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Imágenes de células vivas de la segregación cromosómica durante la meiosis de ovocitos de ratón

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DOI:

10.3791/68847

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10 de octubre de 2025

 , 
1The Christopher Chen Oocyte Biology Research Laboratory, UQ Centre for Clinical Research, The University of Queensland

En este artículo

Resumen

Aquí, resumimos las técnicas de imágenes de células vivas para estudiar la segregación cromosómica en ovocitos de ratón, utilizando H2B-RFP para la cromatina y SiR-Tubulina para la visualización del huso. Detallamos la preparación de muestras, la microinyección, el cultivo, la configuración de imágenes y el análisis, ofreciendo una guía práctica para lograr imágenes de alta resolución y mínimamente fototóxicas de la dinámica de los cromosomas meióticos.

Resumen

La segregación cromosómica precisa durante la meiosis de los ovocitos es esencial para garantizar un desarrollo embrionario adecuado y prevenir trastornos relacionados con la aneuploidía. Las imágenes de células vivas combinadas con técnicas de marcado de fluorescencia se han convertido en un enfoque poderoso para estudiar la dinámica de los cromosomas meióticos con alta resolución espaciotemporal. En este protocolo, resumimos las metodologías clave para visualizar la segregación cromosómica en ovocitos de ratón vivos, centrándonos en el uso de la histona H2B-RFP para el etiquetado de la cromatina y SiR-Tubulina para el seguimiento del huso. Describimos los procedimientos para la preparación de muestras, la microinyección de ARNm, el cultivo de ovocitos, la configuración de la cámara de imágenes de células vivas y la configuración de microscopía confocal, todos optimizados para lograr imágenes de alta resolución y minimizar la fototoxicidad. Además, destacamos consideraciones experimentales críticas como la fototoxicidad, el procesamiento de imágenes y el análisis cuantitativo de eventos meióticos. Al proporcionar una evaluación exhaustiva de las metodologías actuales, este protocolo sirve como una guía práctica para los investigadores que buscan investigar la dinámica cromosómica en ovocitos vivos y mejorar la precisión y reproducibilidad de los estudios meióticos.

Introducción

La visualización precisa de la dinámica cromosómica y del huso durante la meiosis de los ovocitos es fundamental para comprender los mecanismos que gobiernan la maduración de los gametos femeninos y el riesgo de aneuploidía 1,2,3,4,5. Los ovocitos de mamíferos experimentan una serie altamente coordinada de eventos meióticos, que incluyen la descomposición de la vesícula germinal (GVBD), la condensación cromosómica, el ensamblaje del huso y la división asimétrica6. Si bien las imágenes de punto de tiempo fijo han proporcionado valiosas instantáneas de estos procesos, carecen de resolución temporal y no pueden capturar eventos transitorios o rápidos que ocurren entre intervalos de muestreo. Por el contrario, la obtención de imágenes de células vivas de cromosomas y microtúbulos marcados con fluorescencia ofrece un enfoque poderoso para monitorear estos procesos dinámicos en tiempo real 2,3,7. Esto permite la observación directa del tiempo, la duración y la secuencia de los eventos meióticos dentro de los ovocitos individuales, y permite la identificación de eventos transitorios que de otro modo podrían pasarse por alto en muestras fijas. Sin embargo, mantener la viabilidad y la integridad fisiológica de los ovocitos durante la microinyección y la obtención de imágenes requiere un manejo meticuloso y condiciones optimizadas8.

Este protocolo describe un flujo de trabajo integral para microinyectar ovocitos en etapa de vesícula germinal (GV) de ratón con ARNc H2B-RFP, lo que permite el etiquetado fluorescente de la cromatina, seguido de imágenes confocales de lapso de tiempo de los cromosomas y el comportamiento del huso a lo largo de la meiosis4. El método integra pasos clave que incluyen cebado hormonal, aislamiento de ovocitos, microinyección en condiciones de temperatura controlada e imágenes en vivo mediante microscopía confocal con control ambiental 4,9. El objetivo general de este artículo es presentar un flujo de trabajo robusto y reproducible para la visualización en tiempo real de la dinámica cromosómica y del huso en ovocitos de ratón vivos, proporcionando una plataforma para investigar los mecanismos moleculares y celulares subyacentes a la regulación meiótica y el riesgo de aneuploidía.

Si bien este protocolo proporciona una alta resolución temporal y espacial, se basa en la expresión del reportero exógeno, que puede no replicar completamente la dinámica de las proteínas endógenas y podría interferir con los procesos meióticos nativos si se sobreexpresa. Los investigadores deben considerar estas limitaciones y validar los hallazgos utilizando enfoques complementarios cuando sea posible.

Este protocolo está diseñado para apoyar estudios que investiguen los mecanismos meióticos, los errores de segregación cromosómica y el impacto de las perturbaciones genéticas o ambientales en la calidad de los ovocitos. Proporciona una plataforma sólida tanto para la investigación básica como para las aplicaciones traslacionales en biología reproductiva.

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Protocolo

Todos los experimentos deben realizarse de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Ética Animal local. Los procedimientos experimentales deben adherirse estrictamente a los principios de las 3R: reemplazo, reducción y refinamiento. Los ratones deben alojarse en un animalario acreditado en condiciones ambientales estandarizadas (22 °C, 60% de humedad) con libre acceso a alimentos y agua.

1. Recogida y preparación de ovocitos

NOTA: Todo el equipo y los reactivos deben ser estériles. Realice toda la manipulación de ovocitos con una pipeta bucal bajo un microscopio estereoscópico (consulte la tabla de materiales). Cubra todas las gotas del medio de cultivo con aceite mineral (Figura 1A-E).

  1. Estimulación hormonal
    1. Inyecte ratones hembra de 3-4 semanas de edad por vía intraperitoneal con 5 unidades internacionales (UI) de gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG; ver Tabla de materiales) 46-48 h antes de la recolección de ovocitos.
      NOTA: Se prefieren los ratones B6CBAF1 (descendientes F1 de C57BL / 6J × CBA / CaCrl) debido al rendimiento superior de ovocitos y las características de maduración favorables.
  2. Preparación de medios de cultivo
    1. Filtre los medios M2 y M16 (consulte la tabla de materiales) con un filtro de jeringa de 0,2 μm. Complementar con IBMX a una concentración final de 100 μM diluyendo a partir de un stock de 100 mM.
    2. Prepare 5-6 gotas de M2-IBMX (~30 μL cada una) y 3 gotas de M16-IBMX en placas de cultivo de tejidos de plástico de 35 mm. Superponga todas las gotas con aceite mineral. Coloque las placas M2-IBMX en un bloque caliente a 37 °C (Figura 1A) y las placas M16-IBMX en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C durante al menos 30 min antes del aislamiento de ovocitos (Figura 1C).
    3. Prepare un plato adicional que contenga 800-1,000 μL de M2-IBMX (sin aceite) para la disección de ovarios. Coloque sobre una placa calefactora a 37 °C montada sobre un microscopio estereoscópico (Figura 1B).
  3. Aislamiento de ovocitos
    1. Sacrificar ratones por luxación cervical. Limpie la parte inferior del abdomen con etanol al 70%, luego haga una pequeña incisión horizontal en la piel y el peritoneo para ingresar a la cavidad peritoneal. Extienda la incisión separando los bordes de la incisión con los dedos.
    2. Con fórceps, barre el intestino para exponer los ovarios en la parte superior del abdomen, ubicados en el polo superior de los riñones. Con pinzas finas y microtijeras, extirpe cuidadosamente los ovarios evitando dañar el tejido. Transfiera inmediatamente los ovarios a un tubo de 1,5 ml que contenga 100-200 μl de medio M2-IBMX precalentado.
    3. Transfiera los ovarios a 1 ml de medio M2-IBMX precalentado y muévalos a una platina de microscopio de disección calentada (Figura 1B). Retire con cuidado el tejido adiposo y los restos oviductales.
      NOTA: Manipule los ovarios con cuidado para evitar daños en los folículos u ovocitos. Mantener los ovarios en un medio caliente durante la transferencia de la sala de animales al laboratorio.
    4. Libere complejos cúmulo-ovocito (AOC) mediante la punción de folículos con una aguja de 27 G (Figura 1A-B). Recoja los AOC y transfiéralos a gotas de 25-30 μL de M2-IBMX (Figura 1D).
    5. Disociar las células del cúmulo mediante pipeteo repetido con una pipeta Pasteur de vidrio de diámetro estrecho (Figura 1E).
      NOTA: Si bien el pipeteo bucal se usa comúnmente para el manejo de ovocitos, los pipetas mecánicas o micromanipuladores brindan alternativas, especialmente en entornos donde el pipeteo bucal está restringido o no es factible. Estas alternativas se han empleado con éxito en protocolos similares10,11.
    6. Identifique y seleccione ovocitos en etapa GV completamente desarrollados en función de un GV de mayor diámetro y ubicado en el centro utilizando un microscopio estereoscópico con un aumento de 20x-40x. Transfiera a 30 μL frescos de gotas de M2-IBMX en un bloque caliente a 37 °C, protegido de la luz.
      NOTA: Mantenga los ovocitos a 37 °C durante todos los procedimientos para preservar la integridad fisiológica. Precaliente todos los medios y utilice platinas con temperatura controlada para toda la manipulación y microinyección basadas en microscopio.
    7. Deje que los ovocitos se recuperen durante 20 min en una etapa calentada a 37 °C antes de la microinyección.

2. Preparación de ARNc H2B-RFP

NOTA: Realice todos los pasos con guantes en un ambiente limpio y libre de ARNasa. Use solo agua y reactivos libres de ARNasa, y preferiblemente trabaje en presencia de inhibidores de ARNasa.

  1. Verifique la secuencia del plásmido H2B-RFP (consulte la tabla de materiales) mediante la secuenciación de Sanger utilizando cebadores que flanquean el inserto. Amplifique el plásmido transformando E. coli competente (p. ej., DH5α), seleccionando una sola colonia y cultivándola en caldo LB con antibióticos apropiados. Purifique el plásmido con un kit de preparación midi o maxi estándar. Para procedimientos detallados, consulte Green y Sambrook12.
  2. Purifique el ADN plasmídico con un kit de minipreparación comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuantifique la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro.
  3. Linealizar 2-4 μg de ADN plasmídico aguas abajo del inserto utilizando una enzima de restricción adecuada que corte una vez en la columna vertebral del vector (NotI se usó para H2B-RFP). Configure la reacción de digestión utilizando el tampón y la concentración de enzima adecuados como se describe en la Tabla 1 e incube a 37 °C durante 1-2 h. Confirmar la linealización completa mediante electroforesis en gel de agarosa. Múltiples bandas indican una digestión incompleta. Si usa un kit comercial, siga las instrucciones del fabricante.
    NOTA: Elija una enzima de restricción que corte con precisión aguas abajo del inserto y en condiciones óptimas de digestión. Verifique la linealización pasando una pequeña alícuota en un gel de agarosa.
  4. Elimine la contaminación por ARNasa incubando la reacción de digestión con 1 μL de proteinasa K (10 μg/mL), 5,3 μL de SDS al 10% y 50 μL de agua libre de nucleasas a 50 °C durante 1 h.
    NOTA: Este paso es esencial para eliminar la ARNasa y los contaminantes proteicos. Utilice solo reactivos sin ARNasa y mantenga condiciones de trabajo limpias.
  5. Extraiga el ADN digerido con fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24: 1), seguido de una extracción con cloroformo.
    NOTA: Para minimizar la toxicidad y agilizar la manipulación de muestras, también se pueden utilizar métodos comerciales de purificación basados en columnas o perlas (por ejemplo, membrana de sílice o sistemas de perlas magnéticas) en lugar de la extracción con fenol/cloroformo.
  6. Precipitar el ADN añadiendo acetato de sodio 3 M y etanol al 100%. Incubar a -80 °C durante al menos 2 h.
  7. Granular el ADN por centrifugación a 12.000-14.000 x g durante 10 min a 4 °C. Lavar el pellet con etanol al 70%, centrifugar de nuevo a la misma velocidad durante 5 min a 4 °C, secar al aire brevemente (2-5 min) y volver a suspender en 6 μL de agua libre de RNasa.
    NOTA: Después de la precipitación y centrifugación de etanol, se debe formar un gránulo translúcido o blanco visible en el fondo del tubo. Si no se ve ningún gránulo, repita la centrifugación a una velocidad más alta o vuelva a evaluar la concentración de ADN.
  8. Realizar la transcripción in vitro utilizando el kit mMESSAGE mMACHINE T7 (ver Tabla 2), siguiendo el protocolo del fabricante.
  9. Incubar la reacción de transcripción a 37 °C durante al menos 2 h. Extender la incubación si la longitud de la transcripción supera los 5 kb.
  10. Eliminar el ADN molde mediante tratamiento con ADNasa utilizando 1 U de ADNasa I por volumen de reacción de 10 μL, incubado a 37 °C durante 15 min.
  11. Purificar el ARNc sintetizado mediante precipitación de cloruro de litio13. Después de la precipitación y la centrifugación, se debe formar un gránulo translúcido o blanco visible en el fondo del tubo. Lave el gránulo de ARN con etanol al 70%.
  12. Vuelva a suspender el gránulo de ARNc final en 20 μL de agua libre de ARNasa. Mida la concentración de ARN y confirme la presencia y la longitud de la cola de poli(A) realizando RT-PCR seguida de secuenciación del producto de PCR. Alícuota del ARNc en volúmenes de 1 μL y guárdelo a -80 °C.

3. Preparación y microinyección de ovocitos

NOTA: Durante todo el procedimiento, mantenga los ovocitos a 37 ° C utilizando medios precalentados y platinas de microscopio con temperatura controlada para preservar la calidad de los ovocitos.

  1. Preparación
    1. Descongele las alícuotas de ARNc H2B-RFP en hielo, centrifugue brevemente y diluya a la concentración deseada (p. ej., 250 ng/μL).
      NOTA: La concentración óptima de ARNc puede variar según la construcción, el sistema de expresión y los objetivos experimentales. Recomendamos ajustar la concentración de ARNc (por ejemplo, dentro del rango de 50-300 ng/μL) para minimizar los artefactos de sobreexpresión y garantizar una señal suficiente. Los usuarios también deben monitorear la progresión meiótica (p. ej., GVBD, formación de husos y extrusión de cuerpos polares) como una lectura funcional de la salud y viabilidad de los ovocitos después de la expresión del constructo. Se ha informado que las concentraciones inyectables de ARNc suelen oscilar entre 0,2 y 1 μg/μL, con resultados óptimos a menudo logrados a 0,5 μg/μL 2,3,4,5,7,8,9.
    2. Prepare agujas de microinyección a partir de capilares de vidrio de borosilicato (DE = 1,5 mm, DI = 0,86 mm, longitud = 100 mm) utilizando un extractor de pipetas (Figura 2A).
      NOTA: Utilizamos un extractor de pipetas vertical (consulte la Tabla de materiales; Figura 2A). Optimice los parámetros de extracción empíricamente. La punta de la aguja debe ser lo suficientemente fina para minimizar el daño a los ovocitos, pero lo suficientemente ancha para evitar obstrucciones y permitir una administración suave de ARNc.
    3. Cargue 0,5-1,5 μL de solución de ARNc en la punta de la aguja utilizando puntas de microcargador sin ARNasa. Elimine las burbujas de aire antes de la inyección.
  2. Configuración de la antena parabólica de microinyección
    1. Prepare un plato de microinyección con 100 μL de medio M2-IBMX y cúbralo completamente con aceite mineral para evitar la evaporación y los cambios de osmolaridad.
  3. Microinyección de ovocitos
    1. Monte las pipetas de retención e inyección en el sistema de micromanipulador (Figura 2B, C).
    2. Coloque el plato de microinyección en la platina del microscopio. Con una pipeta bucal, transfiera los ovocitos a la gota M2-IBMX.
    3. Coloque las pipetas de retención e inyección en el mismo plano horizontal que los ovocitos.
    4. Capture un ovocito mediante succión suave con la pipeta de retención (Figura 2B y C).
    5. Inserte la aguja de inyección a través de la zona pelúcida y el oolema, apuntando al citoplasma y evitando el núcleo.
    6. Administre ARNc H2B-RFP utilizando un breve pulso de capacitancia negativa a través de un electrómetro intracelular (Figura 2B-E). Mantenga el volumen de inyección aproximadamente al 5% del volumen de ovocitos. Una inyección exitosa suele ser visible como una dispersión pequeña pero distinta del citoplasma. Ajuste la presión de inyección y el tiempo de inyección para evitar daños en la membrana.
    7. Retire la aguja rápida y suavemente en el mismo ángulo para minimizar el desgarro de la membrana.
    8. Libere el ovocito de la pipeta de retención y vuelva a colocarlo en un área separada del plato para distinguir los ovocitos inyectados de los no inyectados (Figura 2F). Para esta configuración, organice el flujo de trabajo manteniendo los ovocitos no inyectados en la parte superior del plato y moviendo los inyectados a la parte inferior.
    9. Repita los pasos 3.3.4-3.3.8 para todos los ovocitos restantes. Las tasas de supervivencia después de la inyección varían según la técnica y las propiedades del ARNm. Espere una viabilidad del 60% al 80%.
  4. Manipulación posterior a la inyección
    1. Transfiera los ovocitos inyectados a una gota fresca de medio M16-IBMX en una placa de cultivo limpia.
    2. Incubar a 37 °C durante 1-4 h para permitir la expresión de H2B-RFP. Ajuste la duración de la incubación en función de la concentración de ARNc, el tamaño de la transcripción y la eficiencia de expresión.

4. Imágenes de lapso de tiempo de cromosomas marcados con H2B-RFP durante la meiosis

  1. Preparación de equipos y medios
    1. Precaliente la incubadora de platina de microscopio confocal y la cámara ambiental a 37 °C durante ≥ 30 min antes de su uso (Figura 3A). Encienda el controlador de gas e inicie el flujo de gas para mantener la cámara al 5% de CO2 y O2 ambiente. Asegúrese de que la cámara esté humidificada para apoyar la salud de los ovocitos durante las imágenes de células vivas extendidas.
    2. Preparar gotas de cultivo: Colocar 5-6 gotas de 50 μL de medio M16 suplementado con SiR-Tubulina (concentración final de 100 nM) en una placa de Petri de 35 mm. Recubrimiento con aceite mineral. En un plato de imágenes con fondo de vidrio separado, coloque tres gotas de 5 μL de M16 + SiR-Tubulina y cúbralas con aceite mineral. Precaliente ambos platos a 37 °C durante ≥ 30 minutos antes de usar.
  2. Transferencia y lavado de ovocitos
    1. Lavado de ovocitos: Transfiera los ovocitos inyectados secuencialmente a través de las gotas de 50 μL M16 + SiR-Tubulina para eliminar el IBMX residual (se recomiendan 5 lavados). Realice lavados suavemente para evitar daños en los ovocitos.
      NOTA: El IBMX residual puede inhibir la reanudación de la meiosis, por lo que es fundamental lavarlo a fondo.
    2. Transferencia final: Después de los lavados, transfiera 15-20 ovocitos a la gota de 5 μL de M16 + SiR-Tubulina en el plato de imágenes con fondo de vidrio precalentado.
  3. Configuración del microscopio
    1. Plato de imágenes de montaje: Coloque el plato con fondo de vidrio en la platina del microscopio confocal (Figura 3A). Deje que los ovocitos se asienten durante ~ 10 min.
    2. Posicionamiento de la etapa: Utilizando imágenes de campo claro, centre los ovocitos en el campo de visión. Guarde posiciones con el software del microscopio.
      NOTA: En este estudio, utilizamos un microscopio confocal Leica TCS SP8 con una lente de objetivo de inmersión en agua HC PL APO 20x/1.0 NA. Sin embargo, se pueden utilizar otros sistemas confocales y lentes de objetivo con especificaciones similares según la disponibilidad.
    3. Configuración de la bomba de agua para objetivos de inmersión en agua: Si utiliza una lente de objetivo de inmersión en agua, opere el sistema de bomba de agua para suministrar agua de forma intermitente a intervalos de 5 a 10 minutos. Este flujo periódico mantiene la columna de agua entre la lente y el plato de imágenes con fondo de vidrio, evitando que se seque y asegurando condiciones de imagen estables durante los experimentos a largo plazo. Para lentes de inmersión en aceite, no se requiere esta configuración de flujo de agua.
  4. Configuración de imágenes
    1. Cambie al modo de escaneo láser. Establezca las intensidades del láser de la siguiente manera: 561 nm al 0,5% (~100 μW en el objetivo) para H2B-RFP (cromosomas); 633 nm al 3% (~300 μW en el objetivo) para SiR-Tubulina (microtúbulos fusiformes; Figura 3B, E).
      NOTA: Siga las pautas de seguridad láser adecuadas. Minimice la exposición al láser para proteger la viabilidad de la muestra.
  5. Adquisición de pila Z
    1. Adquiera pilas en Z que abarquen de 30 a 50 μm con un tamaño de paso de 2 a 4 μm (Figura 3B, C).
    2. Capture imágenes a intervalos de 5 a 10 minutos utilizando una velocidad de escaneo de 600 Hz (Figura 3B, D). La duración total de las imágenes puede oscilar entre 12 y 16 h, dependiendo de la etapa meiótica que se esté monitoreando, y están limitadas por la fototoxicidad y la tolerancia de los ovocitos al cultivo in vitro prolongado.
  6. Adquisición secuencial de imágenes
    1. En los sistemas de microscopio, realice un escaneo secuencial con dos detectores HyD: H2B-RFP: Excitación a 561 nm; emisión recogida a 580-630 nm; Excitación de SiR-tubulina a 633 nm; emisión recogida a 650-700 nm (Figura 3E).
  7. Inicio de imágenes de lapso de tiempo
    1. Antes de comenzar la adquisición de lapso de tiempo a largo plazo, verifique la calidad de la señal tomando una imagen de prueba. Las señales fluorescentes deben distribuirse uniformemente: H2B-RFP debe marcar la cromatina de manera distinta y SiR-tubulina debe resaltar las estructuras de los microtúbulos sin un fondo excesivo. Confirme la estabilidad del enfoque automático y el fotoblanqueo mínimo en ejecuciones cortas de imágenes preliminares.
    2. Inicie la creación de imágenes de lapso de tiempo haciendo clic en Iniciar.
      NOTA: GVBD, que marca la entrada en fase M, generalmente ocurre 60-90 min después del lavado de IBMX (Figura 4A). En esta configuración, los ovocitos C57BL / 6 extruyen el primer cuerpo polar alrededor de 8-9 h después de GVBD (Figura 4A). El momento puede variar según la cepa del ratón y las condiciones de cultivo.

5. Procesamiento posterior a la imagen

  1. Abra el archivo de imagen en un software de análisis de imágenes seleccionando Archivo > Abrir y eligiendo el archivo .lif de la sesión de creación de imágenes.
  2. Genere proyecciones Z para los canales H2B RFP y SiR-Tubulin seleccionando Procesamiento > Generar proyección. Establezca el tipo de proyección en Proyección de intensidad máxima. Seleccione los canales RFP y SiR Tubulin, luego haga clic en Ejecutar.
    NOTA No realice una proyección Z para el canal DIC, ya que puede resultar en una imagen borrosa. En su lugar, identifique y seleccione el único plano DIC que esté más enfocado. Utilice esta imagen DIC enfocada en combinación con las proyecciones de máxima intensidad de los canales H2B-RFP y SiR-Tubulin para lograr una visualización óptima.
  3. Extraiga un único plano focal de campo claro. Vuelva a Herramientas de proceso y seleccione Editar > recortar. Elija el canal Campo claro, utilice el control deslizante Z para encontrar el plano focal óptimo y haga clic en Aplicar.
  4. Combine las imágenes de proyección y de campo claro abriendo Herramientas de proceso, seleccionando Combinar > Agregar canales. Agregue la proyección RFP, la proyección SiR-Tubulin y la imagen de campo claro único. Haga clic con el botón secundario en el conjunto combinado y, a continuación, haga clic en Aplicar.
  5. Exporte la imagen combinada final seleccionando Archivo > Exportar > imagen. Elija el formato TIFF para obtener una salida sin comprimir de alta calidad.
    NOTA: Se recomienda exportar en formato TIFF para el análisis posterior y la preparación de figuras.

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Resultados

Como se muestra en la Figura 4A, B, este protocolo permite obtener imágenes de células vivas de alta calidad de cromosomas (H2B-RFP) y microtúbulos del huso (SiR-tubulina) en ovocitos, proporcionando así información espaciotemporal completa a lo largo de la maduración meiótica.

El canal H2B-RFP en la Figura 4A revela todos los aspectos del movimiento cromosómico desde la alineación inicial después de GVBD (

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Discusión

El protocolo presentado aquí describe un método robusto para la microinyección y la obtención de imágenes de células vivas de ovocitos de ratón, lo que permite la visualización de la dinámica cromosómica durante la meiosis con alta resolución temporal y espacial. Para el éxito de este enfoque es fundamental el manejo meticuloso de los ovocitos en cada etapa del procedimiento, desde la recolección y la microinyección hasta las imágenes. Los ovocitos son muy sensibles a las fluctuaciones a...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Fondo de Dotación del Profesor Christopher Chen, la financiación inicial de la Facultad de Medicina de la Universidad de Queensland y las subvenciones para proyectos del Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud (APP1078134 y APP1103689) a H.A.H.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Jeringas de 1 mlTerumoSS+01T TuberculinaJeringas para inyecciones precisas de PMSG.
Gel de agarosaInvitrogen16500500Se utiliza para la electroforesis en gel de ADN y ARN para separar los ácidos nucleicos por tamaño, para conformar la secuencia H2B-RFP
Quemador de alcoholLabTekLW15557-01Se utiliza para la esterilización y preparación de la boca de la pita.
Medios de cultivo bacteriano (caldo LB)Sigma-AldrichL3022Medio estándar utilizado para el cultivo de E. coli y otros cultivos bacterianos.
Placas de cultivo celular (35 &veces; 10 mm y 60 veces; 15 mm)Sigma-AldrichCLS430165, CLS430166Se utiliza para el cultivo de ovocitos; Disponible en varios tamaños.
Centrífuga (de sobremesa)Eppendorf5424RUna centrífuga compacta para pequeños volúmenes de muestra comúnmente utilizada en laboratorios de investigación.
Tubos de centrífuga (15 ml y 50 ml)Corning352096, 352070Tubos más grandes para centrifugación, comúnmente utilizados para el procesamiento de células y proteínas.
CloroformoSigma-AldrichC2432Un disolvente comúnmente utilizado en protocolos de biología molecular, especialmente en la extracción de ADN/ARN.
Incubadora de CO2Sanyo (modelo: MCO-18AIC)Incubadora diseñada para mantener una atmósfera de CO2 controlada para el cultivo de ovocitos.
Agujas ultrafinas desechables (27 G y tiempos; 1/2")Hanke Sass Wolf4710004012Agujas finas para la recogida de ovocitos
ADNasa I (libre de ARNasa)Thermo Fisher ScientificEN0521Enzima utilizada para eliminar el ADN contaminante de las preparaciones de ARN.
Bloque calefactor secoInstrumentos de subvención (modelo: QBD4)Un bloque utilizado para calentar muestras o reacciones a temperaturas precisas sin necesidad de agua.
Etanol (grado de biología molecular)Sigma-AldrichE7023Se utiliza para la precipitación de ADN y ARN, así como en procedimientos de esterilización.
Tijeras de disección finaMet-App Instrumentos Científicos y Quirúrgicos2235Se utiliza para la disección precisa de ovocitos de ratón
Pinzas finasMet-App Instrumentos Científicos y Quirúrgicos2127Se utiliza para la disección precisa de ovocitos de ratón
Sistema de electroforesis en gelBio-Rad1645050Un sistema para realizar electroforesis de ácidos nucleicos o proteínas en geles.
Sulfato de gentamicinaSigma-AldrichG1264Antibiótico utilizado para prevenir la contaminación bacteriana en cultivos celulares.
Pipetas Pasteur de vidrio (230 mm)VWR6121702Pipetas de vidrio utilizadas para pipetas de boca de ovocitos
IBMXSigma-AldrichI5879Un inhibidor de la fosfodiesterasa que se usa para prevenir la EIG.
Microscopio invertidoNikonUn microscopio diseñado para observar células u organismos vivos desde debajo de la placa de cultivo.
Aceite mineral ligero apto para el cultivo de embriones de ratónSigma-AldrichM5310Se utiliza para cubrir ovocitos en cultivo para evitar la evaporación y mantener la temperatura.
Cloruro de litioSigma-AldrichL9650Utilizado en métodos de precipitación de ARN.
Sistema de imágenes de células vivasLeicaLAS XSistema de imagen diseñado para la observación en tiempo real de células vivas mediante técnicas avanzadas de microscopía.
Medio M16 (para cultivo in vitro)Sigma-AldrichM7292Un medio diseñado para el cultivo de ovocitos y embriones de ratón y otras aplicaciones in vitro.
Tubos de microcentrífuga (0,6 ml y 1,6 ml)Neptuno3735.X, 3745.XTubos de pequeño volumen para centrifugación, a menudo utilizados en protocolos de biología molecular y bioquímica.
Tubos de microcentrífuga (sin ARNasa)Eppendorf / Neptuno022431081 (Eppendorf)Los tubos libres de ARNasa para ARN funcionan para prevenir la degradación del ARN.
Agujas de microinyecciónInstrumentos SutterExtractor de pipetas P-30Agujas para una microinyección precisa en ovocitos
Sistema de microinyecciónAparato de HarvardFemtoJet, PicoPumpSistemas utilizados para inyectar ARNc en ovocitos de ratón con alta precisión.
Kit de minipreparaciónQiagen27106 (Kit QIAprep Spin Miniprep)Un kit para aislar ADN plasmídico de cultivos bacterianos para aplicaciones de biología molecular.
Conjunto de tubo aspirador bucalSigma-AldrichA5177para ovocitos de aspiración
Pintura de pelletsMerck Millipore69049-3Un producto para visualizar la formación de pellets durante la centrifugación.
Fenol: Cloroformo: Alcohol isoamílicoThermo Fisher Scientific15593031Una solución utilizada en la extracción H2B-RFP para la separación de fases.
Plásmido que codifica H2B-RFPAddgenePlásmido #20972 Plásmido utilizado para marcar cromosomas con proteína de fluorescencia roja (RFP)
PMSGProspecHOR-272Para superovalación de ratón
Proteinasa KThermo Fisher ScientificEO0491Enzima utilizada para digerir proteínas, comúnmente utilizada en procedimientos de extracción de ADN/ARN.
Enzima de restricción NotILaboratorios biológicos de Nueva Inglaterra (NEB)R3189SUna enzima de restricción utilizada en la clonación de ADN y aplicaciones de biología molecular, para la linealización de plásmidos H2B-RFP.
Inhibidor de la ARNasa (opcional)Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra (NEB)M0314SEnzima utilizada para prevenir la degradación del ARN durante experimentos relacionados con el ARN.
Guantes sin ARNasaVWR / Fisher ScientificVaría según el tamañoGuantes tratados para evitar la contaminación por ARNasa, utilizados en protocolos de manipulación de ARN.
Puntas de pipeta sin ARNasaAxygen / Thermo FisherT-300-R-SPuntas de pipeta diseñadas para estar libres de contaminación por ARNasa para aplicaciones relacionadas con el ARN.
Agua libre de ARNasaThermo Fisher ScientificAM9932Agua purificada para eliminar las enzimas de ARNasa, esencial para que el ARN funcione para evitar la degradación.
SDS (10%)Sigma-AldrichL3771Dodecil sulfato de sodio utilizado para desnaturalizar proteínas en electroforesis y otros experimentos.
SiR-TubulinaEspirocromoSC002Un tinte fluorescente que se une específicamente a la tubulina para obtener imágenes de células vivas del huso.
Acetato de sodio (3 M)Sigma-AldrichS7899Se utiliza como tampón y para la precipitación de ADN en procedimientos de biología molecular.
EspectrofotómetroThermo Fisher (NanoDrop)ND-UNO-WInstrumento utilizado para cuantificar ácidos nucleicos, proteínas y otras sustancias mediante la medición de la absorbancia.
EstereomicroscopioLeica Microsystems   M165CUn microscopio diseñado para observar muestras en tres dimensiones con aumentos bajos, útil para disecciones.
Unidad de filtro de jeringa (0,22-µ m)MerckSLGP033RSSe utiliza para la filtración estéril de líquidos, especialmente en aplicaciones de microbiología y biología molecular.
Conjunto de jeringas y agujasTerumoSS+01T Jeringas de tuberculinautilizado para la administración precisa de PMSG.
T7 mMESSAGE mMACHINE KitThermo Fisher ScientificAM1344Un kit para la transcripción in vitro de ARN de un promotor T7 para la preparación de ARNc H2B-RFP.
Baño de agua / bloque calefactorInstrumentos de subvenciónQBD4Se utiliza para mantener temperaturas precisas en experimentos que requieren calor.

Referencias

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