Artículo de método

Plataforma de imágenes sin lentes desplegable en campo para un análisis rápido sin etiquetas de la activación de células asesinas naturales

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DOI:

10.3791/68834

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8 de agosto de 2025

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1Department of Electronics and Information Engineering, Korea University, 2Department of Biotechnology and Bioinformatics, Korea University, 3Metaimmunetech Inc., 4Department of Gastroenterology and Hepatology, Guro Hospital, Korea University College of Medicine, 5Department of Laboratory Medicine, Anam Hospital, Korea University College of Medicine

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En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método sin etiquetas para el análisis rápido de células individuales del recuento y la actividad de las células asesinas naturales (NK) utilizando tecnología de imágenes de sombra sin lentes. Este método cuantifica los cambios morfológicos en células NK individuales mediante el análisis computarizado de sus patrones de difracción.

Resumen

Las células asesinas naturales (NK) son efectores importantes de la inmunidad innata que eliminan las células malignas e infectadas por virus. El monitoreo de la actividad de las células NK es esencial para evaluar la función inmune. Sin embargo, los métodos convencionales, como la citometría de flujo, requieren mucha mano de obra y tiempo. Este protocolo describe una técnica sin etiquetas para el análisis rápido de la actividad de las células asesinas naturales (NK) utilizando la tecnología de imágenes de sombras sin lentes (LSIT). Las células NK aisladas de sangre periférica y estimuladas con un activador patentado se analizaron utilizando la plataforma LSIT en 5 minutos. La plataforma LSIT captura imágenes holográficas, conocidas como imágenes de sombra, creadas por la interferencia de la luz con las células NK, y monitorea su estado de activación mediante el análisis de los cambios en los parámetros de sombra. Los parámetros clave derivados de las imágenes de sombra, incluida la distancia pico a pico (PPD) y la desviación estándar del ancho máximo secundario (WSM-SD), reflejaron cuantitativamente la morfología celular y la complejidad interna. Estos parámetros se integraron en el parámetro de sombra combinado (CSP) y el índice de inmunidad innata (I3) para proporcionar una evaluación y cuantificación integrales de la actividad de las células NK en función de los cambios morfológicos en las células. I3, calculado como el cambio porcentual en CSP después de la activación, sirvió como una medida directa de la actividad de las células NK. Las células NK de individuos sanos mostraron consistentemente valores de I3 significativamente más altos que las de individuos inmunocomprometidos. La plataforma LSIT permite un perfil inmunológico rápido y rentable que es adecuado para el diagnóstico en el punto de atención.

Introducción

La morfología celular está emergiendo como un indicador clave de los mecanismos moleculares. No solo proporciona una representación visual de la estructura celular, sino que también ofrece información valiosa sobre los procesos y funciones subyacentes de las células individuales1. El análisis de la forma, el tamaño y la actividad de las células inmunitarias a nivel unicelular proporciona información crucial sobre su comportamiento, heterogeneidad y funciones en la salud y la enfermedad 2,3,4,5,6.

Entre estas células cruciales se encuentran las células asesinas naturales (NK), que son un componente central del sistema inmunológico innato 7,8. Eliminan las células cancerosas e infectadas por virus y regulan la respuesta inmune adaptativa a través de la liberación de citoquinas 9,10,11. El cáncer, las infecciones virales y las inmunodeficiencias a menudo reducen el número de células NK y perjudican sus funciones 12,13,14. Por lo tanto, la activación de las células NK sirve como un biomarcador importante y proporciona información sobre la salud general del sistema inmunológico. En consecuencia, la evaluación rápida de la activación de las células NK por parte de una sola célula es esencial para el pronóstico, el diagnóstico, el seguimiento de la enfermedad y la estratificación de los pacientes 15,16,17,18.

Actualmente, la actividad de las células NK se evalúa en función de su capacidad citotóxica (capacidad para matar células diana) y la producción de citoquinas 19,20,21,22. Métodos convencionales para medir la citotoxicidad mediada por células23, como los ensayos de liberación de cromo-51 (51Cr)24,25, los ensayos de citometría de flujo26,27 y los ensayos de inmunoadsorción enzimática (ELISA) para cuantificar el interferón-gamma (IFN-γ) secretado por las células NK después de la estimulación 28,29,30 tienen varias limitaciones. Estos incluyen la falta de estandarización, protocolos prolongados (por ejemplo, incubación ELISA durante la noche), dependencia del etiquetado celular y altos costos de equipo 31,32,33. Estos desafíos resaltan la necesidad de métodos innovadores que ofrezcan resultados rápidos, rentabilidad, análisis sin etiquetas y alto rendimiento. Además, la evaluación de la activación de las células NK a nivel unicelular proporciona información detallada sobre la heterogeneidad de la población y las respuestas celulares individuales a la estimulación.

Entre las tecnologías emergentes destinadas a superar estas limitaciones, la tecnología de imágenes de sombras sin lentes (LSIT) es una solución particularmente efectiva 34,35,36. LSIT, una holografía digital en línea (DIH) simplificada, permite un análisis rápido, sin etiquetas y de alto rendimiento de la activación de células NK con una resolución de una sola célula 37,38,39. El DIH captura patrones de interferencia entre la luz láser dispersa y un haz de referencia colineal en un sensor digital para reconstruir información tridimensional (3D) sobre objetos microscópicos 40,41. El LSIT simplifica este enfoque mediante el uso de un LED parcialmente coherente, un microagujero y un sensor CMOS para capturar los patrones de difracción (es decir, imágenes de sombra) de las celdas 42,43,44,45. La justificación de esta técnica se basa en la observación de que la activación de las células inmunitarias a menudo causa cambios morfológicos, incluidas variaciones en el tamaño, la forma, la granularidad citoplasmática y la estructura nuclear de las células 46,47,48,49,50. El LSIT es muy sensible a estos cambios, que tienen un efecto directo en los patrones de difracción 51,52,53.

Basándose en la sensibilidad de LSIT a estos cambios morfológicos y sus efectos sobre los patrones de difracción, este protocolo presenta un método novedoso para la cuantificación rápida y precisa del recuento de células NK y la actividad funcional a nivel de una sola célula utilizando la plataforma Cellytics NK, en lo sucesivo denominada plataforma LSIT54. Como se muestra en la Figura 1A, la plataforma LSIT integra el procesamiento de muestras, la activación y la obtención de imágenes de sombras en un flujo de trabajo multicanal compacto. Las células NK se aislaron de sangre total, se estimularon con un cóctel estimulador de activación (ASC) especialmente formulado y se cargaron en un chip de ensayo dedicado. ASC induce cambios morfológicos en las células NK dentro de 1 h de exposición, como un aumento del tamaño celular y una complejidad interna, que se pueden detectar con precisión utilizando la plataforma LSIT55,56.

La plataforma LSIT utiliza una fuente de luz LED y un sensor CMOS para capturar los patrones DIH (sombras) de las células individuales (Figura 1B). Luego, un algoritmo especial analiza estos patrones de sombra y extrae parámetros clave, como la distancia pico a pico (PPD), que se correlaciona con el tamaño de la célula, y la desviación estándar del ancho del máximo secundario (WSM-SD), que se correlaciona con la complejidad e irregularidad del citoplasma (Figura 1C, D). Al comparar los valores antes y después de la estimulación, la plataforma calcula índices compuestos: el parámetro de sombra combinado (CSP = PPD × WSM-SD) y el índice de inmunidad innata (I³), que reflejan el cambio porcentual en CSP después de la activación. La razón para introducir CSP es que la activación inmune implica tanto el agrandamiento celular como el aumento de la complejidad citoplasmática. Confiar en solo uno de los dos criterios puede pasar por alto la activación límite o verse afectado por el ruido, como escombros o iluminación irregular. El CSP mejora la clasificación al requerir cambios consistentes en ambas métricas. Estos índices clasifican los estados de activación de diferentes poblaciones celulares sin etiquetado fluorescente ni procesamiento complejo de muestras.

Este protocolo es particularmente útil para investigadores y médicos que requieren un método rápido, cuantitativo y sin etiquetas para monitorear los cambios morfológicos inducidos por la activación en las células inmunes. Es adecuado para la investigación inmunológica básica, el cribado preclínico de fármacos y la evaluación de inmunoterapias, y puede utilizarse como herramienta de diagnóstico o pronóstico en entornos clínicos donde la evaluación rápida del estado inmunitario es esencial. Este método requiere poblaciones de células aisladas, acceso a la plataforma LSIT y un cóctel específico de activación de células NK.

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Protocolo

Toda la investigación siguió las pautas institucionales y fue aprobada por la Junta de Revisión Institucional del Hospital Anam de la Universidad de Corea (número de aprobación: 2021AN0040). Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Recogida y manipulación de muestras

NOTA: Manipule todas las muestras de sangre humana utilizando las precauciones de bioseguridad estándar y el equipo de protección personal adecuado.

  1. Recolectar sangre completa periférica del paciente en un tubo de heparina estéril de forma aséptica.
  2. Invierta suavemente el tubo de 8 a 10 veces para mezclar el anticoagulante con la sangre.
  3. Analice la muestra de sangre inmediatamente después de la recolección. Si el análisis se retrasa, almacenar la muestra en un tubo heparinizado a 2-8 °C y utilizar en un plazo de 48 h.
    NOTA: No congele sangre entera. Utilice muestras frescas para preservar la integridad celular.

2. Aislamiento y activación de células NK

NOTA: Este protocolo presenta un flujo de trabajo optimizado y completo para el aislamiento y la activación de células NK directamente de sangre entera humana utilizando el kit NK Prep, que consta del kit NK Sep para el aislamiento celular y el kit NK Activation para la estimulación. Este kit integra la selección y estimulación negativa basada en perlas magnéticas para permitir una evaluación fenotípica rápida a través de una plataforma de citometría de imágenes sin lentes.

  1. Configuración previa a la prueba
    1. Saque los kits del refrigerador y llévelos a temperatura ambiente (15-28 °C).
      NOTA: El kit NK Sep incluye los siguientes componentes:
      (a) Tapa verde: Tubo de reacción que contiene el cóctel de anticuerpos.
      b) Tapa roja: Tubo de separación 1 que contiene partículas magnéticas en el medio de dilución (1,5 ml).
      c) Tapa morada: Tubo de separación 2 que contiene las partículas magnéticas.
      (d) Tapa gris: Tubo de recuperación (limpio y vacío).
      El kit de activación NK incluye los siguientes componentes:
      (a) Vehículo: Ocho tubos transparentes en una bolsa de aluminio sellada.
      (b) ASC: Ocho tubos amarillos en una bolsa de aluminio sellada.
      Retire solo los tubos necesarios de las bolsas selladas. Vuelva a sellar y refrigere los componentes no utilizados.
    2. Prepare el equipo necesario: separador magnético, pipetas con puntas estériles y una incubadora calibrada o un bloque calefactor a 37 °C.
  2. Procedimiento de aislamiento de células NK
    1. Agregue 0,5 ml de sangre completa al tubo de reacción con la tapa verde que contiene el cóctel de anticuerpos. Mezclar suavemente invirtiendo el tubo 2-3 veces e incubar durante 5 min.
    2. Transfiera todo el contenido al tubo de separación 1 con una tapa roja. Mezclar suavemente 2-3 veces.
    3. Coloque el tubo en un separador magnético e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.
    4. Con el imán en su lugar, transfiera aproximadamente 1,5 ml del sobrenadante al tubo separador 2 con tapa púrpura. Mezclar suavemente 2-3 veces.
    5. Coloque el tubo de separación dos en el soporte magnético e incube durante 10 min.
    6. Con el imán aún conectado, transfiera aproximadamente 1,0 ml del sobrenadante a un tubo de recuperación con tapa gris. Mezclar con cuidado.
  3. Activación de células NK
    1. Agregue 100 μL de la suspensión de células NK aisladas al tubo del vehículo y otros 100 μL al tubo ASC
    2. Mezcle cuidadosamente el contenido de los dos tubos.
    3. Incubar los tubos a 37 °C durante 1 h.
      NOTA: Utilice un bloque calefactor calibrado para mantener una temperatura de incubación constante.

3. Imágenes y análisis con la plataforma LSIT

NOTA: Las células deben analizarse inmediatamente después de la incubación. Si no es posible un análisis inmediato, almacene las células incubadas a 2-8 ° C y analícelas dentro de las 6 h. La plataforma LSIT evalúa la morfología celular y el recuento en muestras de sangre humana utilizando DIH. Para analizar la actividad inmunitaria, tanto las células NK no estimuladas como las estimuladas por ASC se cargaron en un portaobjetos especial, se insertaron en el dispositivo y se tomaron imágenes automáticamente.

  1. Configuración y calibración del dispositivo
    NOTA: Realice siempre la calibración en segundo plano antes de analizar una muestra.
    1. Encienda la plataforma LSIT. Asegúrese de que el LED, el ventilador y la cámara estén funcionando.
    2. Inicie el software LSIT Capture . Inicie sesión ingresando su ID y contraseña.
    3. Vaya a Configuración y seleccione Calibrar.
    4. Presione el botón Abrir en la pantalla táctil o use el botón físico de la puerta corredera para abrir la puerta. Cuando se abra el cajón, retire la corredera de calibración y guárdela.
    5. Asegúrese de que no haya ningún portaobjetos de prueba. Cierre el cajón.
      NOTA: Utilice solo toallitas ópticas para limpiar las superficies de los portaobjetos.
    6. Haga clic en Establecer fondo para calibrar la intensidad óptica.
    7. Vuelva a colocar la corredera de calibración y cierre el cajón.
    8. Haga clic en Iniciar calibración.
      NOTA: Si se derrama líquido sobre el dispositivo, apáguelo inmediatamente. Límpielo. No desmonte el dispositivo.
  2. Preparación y carga de portaobjetos de ensayo
    1. Retire un portaobjetos de ensayo de su bolsa, etiquételo con los datos de la muestra y colóquelo sobre una superficie limpia y plana.
    2. Pipetear 10 μL de la muestra del vehículo (no estimulada) en los canales A y B.
    3. Pipetear 10 μL de la muestra estimulada por ASC en los canales C y D.
      NOTA: Evite la formación de burbujas y el sobrellenado.
    4. Presione Abrir para expulsar el cajón, retire la corredera de calibración y colóquela en una caja de almacenamiento.
    5. Inserte el portaobjetos de ensayo preparado y presione Cerrar.
  3. Adquisición de imágenes: Menú de prueba 1 - Actividad de las células NK
    NOTA: Si la adquisición de imágenes falla, compruebe la iluminación y el volumen de la muestra. Vuelva a calibrar si es necesario.
    1. Inicie sesión en el sistema LSIT y seleccione la prueba de actividad de células NK en la pantalla principal.
    2. Ingrese la identificación de la muestra o use el escáner de código de barras.
      NOTA: Para recuperar el ID de muestra de la lista archivada, utilice el botón Recuperar.
    3. Presione Capturar para iniciar la grabación.
    4. Después de capturar la imagen, haga clic en Analizar
    5. Verifique la actividad de las células NK (%) y el recuento de células que se muestran en la pantalla.
      NOTA: Los resultados válidos se muestran numéricamente. Si I3 está por debajo del rango, se muestra "≤100%". Encima del rango, se muestra ">300%".
    6. Descargue los resultados en un USB o imprímalos usando el menú de la pantalla táctil.
  4. Adquisición de imágenes: Menú de prueba 2 - recuento de células
    1. Seleccione la opción Recuento de células en el menú Prueba 2 de la interfaz principal.
    2. Cargue 10 μl de la muestra en un nuevo canal de portaobjetos de ensayo.
    3. Inserte la diapositiva, cierre el cajón e introduzca el ID de muestra.
    4. Introduzca el factor de dilución, si procede.
    5. Presione Contar.
      NOTA: Si el resultado está dentro del rango de prueba, el número de celdas NK se muestra como un valor numérico en la pantalla del sistema. Para los resultados por debajo del rango de prueba, se muestra "≤ 10 células/μL", para los resultados por encima de "> 1.000 células/μL".
    6. Muestra los resultados como células/μL.
      NOTA: Alterne el campo de resultado negro para ver el recuento real de celdas en las imágenes.
    7. Revise los resultados y descárguelos o imprímalos.
      NOTA: Asegúrese de que se ingresa el factor de dilución correcto para obtener resultados precisos.

4. Limpieza posterior al análisis

  1. Abra el cajón con el botón Abrir o el interruptor de palanca físico.
  2. Retire el portaobjetos usado.
  3. Vuelva a colocar la corredera de calibración en el cajón para proteger el sensor.
  4. Cierre el cajón.
  5. Deseche los tubos, puntas y portaobjetos usados de acuerdo con las regulaciones para desechos de laboratorio.

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Resultados

Siguiendo este protocolo, la plataforma LSIT permite una evaluación cuantitativa y sin etiquetas de la activación de las células NK basada en cambios morfológicos en las células. La Figura 2A muestra preparaciones de citospígrafe teñidas con Hema-3 de células NK primarias de donantes sanos después de 2 h de incubación con o sin ASC. La activación por ASC da como resultado cambios marcados, principalmente agrandamiento celular y mayor complejidad interna o granularidad, en comparación con los...

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Discusión

Este protocolo presenta un método estandarizado y sin etiquetas para cuantificar la activación de las células NK que combina el aislamiento y la activación celular utilizando el kit NK Prep, con el análisis a través de la plataforma LSIT. Ofrece una alternativa rápida y cuantitativa a los ensayos convencionales como la liberación de 51Cr, la citometría de flujo y el ELISA. El protocolo fue desarrollado para laboratorios equipados con la plataforma LSIT y proporciona r...

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Divulgaciones

I.L., S.H., H.S.J. y S.S. están afiliados a Metaimmunetech Inc., una empresa involucrada en el desarrollo y comercialización de la plataforma LSIT presentada en este estudio. Específicamente, H.S.J. es el fundador y director ejecutivo, SH es el director ejecutivo y SS es el director de tecnología de la empresa. Sin embargo, los autores afirman que los resultados e interpretaciones de este manuscrito se informan de manera objetiva y no están influenciados por intereses comerciales de ningún tipo. Todos los demás autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por los Programas de Investigación en Ciencias Básicas de la Fundación Nacional de Investigación (NRF) de Corea (Subvención#: RS-2024-00353675, Subvención#: 2021R1I1A3056109), el programa de apoyo ITRC (Centro de Investigación de Tecnología de la Información) supervisado por el IITP (Instituto de Planificación y Evaluación de Tecnologías de la Información y las Comunicaciones) y la Agencia de Promoción de la Comercialización para Resultados de Investigación y Desarrollo (COMPA) financiada por el Ministerio de Ciencia y TIC (MSIT), Corea (Subvención#: IITP-2025-RS-2023-00258971(50%), Subvención#: 2710084652), el programa de apoyo del Instituto Coreano de Promoción de la Ciencia y la Tecnología Marina (KIMST) financiado por el Ministerio de Océanos y Pesca, Corea (Subvención#: 20210660), y la Beca de la Universidad de Corea. Los autores agradecen a Metaimmunetech Inc. por su colaboración, basada en la tecnología transferida de la Universidad de Corea, en el desarrollo del dispositivo Cellytics NK.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de microcentrífuga de 1,7 mlAXYGENMCT-175-CEstéril, libre de ADNasa/ARNasa
Portaobjetos de ensayoMetainmuneAS050-GPortaobjetos dedicado para el sistema Cellytics
50 portaobjetos en una caja
Sistema Cellytics con softwareMetainmuneCS001Plataforma de imágenes de sombras sin lentes
Centrífuga (rotor de cubeta oscilante)LABÓGENO1580R300– 500 &veces; Gama G
Sensor de imagen CMOSIncluido con el dispositivo CellyticsIntegradoSe utiliza para imágenes de difracción
Centrífuga CytospinNasco coreaCitocentrífuga TXT3Para tinción de citocentrifugación
Bloque calefactor digital (37 ° C)Daihan CientíficoDH. WHB00349Para incubación celular
Kit ELISA (IFN-γ)R& Sistema DDIF50CIFN-&gamma humano; Kit ELISA
Citómetro de flujo Guava easyCyteMillipore0500-5005Para el análisis de expresión de CD107a
Paquete de estadísticas Hema 3ThermoFisher122-911Para tinción de citocentrifugación
IL-12 (Humano Recombinante)R& Sistema DComponente de ASC
IL-2 (humano recombinante)Peprotech200-02Componente de ASC
Bastidor de separación magnéticaMetainmuneM13R8Para la separación de cordones
Portaobjetos de microscopioMarienfeld1000612Para preparaciones de citocentrifugación
Kit de activación NKMetainmuneMIT2301V, MIT2301APara la activación de células NK
NK Sep KitMetainmuneMIT2301-500Para el aislamiento de células NK
PE Ratón Anti-Humano CD107a, 100testBD biociencias555801Para el análisis de expresión de CD107a
Abertura estenopeicaIncluido con el dispositivo CellyticsIntegradoUtilizado en la ruta de iluminación LSIT
Pipetas (2– 20 µ L, 20– 200 µ L)AXYGENT-200-YVolumen ajustable
Diapositiva de calibración de sombrasMetainmuneAS050-GPara calibración del dispositivo.
1 Portaobjetos de calibración en 1 Caja de portaobjetos de ensayo
Mezclador de vórticeMerck SI-0246APara resuspensión

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