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Artículo de método

Imágenes químicas de contenido de información ultra alto con microscopía de vida útil de fluorescencia de dos fotones y anti-Stokes coherente de banda ancha

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DOI:

10.3791/68845

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7 de octubre de 2025

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1Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology, 3School of Electrical and Computer Engineering, Georgia Institute of Technology

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este artículo demuestra una plataforma de imágenes multimodal que combina la dispersión Raman anti-Stokes coherente de banda ancha (BCARS), la fluorescencia de excitación de dos fotones (TPEF) y la microscopía de imágenes de fluorescencia de dos fotones (2p-FLIM), lo que permite la bioimagen química de contenido de información ultra alto.

Resumen

La espectroscopia de huellas dactilares Raman y las imágenes de fluorescencia son herramientas emergentes para estudiar los perfiles metabólicos de muestras biológicas. Mientras que la espectroscopia de huellas dactilares Raman detecta vibraciones moleculares intrínsecas que reflejan la composición molecular y el entorno químico de una muestra, las imágenes de fluorescencia miden los cambios en la vida útil del estado excitado de los fluoróforos que son sensibles a sus microambientes. Aquí, presentamos una plataforma de imágenes multimodal que combina la dispersión Raman anti-Stokes coherente de banda ancha (BCARS) y la microscopía de imágenes de fluorescencia de dos fotones (2p-FLIM) que puede adquirir espectros de huellas dactilares Raman biológicamente relevantes y señales de vida útil de fluorescencia in vivo y simultáneamente. La tremenda información química obtenida de las imágenes BCARS y 2p-FLIM co-registradas espacialmente nos permite caracterizar las sutiles diferencias entre los compartimentos subcelulares y verificar los posibles resultados falsos positivos generados solo por las imágenes de fluorescencia. Esto se demuestra comparando directamente las señales de fluorescencia de excitación de dos fotones (TPEF) de BCARS, 2p-FLIM y dos fotones obtenidas simultáneamente del mismo orgánulo teñido con colorante en los C. elegans vivos e intactos que expresan un marcador de proteína fluorescente verde (GFP). En este trabajo, presentamos el esquema de configuración BCARS / 2p-FLIM / TPEF, los pasos de adquisición de imágenes, el procesamiento de datos y los resultados representativos que muestran que el método de imágenes de modalidad cruzada permite una caracterización rigurosa y una detección in vivo con resolución subcelular. Este protocolo proporciona un marco para la obtención simultánea de imágenes químicas y de fluorescencia para mejorar la precisión de la interpretación biológica en sistemas vivos complejos.

Introducción

Un desafío en los estudios biológicos es detectar con precisión los materiales de construcción biológicos en sus estados nativos y dentro de la arquitectura intacta de las células y tejidos. La espectroscopia Raman muestra un potencial sin precedentes para detectar metabolitos intrínsecos y especies químicas dentro de muestras biológicas y ha sido reconocida recientemente como una herramienta emergente para el perfil metabólico de muestras biológicas1. Al analizar los picos de varios grupos metabólicos que se muestran en los espectros de huellas dactilares Raman, cada vez hay más evidencia de que las características de las huellas dactilares se pueden utilizar para detectar las primeras etapas de enfermedades como el cáncer 2,3,4, los trastornos cardíacos 5,6 y las enfermedades neurodegenerativas 7,8 y es particularmente útil para abordar problemas biológicos fundamentales 9,10 incluyendo imágenes de estructuras intracelulares sin ninguna perturbación de etiquetado11, diferenciando varios estados celulares12,13 y clasificación de tipos celulares 14,15,16. La mayor parte de la información química (> 90%) codificada en los espectros Raman se encuentra en la región de huellas dactilares (500 a 1800 cm-1), lo que hace que esta región sea, con mucho, la más útil para discriminar composiciones químicas en muestras biológicas17. Sin embargo, la débil señal Raman en este rango de frecuencia hace que las aplicaciones de la espectroscopia de huellas dactilares Raman a los estudios biológicos sean un desafío, particularmente para muestras biológicas vivas e intactas1.

Los enfoques de imágenes Raman coherentes (CRI) acortan significativamente el tiempo de adquisición de las señales Raman, pero la mayoría de ellas adquieren segmentos espectrales relativamente estrechos y están optimizadas para las señales de estiramiento CH fuertes entre 2800 y 3100 cm-1. Los CARS de banda estrecha y la dispersión Raman estimulada (SRS) (Figura 1A, B) utilizan dos pulsos de picosegundos, generalmente para adquirir una porción estrecha de la fuerte señal CH 18,19,20,21,22,23. Los enfoques CRI multiplex, como los CARS multiplex (Figura 1C), utilizan una combinación de pulsos de picosegundos y ~100 fs para obtener una gama espectral moderada (generalmente ≤ 400 cm-1) generalmente en la región CH 24,25,26,27,28,29,30. La adquisición de un espectro Raman completo biológicamente relevante (de 600 a 3200 cm-1) por píxel utilizando estos enfoques de imágenes suele ser prohibitiva porque la mayoría de las señales de huellas dactilares son de 10 a 100 veces más débiles que las señales de estiramiento CH31. A diferencia de la mayoría de los enfoques CRI, la dispersión Raman anti-Stokes coherente de banda ancha (BCARS) está optimizada para la adquisición de banda ancha de un solo disparo que cubre las regiones de huella dactilar y estiramiento CH 31,32,33. BCARS utiliza interacciones intrapulso de un pulso de ~10 fs para excitar eficientemente vibraciones de baja frecuencia (huella dactilar) (Figura 1D), y utiliza el mismo mecanismo que CARS múltiple, la combinación del pulso fs con un pulso ps para generar coherencia vibratoria en la región de estiramiento CH (Figura 1C)32,33. Además, las señales BCARS están calibradas intrínsecamente debido a su interacción con el fondo no resonante (NRB), lo que da como resultado un espectro Raman completo cuantitativo e invariante del instrumento por pulso láser en cada píxel31, con la capacidad de adquirir rápidamente datos de alto contenido de información de células, tejidos intactos y organismos biológicos vivos 32,34,35,36,37,38,39.

Los espectros BCARS en bruto adquiridos contienen un fuerte llamado "fondo no resonante" (NRB). El NRB es la contribución de la respuesta electrónica a los pulsos láser que no es químicamente específica. El NRB interfiere coherentemente con la señal vibratoriamente resonante, actuando como un amplificador heterodino32. El NRB también distorsiona el espectro Raman subyacente (Figura 2A), pero el espectro Raman se puede recuperar siempre que se adquieran secciones espectrales contiguas significativas. Actualmente, no existe un método de posprocesamiento disponible para separar la señal CARS resonante de la componente no resonante utilizando un enfoque CARS de banda estrecha. La recuperación de la señal Raman de la señal CARS de banda ancha se puede lograr utilizando la relación de Kramers-Kronig en el dominio del tiempo (o transformada de Hilbert)33,40 (Figura 2B), entropía máxima41,42 o aprendizaje automático 43,44,45,46,47,48 Enfoques. Tenga en cuenta que los dos primeros métodos recuperan analíticamente la fase (la señal Raman resonante) de los espectros BCARS sin procesar, los enfoques de aprendizaje automático pueden depender en gran medida de la instrumentación y los modelos de entrenamiento.

Si bien la microscopía BCARS permite la caracterización sin etiquetas del perfil metabólico de muestras biológicas, el mismo láser supercontinuo (950 - 1200 nm para la configuración BCARS presentada en este trabajo) utilizado para la generación de señales BCARS también puede excitar una amplia gama de colorantes, como colorantes a base de rodamina, Bodipy, Alexa Fluor y cianina, y varias proteínas fluorescentes, incluidas GFP y mCherry49. Artículo 50. En comparación con la excitación de un solo fotón que utiliza láseres de onda continua (CW) visibles, la microscopía de fluorescencia multifotónica, como la microscopía de imágenes de fluorescencia de dos fotones (2p-FLIM) y la microscopía de fluorescencia de excitación de dos fotones (TPEF), que utiliza luz infrarroja cercana (NIR) ofrece una profundidad de penetración de muestra más profunda, capacidad de corte 3D intrínseca, imágenes de alto contraste y una buena resolución comparable a la microscopía confocal de última generación, lo que la convierte en una herramienta atractiva para la microscopía biológica investigación 51,52. La microscopía de imágenes de fluorescencia de por vida (FLIM) que utiliza un enfoque de recuento de fotones únicos correlacionado en el tiempo (TCSPC) detecta las señales de decaimiento de fluorescencia excitadas repetidamente por una fuente láser modulada en el tiempo53,54. El espectro de fluorescencia de un fluoróforo dado puede cambiar con factores ambientales como la polaridad del solvente, pero estos cambios suelen ser sutiles. Por otro lado, los tiempos de vida de la fluorescencia a menudo varían por factores de dos o más con cambios ambientales como valores de pH55, viscosidad56, polaridad57 y concentración de especies iónicas58,59, interacciones de unión, presencia de apagadores o cambios estructurales 53,54. Esta propiedad única de la vida útil de la fluorescencia proporciona un contraste de señal adicional en las imágenes de fluorescencia y ha abordado con éxito los problemas de interferencia de autofluorescencia en imágenes celulares y tisulares60, desmezclando múltiples fluoróforos utilizando un enfoque FLIM resuelto espectralmente61, diagnóstico de cáncer y monitoreo del tratamiento62, detección sin etiquetas de heterogeneidad celular63 y cambios metabólicos64,65.

En este trabajo, presentamos una plataforma de imágenes multimodal que combina BCARS, 2p-FLIM y TPEF. Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que se presenta una plataforma de imágenes que permite imágenes simultáneas de BCARS y 2p-FLIM / TPEF. Demostramos las capacidades de imagen in vivo de este instrumento utilizando un organismo modelo genéticamente tratable ampliamente utilizado, Caenorhabditis elegans (C. elegans). Mostramos que los espectros BCARS, las desintegraciones 2p-FLIM del rojo del Nilo (un colorante lipídico vital) y las señales GFP de fluorescencia de dos fotones de un marcador lipídico informado (DHS-3::GFP) se pueden adquirir simultáneamente in vivo de gusanos teñidos con rojo Nilo. Una guía práctica para el enfoque de imágenes que se presenta aquí incluye: (i) la muestra debe ser ópticamente transparente y con un espesor típicamente inferior a 100 μm; (ii) la condición de tinción puede ser diferente según los tintes y las muestras. En los resultados de la tinción de rojo Nilo de C. elegans que se muestran aquí, la concentración de rojo Nilo está en un nivel de ~μM y el tiempo de tinción puede variar desde unas pocas horas hasta la noche66; (iii) se requiere un entorno de muestra oscuro para evitar fugas de luz visible en los detectores 2p-FLIM/TPEF. Estas condiciones de imagen son idénticas a las condiciones de imagen de la mayoría de las microscopía óptica y de fluorescencia no lineal. Además, nuestro sistema que se muestra aquí se puede aplicar aún más para detectar otros tintes e indicadores fluorescentes además del rojo Nilo y GFP mediante la introducción de un láser adicional Ti: Sapphire fs que cubre un rango de 700 a 950 nm para la excitación de fluorescencia de dos fotones. Por lo tanto, mientras que los resultados representativos descritos en este protocolo son las imágenes in vivo de C. elegans teñidos con colorante que expresan GFP, la plataforma de bioimagen química de contenido de información ultra alto tiene aplicaciones que son amplias y de gran alcance.

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Protocolo

1. C . Preparación de muestras de elegans y tinción de Rojo Nilo Vital

NOTA: C. elegans se ha utilizado mucho para múltiples técnicas de imagen debido a su transparencia en todo el cuerpo. Los órganos y tejidos internos se pueden visualizar fácilmente en el animal intacto sin disección. Además, no se requiere aprobación ética para la investigación con C. elegans, ya que no se consideran vertebrados y no están sujetos a las mismas regulaciones éticas que los animales superiores como los roedores. Esta sección describe la sincronización de gusanos C. elegans y la preparación de muestras teñidas con rojo Nilo para imágenes de fluorescencia. Los gusanos adultos sincronizados de un día se obtienen a través de un protocolo de puesta de huevos de dos generaciones y se tiñen con placas Nile Red-OP50 recién preparadas.

  1. Mantenga las cepas de C. elegans (p. ej., N2, LIU1 ldrIs1 [dhs-3p::d hs-3::GFP + unc-76(+)]) en placas estándar de medio de crecimiento de nematodos (NGM) sembradas con bacterias OP50 a 20 °C.
  2. Sincronizar los gusanos
    1. Recoja de 10 a 20 gusanos adultos grávidos en una placa NGM recién sembrada con OP50 recién hecha.
    2. Incubar la placa a 20 °C durante 1-3 h para permitir la puesta de huevos.
    3. Retire todos los gusanos adultos, dejando solo los huevos recién puestos en el plato.
    4. Incubar la placa a 20 °C hasta que los gusanos alcancen la etapa adulta de un día.
    5. Repita los pasos anteriores para una generación adicional para mejorar la precisión de la sincronización.
  3. Preparar la solución madre de Nile Red
    1. Disuelva 15,92 mg de rojo del Nilo en 10 ml de DMSO hasta una concentración final de 5 mM.
    2. Sonicar durante 10-30 minutos si es necesario para ayudar a la disolución.
  4. Prepare placas de tinción Nile Red-OP50.
    1. Mezcle bien la suspensión bacteriana OP50 con el stock de rojo del Nilo para lograr una concentración final de rojo del Nilo de 5 μM por placa NGM. Por ejemplo, mezcle 10 μL de la reserva de rojo del Nilo con 20 μL de suspensión bacteriana OP50 y luego aplique inmediatamente toda la mezcla a una placa de agar NGM de 6 cm (con un volumen de ~ 10 ml) sin sembrar para obtener una concentración final de Nile Red de 5 μM por placa NGM.
    2. Extienda la mezcla uniformemente en platos NGM de 6 cm sin semillas.
    3. Guarde los platos en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche para permitir el crecimiento bacteriano y la absorción de tintes.
  5. Tinción de gusanos sincronizados
    1. Transfiera 30-50 gusanos adultos sincronizados de un día a cada plato preparado de Nile Red-OP50.
    2. Incube los gusanos en la oscuridad a 20 ° C durante 1-2 h antes de obtener imágenes.
  6. Inmovilizar gusanos para obtener imágenes
    1. Aplique una gota de azida sódica 100 mM en una almohadilla de agarosa al 2% en un portaobjetos de microscopio (aproximadamente 10-15 μL para 20 gusanos)
    2. Transfiera los gusanos teñidos a la gota de agente anestésico (azida de sodio) y cubra los gusanos con un cubreobjetos antes de la microscopía.
      NOTA: Cuando recoja de 10 a 20 adultos grávidos en una placa NGM OP50 recién hecha en el primer paso de la sincronización de la puesta de huevos, solo recoja los adultos, pero no los huevos o larvas perdidos. Esto es para asegurarse de que todos los huevos restantes en las placas sean producidos por los gusanos recogidos dentro de la ventana de tiempo de puesta de huevos de 1-3 h. Además, la azida de sodio está clasificada como un material peligroso, aunque requiere una cantidad muy pequeña para la anestesia de nematodos. El uso y la eliminación de los residuos de azida sódica deben seguir las directrices del departamento institucional de Salud y Seguridad Ambiental.

2. Generación del haz de la sonda

NOTA: Este protocolo describe la generación del haz de sonda de picosegundos (ps) utilizando un oscilador paramétrico óptico (OPO) construido en casa seguido de la generación de segundos armónicos (SHG) con un sistema de bucle de retroalimentación de señal construido en casa para estabilizar la potencia de salida del haz de la sonda.

  1. Encienda el láser de bomba OPO de 1030 nm (Figura 3A o el láser de bomba OPO cercano a 1ps, ~3 W que se muestra en la Figura 4) y deje al menos 2 h para el equilibrio térmico. La salida estable es fundamental para el funcionamiento de OPO.
  2. Guíe la salida a la cavidad OPO
    1. Seleccione el período de polarización apropiado en el cristal OPO PPLN (Figura 3A) para que coincida con la longitud de onda de la señal objetivo.
    2. Dirija el haz hacia el primer espejo curvo (CM) (Figura 3A), formando parte de una cavidad lineal.
    3. Asegúrese de que el haz pase a través del cristal de niobato de litio (PPLN) de OPO con polos periódicos (Figura 3A) para facilitar la conversión descendente paramétrica óptica (Figura 3B).
    4. Asegúrese de que el haz se refleje en un segundo espejo curvo (CM) y luego en el espejo final (EM) (Figura 3A) para formar el bucle de la cavidad.
    5. Configure el acoplador de salida (OC) (Figura 3A) para extraer el haz de señal generado de la cavidad.
  3. Ajuste la temperatura del cristal OPO PPLN usando el controlador de temperatura (TC) (Figura 3A) para seleccionar la longitud de onda de la señal. Una longitud de onda de señal típica es de 1530 nm, lo que corresponde a una potencia de salida de aproximadamente 0,8 W cuando se bombea con 3 W a 1064 nm.
  4. Optimice la alineación de OPO
    1. Ajuste la posición y la inclinación de dos CM y EM para maximizar la potencia de salida y la calidad del haz.
    2. Ajuste la longitud de la cavidad para cambiar el espectro de la señal a la frecuencia deseada.
  5. Dirija el haz de señal OPO a través de un conjunto de ópticas de colimación y enfoque y guíelo hacia la etapa SHG.
    1. Seleccione el período de polarización apropiado en el cristal SHG PPLN (Figura 3A) para que coincida con la longitud de onda de la señal objetivo.
    2. Controle con precisión la temperatura del cristal utilizando un controlador de temperatura para maximizar la eficiencia de SHG.
    3. Dirija el haz hacia el cristal SHG PPLN para la generación de segundos armónicos, convirtiendo la señal OPO de 1530 nm a 765 nm (Figura 3C). La eficiencia típica de conversión de SHG es de aproximadamente el 30% en condiciones óptimas de alineación.
    4. Inserte un filtro de paso corto de 1300 nm (SPF en la Figura 3A, especificaciones en la Tabla de materiales) después del SHG PPLN para eliminar la luz fundamental residual de 1530 nm.
    5. Colimar el haz resultante de 765 nm utilizando una lente adecuada (como L en la Figura 3A).
  6. Implementar estabilización de potencia
    1. Use una ventana de cuña (WW) para muestrear el haz SHG y dirigirlo a un fotodiodo (PD).
    2. Asegúrese de que un bucle de retroalimentación compare la señal del fotodiodo (PD en la Figura 3A) con un valor de referencia y accione el picomotor en el espejo final (EM) para ajustar la longitud de la cavidad OPO en tiempo real, estabilizando así la potencia de salida SHG.
      NOTA: Para determinar el valor de referencia, primero escanee la posición EM usando el Picomotor mientras registra la potencia de salida SHG. Identifique la intensidad máxima en este perfil, luego establezca el valor de referencia en el 90% del pico. Esta elección garantiza una dirección clara de corrección de retroalimentación, lo que permite que el sistema compense las tendencias crecientes y decrecientes de la potencia y estabilice eficazmente la potencia de salida a lo largo del tiempo.

3. Generación de supercontinuo (SC) para BCARS

NOTA: En la Figura 4 se muestra el esquema simplificado del sistema multimodal basado en BCARS. Este protocolo describe la generación del haz SC.

  1. Ajuste el pre-chirrido (dispersión de retardo de grupo, GDD) a la salida de pulso de femtosegundo (fs) (1030 nm, 150 fs, ~1 W) para obtener un ancho de banda SC lo suficientemente amplio que cubra las señales de la región de huellas dactilares (ancho de banda SC ≥ 1800 cm−1). Logre esto ajustando la separación de un par de rejillas (consulte la Figura 4), lo que permite un control preciso sobre la dispersión.
    NOTA: La aplicación de GDD precompensada es crucial para generar el pulso deseado y optimizar la generación de SC. El valor GDD requerido puede variar según las características específicas del sistema láser utilizado.
  2. Incorpore un telescopio de haz que consta de dos lentes con las mismas distancias focales para ajustar la divergencia del haz de la bomba.
    NOTA: Cuando el haz viaja a lo largo de metros antes de entrar en la fibra de ensanchamiento, el control preciso de la divergencia del haz se vuelve esencial. Mantener un haz colimado durante esta distancia es fundamental para garantizar una generación eficiente de SC.
  3. Configure el alineador automático (Figura 4) utilizando soportes de espejo cinemático equipados con actuadores piezoeléctricos para la dirección del haz. Combínelos con cuñas ópticas y un detector de detección de posición (PSD) para monitorear activamente y corregir la alineación del haz.
  4. Coloque los componentes de manera que la distancia desde la cuña hasta el primer espejo sea igual a la distancia desde la cuña hasta el primer PSD. Esta configuración simétrica garantiza la estabilidad del rayo en la fibra de ensanchamiento.
    NOTA: La alineación activa es esencial para maximizar la eficiencia del ensanchamiento espectral y minimizar el riesgo de daños en la entrada de fibra.
  5. Utilice una placa de media onda (HWP) y un divisor de haz polarizador (PBS) para controlar la potencia del láser antes de acoplarse a la fibra. Gire el HWP para ajustar el ángulo de polarización en relación con el PBS, ajustando así la potencia transmitida. Si bien estos componentes no se muestran en la Figura 4, son fundamentales para la alineación segura y el control de potencia.
  6. Acople aproximadamente 1 W de potencia láser en una fibra de cristal fotónico (PCF) de mantenimiento de polarización de área de modo grande (LMA-PM-5) de 10 cm utilizando un acoplador de fibra. El procedimiento de acoplamiento es el siguiente:
    1. Primero, reduzca la potencia del láser a ~ 20-50 mW durante la alineación inicial para evitar daños a la fibra.
    2. Dirija el haz colimado hacia la fibra, asegurándose de que surja algo de luz del otro lado. Optimice la trayectoria del haz ajustando su posición para maximizar la potencia de salida.
    3. Inserte la lente asférica (Figura 4), vuelva a ajustar el haz para maximizar la potencia de salida.
    4. Ajuste la posición z de la lente asférica para garantizar un enfoque preciso en la faceta de la fibra.
    5. Repita los ajustes de alineación y enfoque de forma iterativa para maximizar la eficiencia del acoplamiento.
    6. Aumente la potencia del láser a 1 W para su funcionamiento.
  7. Colimar la salida resultante del supercontinuo de banda ancha (SC) del PCF utilizando un espejo parabólico fuera del eje (OAP) con una distancia focal f = 15 mm, como se muestra en la Figura 4.
    NOTA: Se prefieren las ópticas reflectantes, como el espejo OAP, para los haces de banda ancha para minimizar la aberración cromática introducida por los elementos refractivos.
  8. Guíe la salida del supercontinuo de banda ancha colimado (SC) a un compresor de prisma (Figura 4) que consta de un par de prismas Schott Flint (SF10).
    1. Dirija el haz SC hacia el vértice del primer prisma para iniciar la dispersión espectral.
    2. Coloque el segundo prisma de manera que el haz disperso entre por su vértice.
    3. Monte ambos prismas en un sistema de rieles para permitir un ajuste grueso de la separación del prisma. Traslade el segundo prisma a lo largo del riel para ajustar la longitud de la trayectoria óptica y la compresión general. La separación para este sistema es de 44 cm.
    4. Monte el primer prisma en una platina de traslación lineal de precisión. Ajuste la profundidad de inserción del primer prisma para ajustar la compensación de dispersión.
    5. Ajuste iterativamente tanto la separación del prisma como la longitud de inserción del segundo prisma para lograr una compresión temporal óptima del pulso SC. Determine la compresión temporal óptima haciendo coincidir la señal de mezcla degenerada de cuatro ondas (DFWM) observada experimentalmente con resultados simulados que tienen en cuenta la dispersión de retardo de grupo (GDD) y la dispersión de tercer orden (TOD). Este enfoque implica realizar una simulación del proceso de generación del supercontinuo, incorporando los efectos de GDD y TOD, que proporciona una referencia para las características temporales y espectrales esperadas de los pulsos SC comprimidos de manera óptima. Luego, ajuste iterativamente los parámetros del compresor de prisma para compensar el GDD y el TOD presentes en el sistema hasta que la señal DFWM experimental coincida con las predicciones de simulación. En la Figura 5 se muestra un resultado típico del perfil espectral del SC.
      NOTA: La compensación de dispersión adecuada mejora la coherencia espectral del SC. Bajo una alineación óptima, la salida SC tiene una potencia de aproximadamente 150 mW, una longitud de onda central de alrededor de 1060 nm y abarca un rango espectral de 950 a 1200 nm (correspondiente a 1800 cm−1). Estos valores pueden variar ligeramente según la alineación y la eficiencia del acoplamiento de la fibra.
  9. Combine los haces de la sonda y el supercontinuo utilizando un espejo dicroico (ver DM en la Figura 4). Alinéelos con un par de orificios para asegurarse de que ambas vigas sean colineales. Enfoque los haces combinados en un fotodiodo de alta frecuencia (ancho de banda de 1 GHz). Para una calidad de señal óptima, ambos haces deben superponerse tanto en el dominio espacial como en el temporal. El proceso es el siguiente:
    1. Dirija la salida del fotodiodo a un osciloscopio de alta frecuencia (ancho de banda de 500 MHz). Utilice el disparador láser como reloj de referencia.
    2. Bloquee el haz de la sonda y mida los pulsos SC. Registre las diferencias temporales entre los pulsos SC y la referencia del láser.
    3. Bloquee el haz SC y mida los pulsos de la sonda. Ajuste la línea de retardo mecánico (como se muestra en la Figura 4) de modo que los pulsos de la sonda se superpongan con los pulsos SC en el tiempo. Asegúrese de que los dos haces alcancen su máximo simultáneamente.
    4. Retire el fotodiodo y deje que el haz penetre en el microscopio.
      NOTA: Los pasos anteriores describen un ajuste grueso para la superposición de vigas. En los pasos 6.1 a 6.9 se trata una optimización adicional para una alineación más precisa.

4. Configuración de la detección de fluorescencia para 2p-FLIM y TPEF e introducción de un láser adicional Ti: Sapphire fs

  1. Encienda el láser Ti:Sapphire y deje que alcance el equilibrio térmico. Espere aproximadamente 2 h para garantizar una potencia de salida estable y un apuntamiento del haz.
    NOTA: En este estudio, las imágenes de TPEF y FLIM se realizaron utilizando la fuente SC, que proporciona una amplia cobertura espectral y suficiente potencia para fluoróforos como GFP y Nile Red. El láser Ti:Sapphire se incluye en el sistema como una fuente de excitación opcional para fluoróforos con picos de absorción de dos fotones por debajo de 950 nm, que pueden no ser excitados de manera eficiente por el SC.
  2. Active el mecanismo de bloqueo de modo en el láser Ti:Sapphire. Confirme el bloqueo de modo estable a través del monitor incorporado.
  3. Pre-chirrido de los pulsos de Ti:Sapphire para una compresión temporal óptima en la muestra utilizando un compresor de prisma. Organice los prismas en una configuración similar a la descrita en el paso 3.8 y ajuste la longitud de inserción del segundo prisma para ajustar la duración del pulso.
    NOTA: La compresión temporal adecuada garantiza la intensidad máxima y una excitación eficiente de dos fotones en el plano de la muestra.
  4. (Opcional) Acople el haz Ti: Sapphire en una fibra monomodo que mantenga la polarización si el láser está ubicado en una mesa óptica separada. Ajuste la óptica de acoplamiento de entrada y controle la salida de fibra para minimizar las pérdidas de acoplamiento.
  5. Combine el haz de Ti: Zafiro con el supercontinuo (SC) y los haces de la sonda usando un espejo dicroico (consulte el punto de combinación en PBS que se muestra en la Figura 3). Alinee los haces con cuidado para asegurar la superposición espacial en el dicroico y la propagación conjunta hacia el microscopio.
  6. Guíe los haces combinados al microscopio y ajuste su superposición espacial. Utilice una muestra fluorescente (por ejemplo, un portaobjetos con perlas de poliestireno fluorescente de 1 μm) para verificar la alineación del haz de Ti:Zafiro en relación con la trayectoria de excitación de BCARS. Ajuste los espejos de alineación Ti:Sapphire para asegurarse de que la emisión de fluorescencia se localice conjuntamente con el punto focal BCARS dentro del mismo campo de imágenes. Confirme la colocalización visualizando la superposición entre las imágenes BCARS y TPEF que se adquieren simultáneamente, donde el desplazamiento espacial debe ser inferior a un píxel.
    NOTA: Lograr la superposición espacial entre las señales de fluorescencia y BCARS es esencial para el registro de imágenes multimodales.
  7. Inserte un espejo dicroico antes de la entrada del microscopio para reflejar la fluorescencia retrodispersada hacia la ruta de detección. Seleccione un dicroico con una longitud de onda de corte adecuada para separar eficientemente la fluorescencia de los haces de excitación.
  8. Inserte un segundo espejo dicroico aguas abajo en la ruta de emisión para dividir la señal de fluorescencia en dos ramas de detección:
    1. Transmita longitudes de onda ≥ 550 nm al detector FLIM.
    2. Refleje longitudes de onda ≤ 550 nm hacia un tubo fotomultiplicador (PMT) para la detección analógica de fluorescencia excitada por dos fotones (TPEF).
      NOTA: Instale filtros de paso de banda en cada rama de detección para bloquear la luz de excitación residual y aislar bandas de emisión específicas.
  9. Conecte la salida PMT a un preamplificador y alimente la señal analógica amplificada en un dispositivo de adquisición de datos (DAQ). Comparta el disparador de sincronización global de la matriz de puertas programables de campo (FPGA) con el DAQ para garantizar la alineación temporal en todas las modalidades de imágenes (Figura 7).
  10. Conecte la salida del detector FLIM a un módulo de conteo de fotón único correlacionado con el tiempo (TCSPC).
    1. Conecte la señal del detector FLIM a la entrada de inicio del módulo TCSPC.
    2. Conecte la salida de sincronización del láser Ti:Sapphire (o BCARS SC) a la entrada de referencia del módulo TCSPC.
    3. Conecte el disparador de cámara global (generado por la FPGA) a la entrada de sincronización de fotogramas del módulo TCSPC para sincronizar con la adquisición de imágenes escaneadas en línea.

5. Configuración de la ruta de detección de BCARS

NOTA: Este protocolo describe la configuración de una ruta de detección de escaneo para imágenes hiperespectrales de escaneo lineal. El espejo galvo 1D escanea el haz de excitación a lo largo del eje y con un tiempo de permanencia de 2-4 ms por píxel para una integración de señal suficiente. Después de cada escaneo de línea, la etapa de muestra avanza un paso a lo largo del eje x. La eliminación de escaneo utilizando un espejo galvo secundario sincronizado es esencial para mantener un registro espacial consistente de la señal espectral en la cámara durante el escaneo rápido del haz, eliminando la diafonía de la señal entre píxeles adyacentes y preservando la fidelidad espacio-espectral39.

  1. Introduzca el supercontinuo (SC) y los haces de la sonda en un escáner galvo unidimensional (1D) (como se muestra en la Figura 4 y más detalles en la referencia39). Coloque el espejo galvo conjugado en la abertura posterior del objetivo de enfoque para permitir un escaneo preciso del haz en todo el campo de visión.
  2. Expanda cada haz usando un expansor de haz reflectante (como se muestra en la Figura 4) para que coincida con la apertura posterior del objetivo de excitación. Esto garantiza un enfoque óptimo y la máxima resolución espacial en el plano de la muestra.
    NOTA: Utilice ópticas reflectantes para minimizar la aberración cromática y mantener el contenido espectral de banda ancha del haz SC.
  3. Coloque un objetivo de alineación en el plano de apertura posterior del objetivo de excitación. Ajuste los haces SC y de la sonda para que ambos pasen por el centro del objetivo, asegurando la coalineación a lo largo del eje óptico.
    NOTA: La superposición espacial precisa maximiza la intensidad de la señal BCARS y garantiza la máxima resolución espacial en el punto focal.
  4. Enfoque los haces en la muestra utilizando un objetivo de excitación de alta NA (por ejemplo, 1,2 NA, objetivo de inmersión en agua de 60x) montado en un microscopio invertido.
  5. Prepare una muestra de alineación intercalando una gota de agua entre dos cubreobjetos para crear un portaobjetos de microscopio sellado. Coloque el portaobjetos preparado en la platina del microscopio y ajuste el enfoque para que la muestra esté a la vista.
  6. Recoger la señal anti-Stokes generada en la transmisión utilizando un objetivo de recogida colocado frente a la ruta de excitación.
  7. Implemente un sistema de deescaneo 4f (como se muestra en la Figura 4) para preservar el mapeo espacial de la señal anti-Stokes en filas fijas del detector.
    1. Transmita el plano focal posterior (BFP) del objetivo de recolección al eje del espejo galvo de debarrido utilizando un sistema óptico 4f. Consiste en dos lentes de tubo de precisión (ver Tabla de materiales), dispuestas de tal manera que:
      1. La primera lente se coloca a una distancia focal (200 mm) después del BFP del objetivo de recolección.
      2. La segunda lente se coloca a una distancia focal antes del espejo galvo.
    2. Sincronice el galvo de escaneo con el galvo de escaneo utilizando un generador de forma de onda controlado por FPGA.
    3. Integre un potenciómetro digital de 7 bits en el sistema de control FPGA para permitir el ajuste de la amplitud galvo de debarrido.
      NOTA: El espejo galvo de barrido compensa las deflexiones angulares introducidas por el galvo de barrido primario. Al ajustar dinámicamente su ángulo en sincronía, contrarresta el movimiento del haz, asegurando que la señal anti-Stokes permanezca alineada a lo largo del eje óptico que conduce al espectrómetro. Esta estabilización es esencial para mantener el registro espacial en el detector y evitar el desplazamiento lateral de la imagen espectral durante el escaneo.
  8. Configure el sistema FPGA (consulte la tabla de materiales) para sincronizar el escaneo galvo y el disparo de la cámara.
    1. Genere salidas analógicas para los galvos de escaneo y deescaneo.
    2. Acepte un activador de etapa de entrada para marcar el inicio de cada escaneo de línea.
    3. Captura de fotogramas de salida de señales de disparo a la cámara científica complementaria de semiconductores de óxido metálico (sCMOS) en cada posición de escaneo.
    4. Controle de forma independiente la amplitud de escaneo para adaptarse a diferentes objetivos de recolección.
      NOTA: Un tren de pulsos FPGA típico incluye una señal de variador galvo de escaneo, una señal de variador galvo de desescaneo, una entrada de disparo de escenario y un reloj de píxeles para temporización de fotogramas sincronizada.
  9. Pase la señal anti-Stokes colimada a través de dos filtros de paso corto para bloquear la bomba residual y la luz de excitación SC.
  10. Enfoque la señal anti-Stokes filtrada a través de la rendija de entrada del espectrómetro y en el detector sCMOS. Ajuste los ángulos de los galvos de escaneo y deescaneo para asegurarse de que el haz se escanee paralelo al eje largo de la rendija, alineando el plano de la imagen óptica con la rendija. Esta alineación precisa maximiza la resolución espectral y minimiza la diafonía de la señal lateral en las filas de detectores.
  11. Configure el espectrómetro para dispersar el espectro anti-Stokes verticalmente a lo largo de las filas de la cámara. Seleccione una rejilla adecuada (por ejemplo, 300 líneas/mm, encendida a 700 nm) para una cobertura espectral óptima.

6. Optimización de la señal y calibración de la resolución espectral

  1. Inicie el software de adquisición casero y comience a monitorear la señal en tiempo real desde la cámara sCMOS. El software de adquisición está construido en Python 3.8+ (Windows 10) con dependencias que incluyen controladores Hamamatsu DCAM-API y Measurement Computing Universal Library, que generan datos en formato HDF5. El software está disponible a petición razonable del autor correspondiente.
  2. Prepare una muestra de calibración espectral colocando una gota de benzonitrilo entre dos cubreobjetos para formar un portaobjetos sellado. Coloque el portaobjetos en la platina del microscopio y enfríelo con el objetivo de excitación.
  3. Localice la señal BCARS en la cámara sCMOS. Ajuste la posición z del objetivo de recolección para maximizar la intensidad de la señal anti-Stokes.
  4. Ajuste la posición lateral del objetivo de recolección para asegurarse de que la luz anti-Stokes se enfoque correctamente a través de la rendija de entrada del espectrómetro. Esta alineación garantiza un acoplamiento óptimo en el espectrómetro y una fidelidad espectral mejorada.
  5. Optimice la superposición espacial entre el supercontinuo (SC) y los haces de sonda en el plano de muestreo. Utilice espejos en la trayectoria del haz de la sonda para ajustar con precisión su posición lateral y ángulo de incidencia.
  6. Traslade la línea de retardo óptico en la trayectoria del haz de la sonda para garantizar la superposición temporal con los pulsos SC. Supervise la intensidad de la señal y ajústela hasta que se maximice la señal anti-Stokes, confirmando la sincronización temporal adecuada.
  7. Identifique un pico Raman fuerte y nítido en benzonitrilo (p. ej., 1002 cm-1) en la imagen sCMOS.
  8. Registre la longitud de onda de la sonda y su posición de píxel correspondiente en la cámara. Utilice la línea de Rayleigh (0 cm-1 en la longitud de onda de la sonda) y los picos Raman de benzonitrilo conocidos a 1002 cm-1 y 3073 cm-1 para establecer un mapeo lineal de píxeles a número de onda a través del detector sCMOS. La línea de Rayleigh proporciona la referencia de número de onda cero, mientras que los picos de benzonitrilo determinan el incremento del número de onda por píxel.
    NOTA: Dado que el análisis solo requiere información relativa del número de onda (mapeo entre la posición del píxel y el desplazamiento Raman), no es necesaria la calibración de la longitud de onda absoluta utilizando lámparas de emisión.
  9. Ingrese el mapeo de número de onda de píxeles en el software de adquisición. Esta calibración debe seguir siendo válida a menos que se realicen cambios en la trayectoria óptica, la configuración de la rejilla en el espectrómetro o la alineación.

7. Adquisición de señales

  1. Cargue la muestra de C. elegans preparada en los pasos 1.1 a 1.6 en la platina del microscopio. Localice una región de interés y enfóquela utilizando el objetivo de excitación.
  2. Identifique una región en el portaobjetos que carezca de la señal activa de Raman (fondo de agua o un cubreobjetos de vidrio desnudo) para servir como referencia de fondo no resonante (NRB).
  3. Localice la señal BCARS en el detector sCMOS. Ajuste la posición z del objetivo de recolección para maximizar la intensidad de la señal anti-Stokes.
  4. Ajuste la posición lateral del objetivo de recolección para asegurarse de que la luz anti-Stokes esté correctamente alineada a través de la ranura de entrada del espectrómetro.
  5. Inicie el escaneo y desescaneo sincronizado de espejos galvo usando el FPGA. Ajuste la amplitud del galvo de deescaneo usando el potenciómetro digital hasta que la desviación angular del escaneo primario esté completamente compensada. La señal anti-Stokes debe permanecer confinada dentro de ~ 12 filas en la cámara en todo el rango de escaneo.
  6. Definir una secuencia de adquisición temporal
    1. Adquiera una señal de correlación cruzada entre el SC y los pulsos de la sonda retrasando el pulso de la sonda. Para adquirir esto, trace la señal BCARS integrada de tres colores frente al retardo de tiempo del pulso de la sonda. La señal más fuerte aparecerá en el momento 0 cuando los pulsos SC y de la sonda se superpongan temporalmente.
      NOTA: Dado que los sistemas de detección FLIM y TPEF comparten el mismo disparador que BCARS, sus señales se adquieren simultáneamente durante este punto de tiempo.
    2. Registre con un retraso posterior del haz de la sonda (por ejemplo, 1-2 ps) para BCARS y un retraso posterior del haz SC para fondo no resonante (espectros NRB en la Figura 6A). Cuando se aplica un retardo de tiempo al pulso de banda estrecha (sonda), el NRB en la señal CARS de tres colores se puede suprimir de manera efectiva y, por lo tanto, se puede mejorar la relación señal/ruido67.
    3. Adquiera una imagen oscura sin superposición temporal entre el SC y la sonda para capturar el ruido del detector de referencia (referencia oscura).
    4. Guarde todas las imágenes BCARS, NRB y oscuras, incluidos los metadatos en un solo archivo h5.
  7. Protocolo de procesamiento de señales BCARS
    1. Abra el software CRIkit268.
    2. Cargue todos los conjuntos de datos necesarios con la herramienta Open HDF como se muestra en la Figura 6B: Cargue datos hiperespectrales de BCARS, referencia NRB y referencia oscura. Seleccione la región de frecuencia dentro del ancho de banda de generación de señal BCARS utilizando la herramienta Ventana de frecuencia (de 400 cm-1 a ≥ 3200 cm-1 para el sistema BCARS que se muestra aquí).
    3. Realice pasos de preprocesamiento:
      1. Utilice la herramienta Anscombe (como se muestra en la Figura 6B) para estabilizar la varianza de los conjuntos de datos BCARS y NRB.
      2. Utilice la herramienta Eliminar ruido para realizar la descomposición de valores singulares (SVD): conserve los componentes principales en función de la inspección visual. Conserve los componentes que exhiben distribuciones espaciales que coincidan con la morfología de la muestra y descarte los componentes dominados por ruido no estructurado o moteado. Este paso de eliminación de ruido mejora la relación señal-ruido (SNR), particularmente para características espectrales de baja intensidad.
      3. Utilice la herramienta Inverse Anscombe para restaurar los datos a su dominio original.
        NOTA: Estos pasos se pueden omitir si se realiza el procesamiento en tiempo real en la adquisición.
    4. Recupera espectros similares a Raman usando la transformación de Kramers-Kronig (KK):
      1. Abra la herramienta KK (como se muestra en la Figura 6B).
      2. Habilite Norm a NRB para garantizar la normalización de referencia espectral adecuada.
      3. Establezca parámetros que incluyan el sesgo NRB, el factor de relleno y el promedio de píxeles de borde.
      4. Ejecute la transformación KK para obtener espectros Raman recuperados.
    5. Realizar correcciones de errores posteriores a KK
      1. Corregir errores de fase usando el suavizado Savitzky-Golay: Abra la herramienta de corrección de errores de fase (Figura 6B). Ajuste el tamaño de la ventana de suavizado y el orden polinómico. Inspeccione los espectros originales frente a los corregidos mediante el panel de vista previa .
      2. Corregir errores de escala: Abra la herramienta de corrección de errores de escala (Figura 6B). Normalice los espectros para corregir la escala de intensidad relativa en el conjunto de datos. Garantice la coherencia entre las dimensiones espaciales y espectrales.
    6. Calibrar eje espectral (opcional, si está desalineado): Abra la herramienta de calibración (Figura 6B). Compare los números de onda medidos con los picos de referencia conocidos. Aplique la pendiente/intersección corregida para realinear el eje espectral.
    7. Definir y extraer datos de regiones de interés (ROI)
      1. Utilice el ROI Spect. o Pt Spect. (Figura 6B) para marcar regiones espaciales de interés o puntos de interés en la imagen BCARS.
      2. Visualice y compare el contenido espectral de diferentes ROI.
      3. Exporte los espectros recuperados para su posterior análisis cuantitativo o quimiométrico.

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Resultados

La Fig. 5 muestra los espectros medidos de la sonda de banda estrecha y los impulsos del supercontinuo de banda ancha (SC) utilizados para la excitación de BCARS. El pulso de la sonda, generado a través de la segunda generación armónica de una señal de ~ 1530 nm de un oscilador paramétrico óptico construido en casa (OPO, Figura 3), se centra en 764,2 nm con un ancho completo a la mitad del máximo (FWHM) de 0,2 nm, lo que proporciona la resolución espect...

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Discusión

Este trabajo demuestra en detalle la arquitectura de BCARS y la plataforma de imágenes 2p-FLIM/TPEF. Si bien se utiliza un láser de doble salida de 1030 nm en nuestra configuración actual, la mayoría de los láseres de fibra fs de 1030 nm de alta potencia se pueden usar como fuente láser maestra para construir un microscopio BCARS. Al elegir cuidadosamente la longitud y el período de los cristales OPO / SHG PPLN, se puede generar un pulso de sonda de unos pocos ps con una bomba sub-ps OPO...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar y no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

W-W.C. agradece el apoyo de los NIH (R21AG086974). M.T.C. agradece el apoyo del Departamento de Energía de EE. UU. (DOE BERDE-SC0022121).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
CámaraHamamatsuFusión ORCAsCMOS, 2304 veces; 2304 píxeles
Objetivo de la colección  Olimpo  LUMPLFLN60XW  Inmersión en agua, 1.0 NA
DAQ  Diligente  MCC USB-1208HS  Tarjeta de adquisición de datos
Línea de retardo  Newport  DL225  Retardo mecánico para el pulso de la sonda
Dicroico  Semrock  FF925-Di01  combinación de sonda y SC
Dicroico  Semrock  FF705-Di01  Detección de fluorescencia en modo epi
Dicroico  Laboratorios de Thorlabs  DMLP550R  separar la señal FLIM y la señal TPEF
Objetivo de excitación  Olimpo  UPLSAPO60XWIR  Inmersión en agua, 1.2 NA
Filtro  Semrock  FF01-1326/SP-25  Rechazar el láser fundamental después de SHG
Filtro  Semrock  FF01-758/SP  Rechazar el láser fundamental antes de la cámara BCARS
Filtro  Laboratorios de Thorlabs  FESH0650  Rechazar el láser fundamental antes de la modalidad de fluorescencia
FLIM PMT  PicoQuant  PMA Híbrido  Detector de fotón único FLIM
FPGA  Redpitaya  STEMlab 125-14  Sincronización y activación de análisis
Galvo  Laboratorios de Thorlabs  GVS101  Para escanear y desescanear
Rejilla  Coherente  LightSmyth 1040nm  1000 ranuras/mm, pre-chirrido para SC
Placa de media onda  Laboratorios de Thorlabs  AHWP05M-980  Control de polarización
K-cubo  Laboratorios de Thorlabs  KPA101 Controlador PSD para el alineador automático
Láser  Instrumentos prospectivos  FSX-Dual  Láser de femtosegundo de doble salida
Láser  Coherente  Mira-900  Láser de femtosegundo para excitación de fluorescencia
PBS  Laboratorios de Thorlabs  PBS255  Combinación de haces para SC y sonda
PCF  Laboratorios de Thorlabs  LMA-PM-5  Fibra de cristal fotónico de 10 cm para la generación SC
PD  Laboratorios de Thorlabs  PDA100A2  Bucle de retroalimentación OPO
Soporte de espejo piezoeléctrico  Laboratorios de Thorlabs  POLARIS-K1S2P  Ajustador piezoeléctrico para el alineador automático
Preamplificador  EdmundÓptica  59-179  Preamplificador TPEF
Prisma  Óptica de investigación Lambda  EQP-30SF10  Compresión SC
PSD  Laboratorios de Thorlabs  PDQ80A  Detector sensible a la posición para el alineador automático
Espectrómetro  Instrumentos Teledyne Princeton  IsoPlano 160  Rejilla de 300 g/mm, centrada a 700 nm
Etapa  ASI  MS-2000  Etapa motorizada de 3 ejes
TCSPC  PicoQuant  Multiarpa 150  Dispositivo de conteo de fotones para FLIM
TPEF PMT  Hamamatsu  H9305-03  Detector TPEF
Lente de tubo  Laboratorios de Thorlabs  TL200-2P2  Utilizado en el sistema de deescaneo

Referencias

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