada UltraPure DNasa/RNasaTermo Científica10977049
vórticeVWR444-2791
Extracto de levaduraOxóideLP0021T

Referencias

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