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Artículo de investigación

Expresión, importancia clínica y papel en la evaluación de la eficacia de la inmunoterapia de la molécula coestimuladora LLT1 en el cáncer gástrico

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DOI:

10.3791/68827

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10 de octubre de 2025

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1Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 2Department of Pathology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 3Jiangsu Institute of Clinical Immunology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 4Jiangsu Key Laboratory of Clinical Immunology, Soochow University, 5Jiangsu Key Laboratory of Gastrointestinal Tumor Immunology, The First Affiliated Hospital of Soochow University

En este artículo

Resumen

Esta investigación investiga LLT1 como biomarcador predictivo de inmunoterapia en el cáncer gástrico a través de análisis clínicos y multiómicos. El estudio evalúa el papel de LLT1 en la evasión inmune y la modulación del microambiente tumoral para facilitar enfoques de inmunoterapia de precisión para mejorar los resultados del tratamiento.

Resumen

LLT1 es una nueva molécula de punto de control inmunológico y un objetivo terapéutico potencial. La inmunoterapia ha mejorado los resultados en el cáncer gástrico avanzado; sin embargo, muchos pacientes no responden o desarrollan resistencia, y faltan biomarcadores predictivos. La función de LLT1 en la evasión inmune del cáncer gástrico y su efecto sobre la respuesta a la inmunoterapia aún no están claras. Para evaluar esto, la expresión de LLT1 se analizó en el conjunto de datos de adenocarcinoma gástrico del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) utilizando múltiples algoritmos (TIMER, CIBERSORT y ESTIMATE) para cuantificar la infiltración de células inmunitarias. La expresión de proteínas se validó mediante inmunohistoquímica (IHC) en 268 muestras de adenocarcinoma gástrico y mediante inmunofluorescencia múltiple (MIF) en 115 tejidos posteriores a la inmunoterapia. Se analizaron datos transcriptómicos y proteómicos integrados para determinar las asociaciones con las características del microambiente tumoral y los resultados de la inmunoterapia clínica. Los resultados mostraron que la alta expresión de la proteína LLT1 se asoció significativamente con características tumorales menos avanzadas (menor profundidad de invasión y metástasis ganglionar; P < 0,05) y una mayor supervivencia global (P = 0,012). Los niveles de ARNm y proteínas de LLT1 se correlacionaron con una mayor infiltración de células T CD8+ y macrófagos M1 y una expresión elevada de PD-L1 en el microambiente tumoral. Entre la primera cohorte de 198 pacientes con datos pronósticos disponibles, los pacientes con alta expresión de LLT1 (n = 117) demostraron una supervivencia general significativamente más larga en comparación con aquellos con baja expresión (n = 81). En la segunda cohorte de pacientes tratados con inmunoterapia y quimioterapia combinadas, los tumores con alta expresión de LLT1 (n = 48) tuvieron una supervivencia libre de progresión más larga (p = 0,014) que aquellos con baja expresión de LLT1 (n = 67). Se observó un aumento significativo (P < 0,05) en las poblaciones de células inmunitarias PD-1+CD161+ en pacientes con inmunoterapia efectiva (n = 62) en relación con los pacientes resistentes al tratamiento (n = 53). En conclusión, la expresión de LLT1 es un biomarcador prometedor de un pronóstico favorable en el cáncer gástrico. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que demuestra que la expresión de LLT1 predice una mejor respuesta a la quimioterapia e inmunoterapia combinadas en el cáncer gástrico, lo que respalda su potencial para guiar estrategias inmunoterapéuticas.

Introducción

El cáncer gastroesofágico, particularmente el cáncer gástrico (GC), tiene la distinción de ser la quintaforma más común de cáncer en todo el mundo y laquinta más mortal. Las estadísticas mundiales revelan que cada año se identifican aproximadamente 1 millón de nuevos casos, y Asia oriental soporta una parte desproporcionada de la enfermedad, lo que contribuye a más de la mitad de la incidenciamundial. Para aquellos diagnosticados con GC en etapa temprana, la perspectiva de supervivencia es significativamente favorable, con más del 90% logrando tasas de supervivencia a 5 años después de la disección endoscópica de la submucosa (ESD) o la intervención quirúrgica radical2. Sin embargo, la presentación sutil de los síntomas iniciales a menudo conduce al diagnóstico de una fase localmente avanzada o metastásica 3,4. El pronóstico para los pacientes en estas etapas avanzadas es grave, y los que no reciben tratamiento experimentan una mediana de supervivencia general (SG) de apenas 6 meses. Incluso con la administración de regímenes de quimioterapia combinados basados en fluorouracilo y platino, la mediana de SG simplemente se extiende a aproximadamente un año5.

Recientemente, ha habido un cambio significativo en el tratamiento del cáncer de estómago en etapa tardía, debido a estos nuevos medicamentos llamados inhibidores de puntos de control inmunológicos. Son similares a una bala mágica para las células cancerosas que tienen un cierto marcador, PD-L1, que aparece en ellas, al menos una puntuación de 1 en la escala de puntuación positiva combinada (CPS). Estos tratamientos también son altamente eficaces para los cánceres que están mezclados en su ADN, lo que se denomina alta inestabilidad de microsatélites (MSI-H). Este nuevo enfoque marca la diferencia al proporcionar a los pacientes más tiempo 6,7. Los ensayos clínicos pivotales indican que dentro de la cohorte PD-L1 positiva, los individuos con un CPS de 10 o más obtienen un aumento más pronunciado en la supervivencia después del tratamiento con anticuerpos monoclonales PD-1 8,9. Sin embargo, la inmunoterapia actual aún enfrenta múltiples desafíos clínicos: tasas de respuesta objetiva (ORR) generalmente inferiores al 20%, tasas de resistencia secundaria de hasta el 40% al 60%, sistemas de predicción de biomarcadores imperfectos (los biomarcadores existentes pueden identificar solo al 30%-40% de los beneficiarios potenciales) y dificultades para manejar los eventos adversos relacionados con el sistema inmunológico (irAE)10,11,12,13,14. Aunque el bloqueo dual del punto de control inmunitario (p. ej., inhibición combinada de PD-1 / CTLA-4) o los regímenes de quimioinmunoterapia pueden aumentar las tasas de respuesta al 40% -60%, aproximadamente la mitad de los pacientes aún no logran beneficios clínicos sostenidos15. Por lo tanto, el establecimiento de sistemas de clasificación de precisión basados en características multiómicas, el descubrimiento de nuevos biomarcadores predictivos y la identificación de nuevos puntos de control inmunológicos se han convertido en direcciones de investigación críticas para mejorar los resultados clínicos de la inmunoterapia GC.

La transcripción similar a la lectina 1 (LLT1) es una proteína relacionada con la lectina de tipo C, con CD161, un componente de la familia de receptores de células asesinas naturales (NK), que sirve como su socio de unión identificado. El gen CLEC2D, que es responsable de su síntesis, da lugar a cinco isoformas distintas a través de eventos de empalme alternativos que evitan ciertos exones. La variante 1, conocida como LLT1, ha sido validada como la única variante presente en la membrana celular16,17. La expresión de LLT1 se observa predominantemente en varios tipos de células inmunes, como linfocitos B, células NK, células dendríticas (DC), poblaciones específicas de células T (incluidas las células T activadas y reguladoras), monocitos y macrófagos, y también se observa en ciertas células malignas y durante episodios inflamatorios18. Los hallazgos iniciales indican que LLT1 está regulado al alza en las CD y las células B después de la estimulación del receptor tipo Toll (TLR). Se ha demostrado que el compromiso de LLT1 con CD161 suprime la citotoxicidad mediada por células NK, lo que sugiere su participación en la modulación de la respuesta inmune18. En las células B, la expresión de LLT1 está regulada al alza por infección viral o estimulación inflamatoria. Cuando funcionan como células presentadoras de antígenos (APC), la interacción LLT1-CD161 ejerce efectos inmunomoduladores duales al suprimir la función de las células NK mientras coestimula la proliferación de células T o la producción de γ de IFN19.

Se sabe que LLT1 está presente en una variedad de células cancerosas, incluido el cáncer de mama triple negativo, el glioblastoma y el linfoma no Hodgkin de células B. Esta proteína se involucra con el receptor CD161 que se encuentra en las células NK, bloqueando eficazmente su capacidad para destruir las células cancerosas, ayudando así a la evasión de la respuesta inmune 20,21,22. Una observación notable en el carcinoma orofaríngeo de células escamosas negativo para el VPH es la expresión variable de LLT1, que, según estudios inmunohistoquímicos, indica una importancia pronóstica positiva cuando se expresa altamente dentro de las estructuras linfoides terciarias (TLS), mientras que su presencia en las células tumorales se relaciona con un peor resultado23. Además, en el contexto del cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPNM), LLT1 no se detecta en las propias células cancerosas, sino que se encuentra dentro del microambiente tumoral (TME), y su nivel de expresión de ARNm se asocia con un mejor pronóstico24.

Como lo demostraron Mathewson et al. en la investigación del glioma, el bloqueo de CD161 mejora la muerte de células de glioma mediada por células T in vitro y mejora su función antitumoral in vivo, destacando el potencial terapéutico de CD161 como objetivo de punto de control inmunológico25. Dado que LLT1 es el ligando canónico de CD16118, su papel como diana inmunoterapéutica merece una seria consideración. De manera análoga a la interacción crítica entre PD-1 y PD-L1 en inmunoterapia, la investigación de las funciones biológicas de LLT1 en el cáncer gástrico y su correlación con los resultados de la inmunoterapia tiene un valor clínico significativo.

Este estudio proporciona un análisis exhaustivo de los patrones de expresión de LLT1 dentro del microambiente tumoral del cáncer gástrico, integrando investigaciones de ARNm y a nivel de proteína. Evalúa sistemáticamente el potencial de LLT1 como biomarcador pronóstico en el cáncer gástrico avanzado y evalúa su valor predictivo para la eficacia de la inmunoterapia. Estos conocimientos contribuyen a una comprensión más profunda de su potencial traslacional clínico.

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Protocolo

La investigación con seres humanos fue revisada y aprobada por el Comité de Ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Soochow (Aprobación No. 2019026). La junta de revisión ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Soochow ha aprobado u otorgado una exención para la revisión ética de este uso de datos. Además, se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes.

Análisis de datos bioinformáticos
Después de un examen exhaustivo del análisis de expresión de Pan-cancer de las bases de datos TCGA y Tumor IMmune Estimation Resource (TIMER), se investigó el comportamiento de LLT1 en varios tipos de cáncer, con un enfoque particular en el cáncer gástrico. Se utilizó la base de datos TISIDB para investigar la correlación entre los niveles de expresión de LLT1 y diferentes subtipos moleculares de cáncer gástrico. La correlación entre las características clínicas de los pacientes y la expresión de LLT1 se analizó más a fondo con datos de TCGA a través de la programación R. Se emplearon análisis GO y KEGG para investigar el papel funcional de LLT1 en la carcinogénesis gástrica. El algoritmo ESTIMATE (Estimación de células estáticas e inmunitarias en tejidos tumorales malignos utilizando datos de expresión) se empleó adicionalmente para cuantificar los niveles de infiltración de células inmunitarias y estromales en tejidos tumorales de acuerdo con los patrones de expresión de LLT1. Se realizó un análisis adicional utilizando el algoritmo CIBERSORT para evaluar las correlaciones entre los niveles de expresión de LLT1 y los patrones específicos de infiltración de células inmunes dentro del microambiente tumoral. Se realizó un análisis bioinformático exhaustivo utilizando conjuntos de datos TCGA y programación estadística R (v4.4.1) para interrogar posibles correlaciones entre los perfiles de expresión de LLT1 y los biomarcadores inmunorreguladores. Finalmente, se utilizó la base de datos TCIA (The Cancer Immunome Atlas) para investigar si la expresión de LLT1 podría predecir la respuesta a la terapia de bloqueo del punto de control inmunológico PD-1 / PD-L1.

Especímenes de GAC y construcción de microarrays tisulares (TMA)
Se generaron dos conjuntos de datos de microarrays tisulares de la siguiente manera:

El primer conjunto analizó retrospectivamente muestras de 268 pacientes con GAC que se sometieron a cirugía en 2011. Los patólogos seleccionaron bloques de parafina, identificaron las regiones centrales del tumor y las construyeron en microarrays de tejido. A cada sitio de muestra individual se le asignó un identificador distinto para monitorear meticulosamente los parámetros clínicos asociados, como el sexo, la edad, las dimensiones de la neoplasia, el grado de diferenciación neoplásica, la fase de progresión del cáncer, la profundidad de la invasión, la afectación linfática y la presencia de diseminación a distancia. La duración de la supervivencia global (SG) se definió como el intervalo desde el inicio de la terapia hasta la aparición de la mortalidad o la fecha límite de diciembre de 2017. Cabe destacar que los datos completos de SG solo estaban disponibles para un subconjunto de 198 participantes.

El segundo conjunto incluyó a 115 pacientes sin tratamiento previo con GC avanzado, que se sometieron a resección quirúrgica/endoscópica en el Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Soochow entre 2016 y 2023. Los patólogos evaluaron los bloques de parafina y construyeron micromatrices de tejido con un seguimiento estrecho de la progresión de la enfermedad. En particular, todas las muestras se recolectaron antes de cualquier tratamiento preoperatorio, y el tratamiento postoperatorio consistió principalmente en anticuerpos monoclonales PD-1 combinados con quimioterapia.

Todas las muestras de resección quirúrgica se recolectaron del antro del estómago. Todas las muestras se fijaron en formalina tamponada neutra y se incluyeron en parafina. Con base en la evaluación de las secciones teñidas con H&E, dos patólogos senior identificaron de forma independiente las regiones de tejido más representativas de las muestras incluidas en parafina. Los microarrays de tejidos (TMA) se construyeron utilizando un array de tejidos automatizado, con núcleos de tejido colocados con precisión en los bloques de TMA de acuerdo con módulos predefinidos. Finalmente, los bloques TMA completos fueron seccionados a 4 μm de espesor por un histotecnólogo experimentado.

Inmunohistoquímica (IHC) e inmunofluorescencia multiplex (mIHC)
Se realizaron ensayos inmunohistoquímicos y de inmunofluorescencia multiplex en una micromatriz de tejido construida. La tinción IHQ se realizó de acuerdo con una metodología previamente establecida26. El primer conjunto de secciones de parafina de microarrays se transfirió a portaobjetos de vidrio y se horneó a 72 ° C durante 1 h. Después de que las secciones se desparafinaron con xileno y se rehidrataron en diluciones de etanol sucesivamente crecientes, la actividad de la peroxidasa endógena se bloqueó mediante la aplicación de una solución bloqueadora de peroxidasa durante 30 min. La recuperación de antígenos se realizó hirviendo los portaobjetos a 110 °C en solución de recuperación de antígenos de citrato (pH 6,0) durante 3 min. Después del bloqueo con tampón de bloqueo BSA al 5%, las secciones se incubaron con monoclonal CLEC2D antihumano de ratón, monoclonal CD3 antihumano de ratón (listo para usar), monoclonal CD4 antihumano de ratón (listo para usar), monoclonal CD8 antihumano de conejo (listo para usar), monoclonal CD11c antihumano de ratón (1:50) monoclonal CD19 antihumano de ratón (listo para usar), monoclonal CD31 antihumano de ratón (listo para usar), monoclonal CD31 antihumano de ratón (listo para usar), monoclonal CD56 antihumano de ratón (listo para usar), monoclonal CD68 antihumano de ratón (listo para usar), monoclonal Foxp3 antihumano de conejo (1:50), monoclonal de IL-17 antihumano de ratón (1:50), monoclonal de IFN-γ antihumano de ratón (1:50), monoclonal Ki67 antihumano de ratón (1:50), monoclonal PD-L1 antihumano de ratón (listo para usar) a 4 °C durante la noche27,28. Luego, los portaobjetos se lavaron e incubaron con anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa de rábano picante (anti-ratón y conejo) a temperatura ambiente durante 30 min. Después de la incubación, las muestras se lavaron y se utilizó el sistema de detección EnVision para la inmunodetección. Bajo el microscopio, cuando comienzan a aparecer áreas marrones en el chip, se requiere una observación cuidadosa. La reacción cromogénica debe detenerse una vez que las áreas marrones ya no aumenten. Los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina de Mayer y se montaron con pegamento neutro. En el control negativo, se utilizó IgG de ratón o conejo en lugar del anticuerpo primario. El control positivo fue el tejido de amígdalas humanas. El segundo conjunto de secciones de microarrays se utiliza para inmunohistoquímica multiplex (mIHC). Reutilizando las condiciones de recuperación y bloqueo de antígenos antes mencionadas, el panel de anticuerpos se optimiza espectralmente de la siguiente manera: PD-L1 (480 nm), CD161 (520 nm), LLT1 (570 nm), PD-1 (620 nm), CD8 (690 nm) y PAN-CK (780 nm). Los anticuerpos primarios se incubaron en las mismas condiciones que en el protocolo original29 (excepto PANCK y CD161, que se introdujeron recientemente), a la dilución recomendada de 1:100, seguida de tinción de fluorescencia de amplificación de señal de tiramida (TSA). Después de cada ronda de tinción de fluorescencia, se realiza la extracción de anticuerpos, seguida de la recuperación repetida de antígenos, el bloqueo de la peroxidasa endógena y el bloqueo de objetivos no específicos antes de incubar el siguiente anticuerpo primario. Al realizar inmunohistoquímica multiplex, tres puntos son cruciales: se deben realizar experimentos previos para cada colorante fluorescente, los anticuerpos fuertemente expresados deben combinarse con señales fluorescentes débiles, mientras que los anticuerpos débilmente expresados deben combinarse con señales fluorescentes fuertes, y después de teñir cada marcador fluorescente, los resultados de la tinción deben observarse bajo un microscopio en condiciones protegidas contra la luz. Después de la tinción con el6º colorante fluorescente, se aplica la contratinción DAPI a los núcleos celulares de la etiqueta y se montan los portaobjetos. Finalmente, todos los microarrays de tejidos se escanearon con un escáner de patología digital y se analizaron con un software de análisis de imágenes de patología digital impulsado por IA.

Evaluación de la tinción IHC/mIHC
Los resultados de la tinción fueron interpretados por dos patólogos expertos de forma doble ciego. Midieron la profundidad de la tinción utilizando un objetivo de alta potencia (aumento de 200x) o una configuración fluorescente correspondiente (200x), asignando puntajes que van de 0 (sin tinción) a 3 (tinción intensa). Las fracciones de células positivas para LLT1 dentro de las muestras de carcinoma gástrico se dividieron en cuatro estratificaciones: 0 (<5%), 1 (5-25%), 2 (26-50%) y 3 (>50%). La puntuación de inmunorreactividad (IRS) se derivó del producto de la profundidad de tinción y la proporción de células positivas para LLT1. Los especímenes con una puntuación de cero se consideraron negativos, mientras que las puntuaciones de 1-4 indicaron una expresión débil, 5-7 moderada y 8-9 una expresión fuerte; se aplicaron los mismos criterios para evaluar la expresión de otros marcadores como Ki67 y CD3. Con base en la metodología de evaluación y agrupación, las muestras se etiquetaron como de expresión fuerte (IRS8-9), moderada (IRS5-7), débil (IRS1-4) o nula (IRS0). Los pacientes con las puntuaciones más bajas (IRS≤4) se asignaron al grupo de baja expresión, y los que tenían puntuaciones más altas (IRS≥5) se asignaron al grupo de alta expresión.

Sin embargo, para el marcador PD-L1, se adoptó un enfoque diferente utilizando el CPS. Esta puntuación se determinó mediante la proporción de células positivas para PD-L1 (incluidas las células tumorales, inmunitarias y estromales) con respecto al número total de células tumorales viables ampliadas en un factor de 100. Los individuos con un CPS superior a cinco se colocaron en la cohorte de alta expresión, mientras que aquellos con un CPS de cinco o menos se agruparon en la cohorte de baja expresión.

Agrupación de respuesta a la inmunoterapia
De acuerdo con los Criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos versión 1.1 (RECIST 1.1), la evaluación de las lesiones diana en pacientes se divide en cuatro categorías distintas: (a) Respuesta completa (RC): todas las lesiones diana han desaparecido por completo y el eje corto de todos los ganglios linfáticos patológicos (tanto diana como no diana) debe medir menos de 10 mm; (b) Respuesta parcial (RP): el diámetro acumulado de todas las lesiones diana medibles se ha reducido en al menos un 30% con respecto a las mediciones iniciales; (c) Enfermedad progresiva (EP): esta categoría es aplicable cuando el diámetro acumulado de las lesiones diana ha aumentado al menos un 20% en comparación con el valor más pequeño registrado durante el estudio (utilizando la línea de base como referencia si representa el valor más pequeño), siendo el aumento absoluto no inferior a 5 mm; además, la aparición de nuevas lesiones también se clasifica como enfermedad progresiva (EP); (d) Enfermedad estable (DE): el diámetro acumulado de las lesiones diana no alcanza los criterios de reducción para la RP ni los criterios de aumento para la EP a lo largo del estudio. Se implementaron dos técnicas de estratificación. El primer método consistió en segregar a los pacientes según su estado de respuesta, donde los pacientes con DP (n = 53) y SD (n = 46) comprendían el grupo sin respuesta (n = 99), mientras que los pacientes con RP (n = 15) y RC (n = 1) formaban el grupo de respuesta (n = 16). El segundo enfoque implicó categorizar a los pacientes según la progresión de la enfermedad, con los pacientes de RC, PR y SD clasificados como la cohorte efectiva de inmunoterapia (n = 62) y los pacientes con EP como la cohorte no efectiva de inmunoterapia (n = 53).

Análisis estadístico
Las evaluaciones empíricas se realizaron utilizando la plataforma de computación R (versión 4.4.1) y el paquete de software SPSS Statistical (versión 27.0). Las disparidades entre las cohortes de estudio se investigaron mediante la aplicación del análisis de la tabla de contingencia chi-cuadrado. Se empleó la técnica de correlación no paramétrica de Spearman para probar la fuerza y la dirección de las asociaciones entre variables. Las variaciones del tiempo de supervivencia se analizaron mediante la construcción de estimadores de Kaplan-Meier complementados con pruebas de rango logarítmico para determinar su significación. Posteriormente, se emplearon modelos de regresión de riesgos proporcionales de Cox para identificar los factores que podrían influir en los resultados de supervivencia del paciente. La significación estadística se predefinió como un umbral de valor p bilateral de <0,05. Para garantizar la solidez de los hallazgos, se realizaron análisis de sensibilidad exhaustivos para evaluar posibles variables de confusión, con modelos multivariados ajustados en consecuencia. Además, se proporcionaron interpretaciones explícitas de los cocientes de riesgo para facilitar la comprensión clínica, enfatizando las implicaciones prácticas de los factores de riesgo identificados en el pronóstico del paciente.

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Resultados

Asociación entre la expresión del ARNm de CLEC2D y la subclasificación/parámetros clínicos del cáncer gástrico
Un examen inicial completo del cáncer utilizando el conjunto de datos TCGA, facilitado por la base de datos TIMER, reveló una elevación notable en los niveles de transcripción de CLEC2D en varios tejidos cancerosos, como se muestra en la Figura 1A. Esta observación implica que CLEC2D puede servir como ...

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Discusión

Nuestro estudio mostró una mayor expresión de ARNm de CLEC2D en tejidos tumorales que en tejidos normales. Los resultados inmunohistoquímicos del cáncer gástrico revelaron que la alta expresión de la proteína LLT1 en los tejidos tumorales se asoció con un mejor pronóstico y se correlacionó positivamente con la infiltración de células inmunitarias en el microambiente tumoral. El análisis de tejidos de pacientes con cáncer gástrico que reciben inmunoterapia indicó que la expresión...

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Divulgaciones

Los autores no informan de ningún posible conflicto de intereses.

Agradecimientos

Se extiende un agradecimiento a la base de datos TCGA por proporcionar apoyo de datos. Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención No. 81974375) y las Subvenciones del Plan de Desarrollo de Ciencia y Tecnología de Suzhou (SKY2022129). El estudio se adhiere a las pautas ARRIVE.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tampón de bloqueo BSA del 5%Beijing Solarbio Ciencia & Tecnología Co., Ltd., ChinaSW3015
anti-CD11c ZSGB-BIO, China5D11
Anti-CD161Abcam,Cambridge, Reino Unidoab302564
anti-CD19   ZSGB-BIO, ChinaEPl69
anti-CD3 ZSGB-BIO, ChinaLNl0
anti-CD31ZSGB-BIO, China  UMAB30
anti-CD4ZSGB-BIO, ChinaUMAB64
anti-CD56 ZSGB-BIO, ChinaUMAB83
anti-CD68 ZSGB-BIO, ChinaKP1
anti-CD8ZSGB-BIO, ChinaEP334
Anti-CLEC2DAbcam,Cambridge, Reino UnidoAB197341
anti-Foxp3R& D Systems, Estados Unidos1054C
anti-IFN-γ  Biotecnología de Santa CruzSC-74108
anti-IL-17R& D Systems, Estados Unidos  MAB317 
anti-Ki67 ZSGB-BIO, China8H5
Anti-CitoqueratinaAbcam,Cambridge, Reino Unidoab7753
Anti-PD-1Abcam,Cambridge, Reino UnidoAB137132
Anti-PD-L1DAKO,Dinamarca22C3
Equipo automatizado de matriz de tejidosEstigen OU, Tartu, EstoniaBeecher ATA 27Este instrumento se utiliza principalmente para la construcción de microarrays de tejidos.
Solución de recuperación de antígeno de citratoAladdin Biochemical Technology Co., Ltd, ChinaC752119
Kit de cromógeno DAB AiFang Biológico, ChinaAFIHC004
Escáner digital de patologíaNingbo Jiangfeng Bio-Information Technology Co., Ltd, ChinaKF-FL-020Este instrumento se utiliza principalmente para escanear chips de inmunohistoquímica e inmunohistoquímica multiplex.
GraphPad Prisma 10Software GraphPad, EE. UU.v10.0.3Este software es para trazar curvas de Kaplan-Meier (con análisis estadístico de rango logarítmico), visualización de datos científicos y preparación de figuras.
PBSAladdin Biochemical Technology Co., Ltd, ChinaP743267
Solución bloqueadora de peroxidasaAiFang Biológico, ChinaAFIHC012
Anticuerpo secundario anti-ratón/conejo conjugado con polímero-HRPAiFang Biológico, ChinaAFIHC001
Kit de tinción de inmunofluorescencia múltiple de seis colores y siete marcadoresAiFang Biológico, ChinaAFIHC037Este kit de reactivos está diseñado para inmunohistoquímica multiplex (mIHC)
SPSSIBM Corporation, EE. UU.Estadísticas de IBM SPSS 27El software se utilizó para el análisis estadístico de los datos.
El Proyecto REquipo central de RV4.4.1Todos los paquetes de R, el código relacionado y los archivos originales se han cargado en la base de datos pública.
Software VISIOPHARMVisiopharm,Dinamarca2025.02.2.18022 x64Este software está diseñado principalmente para el análisis cuantitativo de imágenes patológicas.

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