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Construcción de perfiles de par-velocidad-potencia de carga constante (isotónicos) y de velocidad constante (isocinéticos) in vivo para los flexores plantares de rata

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DOI:

10.3791/68858

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3 de octubre de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Neuromechanical Performance Research Lab, Department of Human Health and Nutritional Sciences, College of Biological Sciences, University of Guelph, 2Aurora Scientific Inc.

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo novedoso para medir de forma no invasiva la relación torque-velocidad angular-potencia in vivo en flexores plantares de rata mediante estimulación muscular transcutánea. Esta configuración permite una prueba simple de las contracciones musculares isotónicas en un sistema de controlador de longitud / transductor de fuerza para representar mejor la naturaleza de carga constante de los movimientos cotidianos.

Resumen

Comprender la relación par-velocidad-potencia del músculo es fundamental para evaluar el rendimiento muscular dinámico, lo que tiene implicaciones para la salud y la enfermedad. Mientras que los estudios de dinamometría en humanos utilizan contracciones isocinéticas (velocidad constante) o isotónicas (carga constante) para evaluar esta relación, los modelos de roedores se han basado casi exclusivamente en contracciones isocinéticas debido a la complejidad de ejecutar experimentos de sujeción de carga isotónica en sistemas disponibles comercialmente. Las contracciones isotónicas se alinean mejor con las condiciones de carga constante de los movimientos que ocurren fuera del laboratorio. Aquí, presentamos un protocolo de estimulación eléctrica transcutánea novedoso y mínimamente invasivo y un flujo de trabajo paso a paso para evaluar la relación isotónica de par-velocidad angular-potencia in vivo para los flexores plantares de rata. Se compararon las curvas isotónicas e isocinéticas de torque-velocidad angular-potencia en 10 ratas Sprague-Dawley. Las contracciones isotónicas produjeron una mayor velocidad máxima de acortamiento (Vmáx.) y potencia máxima en comparación con las contracciones isocinéticas que utilizaron un par promedio. Sin embargo, la potencia máxima isocinética coincidió mejor con la potencia máxima isotónica al medir el par máximo de las contracciones isocinéticas debido a una reducción en la curvatura de la curva de velocidad angular de par. Además, el par y la velocidad a la potencia máxima diferían según el tipo de protocolo utilizado. Todos los conjuntos de datos se ajustan fuertemente a la ecuación de Hill (R2 > 0.98), aunque los datos isotónicos tuvieron los ajustes "más débiles", probablemente debido a la naturaleza más variable de las contracciones de carga constante. Con base en estos hallazgos, se recomienda el uso de contracciones isotónicas cuando sea posible, especialmente si se trata de evaluar la potenciamáxima o máxima. Si en su lugar se deben utilizar pruebas isocinéticas, se proporciona una guía valiosa para comprender las limitaciones y maximizar la traducibilidad a contracciones de carga constante.

Introducción

La investigación básica de cómo cambia el rendimiento muscular con el ejercicio, la maduración, el envejecimiento o la enfermedad a menudo incluye solo evaluaciones de producción de fuerza o torque durante las contracciones isométricas (es decir, longitud muscular constante o ángulo articular, respectivamente). Sin embargo, desde el trabajo pionero de A.V. Hill en la década de 19301, los experimentos sobre el rendimiento muscular se han expandido gradualmente para incorporar condiciones dinámicas, evaluando la relación entre la fuerza, la velocidad y su producto, la potencia 2,3,4,5,6,7,8 . A medida que aumenta la velocidad de acortamiento, se reduce la probabilidad de formar puentes cruzados de actina-miosina que produzcan fuerza, creando la forma hiperbólica inversa de la curva fuerza-velocidad 1,2. Por lo tanto, la potencia proporciona una representación general del rendimiento dinámico de un músculo, mostrando la compensación entre la fuerza submáxima y la velocidad submáxima para lograr la potencia máxima9. Los estudios en humanos en particular han avanzado al uso de dinamometría de cuerpo entero (por ejemplo, HUMAC o Biodex), lo que permite evaluar la relación par-velocidad-potencia utilizando isocinética10 (velocidad angular constante) o isotónica 11,12,13,14,15,16 (carga constante). De estos dos tipos de movimiento, las contracciones isotónicas se alinean mejor con las condiciones de carga constante de los movimientos que ocurren fuera del laboratorio, lo que plantea el desafío de mover una carga sobre los músculos involucrados, mientras que las contracciones isocinéticas son más antinaturales ya que el brazo de palanca transductor de fuerza del dinamómetro solo puede moverse a una velocidad angular fija 12,16,17, Artículo 18.

Las últimas dos décadas también han visto avances significativos en los sistemas de dinamómetros pequeños para evaluar el rendimiento muscular en roedores 19,20,21,22,23,24. Los modelos de roedores permiten posibilidades casi infinitas para la investigación preclínica de enfermedades que afectan negativamente a los músculos, incluida la diabetes tipo25, la obesidad26, la caquexia por cáncer27, la sarcopenia19,28, la parálisis cerebral espástica29,30, la distrofia muscular de Duchenne31, la desminopatía32y más. Las medidas longitudinales repetidas del rendimiento muscular utilizando animales vivos se han hecho posibles mediante el empleo de estimulación eléctrica de nervios periféricos o músculos percutáneos bajo anestesia33,34. Desafortunadamente, dado que estas contracciones deben ser evocadas eléctricamente, han sido más propicias para la naturaleza simplista y controlada de las contracciones isocinéticas en lugar de las isotónicas (que requieren un enfoque más matizado) para construir la relación par-velocidad-potencia. Además, la implantación de manguitos de nervios periféricos o la estimulación muscular directa a través de un electrodo de aguja son procedimientos invasivos, que requieren cirugía o una inserción cuidadosa de electrodos permanentes a través de la piel y, por lo tanto, el uso repetido presenta riesgos de efectos adversos o inconsistencias que podrían confundir los resultados entre sesiones de prueba repetidas en el mismo animal.

Aquí, se presenta una configuración novedosa para evaluar la relación torque-velocidad angular-potencia in vivo en ratas utilizando un procedimiento consistente y mínimamente invasivo de estimulación muscular transcutánea (es decir, fuera de la piel) en un sistema de transductor de fuerza / controlador de longitud. Además, este estudio proporciona una comparación entre las curvas isotónicas e isocinéticas de torque-velocidad-potencia construidas a partir de esta técnica, con recomendaciones técnico-metodológicas basadas en los matices de ambos procedimientos.

Protocolo

Todos los protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Guelph (AUP # 4905) y siguieron las pautas del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales.

NOTA: Los materiales enumerados en la Tabla de materiales son necesarios para la construcción de la configuración del portaelectrodos, el posicionamiento de la rata dentro del sistema de transductor de fuerza/controlador de longitud y la recopilación de datos de torque, posición y velocidad angular.

1. Animales

  1. Obtener 10 ratas Sprague Dawley hembras (edad: 11 semanas; masa corporal: 228 ± 21 g).
  2. Aloje a las ratas a 23 ° C en grupos de dos o tres y brinde acceso ad libitum a una dieta global para roedores con un 18% de proteína de Teklad y agua a temperatura ambiente.

2. Soporte de electrodo hecho a medida

  1. Construya el soporte de electrodos a medida para la estimulación transcutánea principalmente a partir de piezas de construcción disponibles comercialmente, de las cuales las instrucciones de construcción se presentan en el Archivo complementario 1.
  2. Diseñe a medida e imprima en 3D la pieza del soporte del electrodo con el archivo STL adjunto en el archivo complementario 1.
    NOTA: Esta pieza de soporte de electrodo contiene orificios ajustados para sostener clavos de acabado liso galvanizados de acero de 1-1/2". La posición de los clavos en estos orificios está destinada a ajustarse en función del tamaño / posición de la rata individual que se está probando. Soldados a estos clavos hay cables de cátodo y ánodo que se conectan a un estimulador bifásico de alta potencia para brindar estimulación transcutánea de los flexores plantares.

3. Configuración inicial de pruebas mecánicas in vivo

  1. Encendido del sistema in vivo
    1. Encienda la bomba de calor y ajústela a 37 °C.
    2. Encienda la computadora. Abra el software DMCv5.5.
    3. En la caja del estimulador, pulsa el interruptor de encendido grande y el interruptor de salida de encendido más pequeño.
    4. Encienda el interruptor de encendido para el sistema de palanca de modo dual.
    5. Haga clic en Protocolo en el software. Cargue un protocolo que ofrezca una contracción de 500 ms y 100 Hz (ancho de pulso de 0,1 ms) en un ángulo de tobillo de 90° (es decir, el ángulo neutro predeterminado para el software).
      NOTA: Los pasos para diseñar un protocolo están fuera del alcance del presente estudio y se puede acceder a ellos en los manuales de operación de un sistema determinado.
    6. Establezca la fuerza de compensación en 350 mN×m (el par máximo capaz de ser registrado por este sistema; es poco probable que una rata exceda ese valor 28,35,36,37,38), luego cargue el protocolo.
    7. Mueva el interruptor del sistema a Ejecutar. Asegúrese de que el pedal (etiquetado en la Figura 1) encaje en su lugar.
  2. Preparando la rata
    1. Anestesiar a la rata con isoflurano utilizando procedimientos operativos estándar en la institución de investigación aplicable39 (por ejemplo, aquí, se utilizaron las pautas del entrenamiento en anestesia con roedores de la Universidad de Guelph, con isoflurano ajustado al 4% y caudal de oxígeno ajustado a 2,5 L/min para la inducción inicial, e isoflurano reducido al 1,5-2% y caudal de oxígeno a 1,5 L/min para mantenimiento). Coloque la rata con la boca / nariz en un cono bucal sobre una plataforma calentada (Figura 1). Controlar la respiración y la frecuencia del pulso de la rata en todo momento para garantizar una profundidad constante y segura de la anestesia, refiriéndose a los procedimientos operativos estándar39.
    2. Unte ungüento para los ojos sobre los ojos para evitar que se sequen.
    3. Afeitar completamente el vello de la pierna izquierda con una maquinilla de afeitar eléctrica.
    4. Extienda una crema depilatoria disponible comercialmente en toda la pierna con un hisopo de algodón (por ejemplo, un hisopo). Espere 3 minutos, luego raspe la crema con tantos hisopos de algodón como sea necesario. Trate de tener la pierna lo más desnuda posible.
      NOTA: Este paso es necesario porque el cabello interrumpirá el contacto entre los electrodos, el gel conductor y la piel cuando intente administrar estimulación eléctrica.
    5. Limpie completamente la pierna humedeciendo bolas de algodón con agua destilada y limpiándolas sobre la pierna.
    6. Seca la pierna con una toalla de papel.
  3. Posicionamiento de la rata
    1. Envuelva la cinta quirúrgica alrededor del pie y el pedal para asegurar el pie en su lugar. Debe ser lo más apretado posible. Asegúrate, especialmente, de que el talón esté fijado en la ranura en la parte inferior del pedal. Use la perilla de ajuste 3 (etiquetada en la Figura 1) para acercar o alejar el pedal según sea necesario para asegurarse de que la rodilla esté extendida.
    2. NOTA: La verdadera extensión completa de la rodilla es difícil de lograr aquí, así que no se preocupe si la rodilla no está completamente extendida.
    3. Coloque la abrazadera, empujando hacia la tibia proximal media para fijar la parte inferior de la pierna en su lugar (consulte la Figura 1para obtener una representación visual). Use las perillas de ajuste 1 y 2 (etiquetadas en la Figura 1) para colocar el pedal de modo que esté alineado con la abrazadera.
  4. Colocación de electrodos
    1. Con unas pinzas, extienda el gel conductor en ambos electrodos, así como en la cara posterior de la pata de la rata.
    2. Coloque los electrodos como se muestra en la Figura 1, asegurándose de que haya gel entre los electrodos y la pierna. El electrodo distal va justo distal al gastrocnemio, mientras que el electrodo proximal va al extremo proximal del gastrocnemio, donde se encuentra con la articulación de la rodilla. Encuentre estas ubicaciones palpando la "protuberancia" de los gastrocnemios en la parte posterior de la parte inferior de la pierna.
    3. Gire el engranaje (etiquetado en la Figura 1) para elevar los electrodos a su lugar y garantizar un contacto constante durante las estimulaciones. No lo empuje hacia arriba con demasiada fuerza, o ejercerá un par pasivo no deseado en el pedal. Solo debe haber una ligera curva en el eje (etiquetado en la Figura 1) que sostiene los electrodos para garantizar que permanezca en su lugar durante la estimulación.
  5. Habilitar el guardado automático
    1. Vuelva al software DMCv5.5. En la parte superior, haz clic en Configuración y, a continuación, en Guardar carpeta automáticamente.
    2. Vaya a la carpeta elegida para guardar los archivos de datos y, a continuación, haga clic en Carpeta actual.
    3. Escribe un nombre base (por ejemplo, el código de identificación de la rata) en el cuadro Base de Autoguardado , luego haz clic en Habilitar Autoguardado. Todos los archivos de datos ahora se guardarán en la carpeta seleccionada con ese nombre base de guardado automático. No olvide agregar al nombre base según el protocolo que se esté ejecutando (por ejemplo, "C1Black-70deg" para una contracción de 100 Hz en un ángulo de tobillo de 70 °; como nombre de archivo, aparecerá como "C1Black-70deg.ddf" en la carpeta AutoSave elegida).

4. Optimización de corriente para estimulación de 100 Hz

  1. El protocolo de 100 Hz a 90° ya está cargado desde el paso 3.1.5. Ajuste el estimulador a 20 mA. Este será un nivel muy bajo de estimulación y le permitirá al investigador saber si necesita hacer algún ajuste en la colocación del electrodo / gel (por ejemplo, si el trazo de torsión se ve desigual o la pierna se sale de la abrazadera) sin inducir mucha fatiga muscular 28,35,36,37,38.
  2. Haga clic en Iniciar prueba para ejecutar el protocolo. La contracción de los músculos debe ser visible. Una vez ejecutado el protocolo, haga clic en Análisis para comprobar cuánto par se ha producido, asegurándose de que se ha hecho clic en el cuadro de corrección de línea base .
  3. Después de permitir 2 min de descanso, aumente a 30 mA y vuelva a ejecutar el protocolo. Haga clic en Análisis para comprobar cuánto par se ha producido, asegurándose de que se ha hecho clic en la casilla de corrección de línea base (esta casilla garantiza que la par pasiva se reste de la par total para obtener una medida del par activo).
    NOTA: El uso de esta herramienta de corrección de línea de base solo funciona en esta configuración a un tobillo de 90°. En todos los demás ángulos, se debe utilizar el método descrito en el paso 5.1 para calcular el par activo. Si bien se recomiendan 2 minutos de descanso aquí en ratas jóvenes sanas, este tiempo de descanso puede necesitar ser más largo (por ejemplo, 3-5 minutos) en modelos de envejecimiento o enfermedad.
  4. Repita el paso anterior durante 40 mA. Si el par ha disminuido en comparación con 30 mA, entonces 30 mA es el estímulo óptimo. Si el par de 40 mA fue mayor, aumente a 50 mA y estimule nuevamente después de 2 min de descanso. Si el par ha bajado, entonces 40 mA era la corriente de estímulo óptima.
  5. Repita este proceso hasta que se haya encontrado el estímulo óptimo (es decir, ya no vea un aumento en la producción de torque después de aumentar aún más la corriente de estimulación). Por lo general, la corriente de estímulo óptima es de 40 mA o 50 mA.

5. Contracciones isotónicas para la relación par-velocidad-potencia

  1. Cree un protocolo que induzca una contracción isométrica de 500 ms y 100 Hz en un ángulo de tobillo de 70° (es decir, el ángulo más dorsiflexionado al que irá este sistema de palanca) (archivo de protocolo disponible en el archivo complementario 2). Ejecute este protocolo. Registre el par activo máximo (es decir, el par total menos el par pasivo de referencia antes de la estimulación) producido durante esta contracción. Utilice este valor para determinar las pinzas de carga en los protocolos isotónicos.
  2. En la pantalla Protocolo , cree un protocolo para mover el tobillo a una posición dorsiflexionada, luego estimule durante 500 ms antes de volver a una posición neutral (Figura 2; archivo de protocolo .dpf proporcionado en el Archivo complementario 2).
  3. Calcule las cargas isotónicas correspondientes al 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% y 80% del par activo máximo a 70° registrado en el paso 5.1. Asegúrese de volver a agregar también el par pasivo de referencia en la abrazadera de carga (vea el ejemplo en la Figura 2). Ejecute estas abrazaderas de carga en un orden aleatorio siguiendo los pasos que se describen a continuación.
  4. En el software DMCv5.5, en el cuadro Fuerza de desplazamiento (que actualmente está configurado en 350 desde el paso 3.1.6), escriba el valor de par calculado (es decir, de los valores calculados en el paso 5.3 anterior) correspondiente a la primera abrazadera de carga que se ejecutará. Ahora, cargue el protocolo isotónico creado en el paso 5.2 y se aplicará esta nueva fuerza de desplazamiento. Al establecer esta fuerza de compensación submáxima, el acortamiento ocurrirá cuando el par producido por los flexores plantares alcance este valor, y permanecerá fijo en este valor (Figura 2).
  5. Haga clic en Iniciar prueba para ejecutar el protocolo. Se producirá una contracción isotónica.
  6. Repita los dos pasos anteriores con 2 minutos de descanso entre cada pinza de carga isotónica hasta que se hayan realizado las ocho contracciones isotónicas (10-80%).

6. Contracciones isocinéticas para la relación par-velocidad-potencia

  1. Establezca la fuerza de compensación en 350 mN×m si aún no está allí.
  2. Cree ocho protocolos de acortamiento isocinético correspondientes a velocidades de acortamiento de 50, 100, 200, 300, 400, 600, 800 y 1000 ° / s (archivos de protocolo disponibles en el archivo complementario 2). En estos protocolos, primero mueva pasivamente el tobillo a 70 ° (es decir, el ángulo más dorsiflexionado disponible en este sistema), luego configure la estimulación de 100 Hz para que ocurra al inicio del acortamiento y continúe a medida que el tobillo se mueve a 120 ° (es decir, el ángulo más flexionado plantar disponible en este sistema) (Figura 3). Una vez finalizada la estimulación, configure el tobillo para que vuelva al ángulo neutro predeterminado del sistema de 90°.
  3. Ejecute cada una de estas pruebas isocinéticas en un orden aleatorio, con 2 minutos de descanso entre cada prueba.

7. Análisis de los archivos de prueba isotónicos e isocinéticos

  1. Análisis de pruebas isotónicas
    1. Dado que las pruebas isotónicas utilizan una carga constante, registre la velocidad angular durante el acortamiento. Para analizar la velocidad angular de estas pruebas, abra el archivo de datos. Acerque la parte del trazado de posición que representa cuándo se produjo el acortamiento isotónico. Haga clic en Análisis muscular.
    2. Para calcular la pendiente media durante el acortamiento, observe la columna Posición y realice el cálculo: Velocidad angular media = (Posición mínima - posición máxima)/Tiempo total. Tenga en cuenta que la "Posición mínima" representa el ángulo más dorsiflexionado, que es la posición inicial de la articulación.
  2. Análisis de pruebas isocinéticas
    1. Dado que las pruebas isocinéticas utilizan una velocidad constante, registre el par producido durante el acortamiento.
      NOTA: El presente estudio muestra dos métodos diferentes para registrar el par de estos protocolos: par medio durante el acortamiento y par máximo durante el acortamiento. Las ventajas y desventajas de cada uno se presentan en los Resultados Representativos.
    2. Abra el archivo de datos. Para registrar el par medio, amplíe la traza del par durante la fase de acortamiento. Haga clic para abrir la ventana Análisis muscular . A partir de los valores dados en la columna de par, registre el par medio como: Par medio = Integración/Tiempo total.
    3. Desde la misma ventana de Análisis muscular , registre el par máximo como el valor indicado en el cuadro Par máximo .

8. Ajuste de curvas de los datos de par y velocidad angular

  1. En una hoja de cálculo, cree una hoja separada para los datos isotónicos y los datos isocinéticos de cada rata. En cada hoja, organice los datos en dos columnas: fuerza y velocidad. Incluya el par máximo a 70° en estos datos, correspondiente a una velocidad de 0°/s. Etiquete cada hoja como [Nombre de la rata] seguido de [ISOT] o [ISOK], correspondientes a datos isotónicos o isocinéticos, respectivamente (por ejemplo, "C1BLACK ISOT" o "C1BLACK AVG ISOK" donde C1BLACK es el nombre de la rata; consulte la Figura 4 para obtener más ejemplos).
    NOTA: Estas convenciones de nomenclatura son necesarias para el código Python empleado en el siguiente paso. Estas convenciones de nomenclatura específicas solo son necesarias en este archivo de hoja de cálculo.
  2. Siga el enlace en Archivo complementario 3 para ejecutar el código Python personalizado, utilizando las instrucciones adicionales relacionadas con el código proporcionadas en Archivo complementario 3. Una vez que se ejecuta el código, aparecerá una ventana que le pedirá al investigador que seleccione la hoja de cálculo que contiene las hojas individuales para los datos isotónicos e isocinéticos de cada rata que se realizó en el paso 8.1. Si se organiza correctamente según la descripción en el paso 8.1 y la Figura 4, este código mostrará una ventana que muestra una curva de torque-velocidad-potencia ajustada para cada conjunto de datos (ejemplos en la Figura 4). En este código, todos los datos se ajustan a la siguiente ecuación1:
    figure-protocol-1
    Siendo Fmax el par isométrico máximo de 100 Hz a 70°, F y V representan el par de la abrazadera de carga isotónica y la velocidad angular, respectivamente, y a y b representan las constantes termodinámicas de Hill con las unidades de par (N•m) y velocidad (°/s), respectivamente.
    NOTA: Una vez que el código haya seleccionado cada conjunto de datos de fuerza y velocidad, producirá un nuevo archivo de Excel que contiene, para cada curva ajustada, los siguientes datos: velocidad máxima de acortamiento (Vmáx.), Fmáx., los coeficientes a y b, la curvatura de la curva de par-velocidad (a / Fmáx.), potencia máxima, el valor de par que corresponde a la potencia máxima, el valor de velocidad angular que corresponde a la potencia máxima y el valor R2 que representa qué tan bien se ajustan los datos recopilados a la ecuación (Figura 4).

9. Comparación de los perfiles isotónicos e isocinéticos de par-velocidad-potencia

  1. Para eliminar el riesgo de sesgos relacionados con el orden de las pruebas, 1) alterne entre ejecutar primero las pruebas isotónicas y ejecutar primero las pruebas isocinéticas; y 2) aleatorizar el orden de contracción dentro de cada conjunto de contracciones isotónicas (pinzas de carga de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 y 80% de par máximo) e isocinéticas (velocidades angulares de 50, 100, 200, 300, 400, 600, 800 y 1000°/s). Seleccione el rango de velocidades angulares isocinéticas de acuerdo con estudios previos sobre los flexores plantares de rata in vivo 23.
  2. Utilice un ANOVA de medidas repetidas bidireccionales para evaluar las similitudes y diferencias entre las curvas de par-velocidad-potencia producidas a partir de los tres métodos empleados aquí (isotónico, isocinético con par medio durante el acortamiento e isocinético con par máximo durante el acortamiento) para las siguientes variables: Vmáx., los coeficientes a y b , curvatura, potencia máxima, par a potencia máxima, velocidad angular a potencia máxima, y R2. Aplique una corrección de Bonferroni a todas las comparaciones por pares. Establezca el nivel alfa en α = 0,05.

Resultados

La Figura 5A muestra las relaciones de torque-velocidad generadas a partir de los puntos de datos sin procesar, y la Figura 5B usa los coeficientes promedio Fmax y a y b para trazar estos datos ajustados a la ecuación 1 deHill junto con las curvas de torque-potencia, en las que el torque y la velocidad se multiplicaron para calcular la potencia. Todos los métodos (isotónico, isocinético usando torque promedio, isocinético usando torque máximo) muestran la forma esperada de la relación torque-velocidad, con la velocidad de acortamiento angular disminuyendo hiperbólicamente con el aumento del torque, y viceversa, y con la potencia máxima producida a niveles submáximos tanto de torque como de velocidad.

La Figura 6 muestra los datos obtenidos del ajuste de curvas de los datos de par y velocidad angular. La curva obtenida de las pruebas isotónicas predice un Vmax mayor que ambas curvas isocinéticas (P = 0,002 en comparación con ambas; Figura 6A). La curva isotónica también produjo una potencia máxima mayor que la curva isocinética utilizando el par medio (P = 0,006), pero esta discrepancia se superó utilizando en su lugar el par máximo de las pruebas isocinéticas, produciendo una potencia máxima que no difería de la de la curva isotónica (P = 1,00) (Figura 6B). Este aumento en la potencia máxima utilizando el par máximo en la curva isocinética se logró matemáticamente reduciendo la curvatura de la curva de par-velocidad en comparación con el uso del par promedio (P < 0.001) (Figura 6G), a pesar de mantener el mismo Vmáx . (P = 1.00) (Figura 6A). Esta reducción en la curvatura debido al uso del par máximo de las pruebas isocinéticas también resultó en una sobreestimación del par a la potencia máxima en comparación con la curva isotónica (P < 0.001), mientras que la curva isocinética que utiliza el par promedio coincidió mejor con el par a la potencia máxima de la curva isotónica (P = 1.00) (Figura 6C). Dicho esto, la curva isocinética que utiliza el par promedio subestimó la velocidad a la potencia máxima en comparación con la curva isotónica (P < 0.001) (Figura 6D). El uso del par máximo para la curva isocinética acercó la velocidad a la potencia máxima a la de la curva isotónica, pero con una ligera subestimación (P = 0,043) (Figura 6D). Por último, mientras que todos los conjuntos de datos se ajustaron fuertemente a la ecuación de Hill (todos R2 > 0.98), la curva isotónica fue un ajuste ligeramente más débil que los otros dos (P = 0.015-0.029). En conjunto, estos hallazgos demuestran cómo las contracciones dinámicas de carga constante, que se asemejan más a los movimientos del mundo real, producen resultados diferentes en comparación con las contracciones dinámicas de velocidad constante más utilizadas para evaluar la relación par-velocidad-potencia.

Todos los datos individuales están disponibles públicamente en: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.29099018.v2

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Figura 1: Representación de cómo se configura la rata para las pruebas in vivo de la función mecánica de los flexores plantares. La rata se coloca en una plataforma calentada bajo anestesia con isoflurano. El pie se pega firmemente al pedal con el talón asegurado y se empuja una abrazadera en la tibia para fijar la parte inferior de la pierna en su lugar. Las perillas de ajuste 1, 2 y 3 ayudan a colocar la pierna en una posición extendida con la rodilla y la alineación anatómica con el eje del pedal. El gel conductor se extiende sobre los sitios proximales y distales del grupo de músculos flexores plantares. El soporte de electrodos asegura los electrodos en su lugar para la estimulación transcutánea. El engranaje del dispositivo de sujeción de electrodos personalizado empujó los electrodos contra la piel que recubre los músculos flexores plantares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Ejemplo de trazas de torque, posición y estimulación brutas para una estimulación isométrica de 100 Hz en un ángulo de tobillo de 70°, que luego se utilizó para determinar el torque máximo en contracciones isotónicas con cargas establecidas entre el 10% y el 80% del torque máximo. Se incluye un ejemplo de cálculo y ajuste de la carga isotónica para una contracción isotónica del 30%. Tenga en cuenta que al configurar la abrazadera de carga ("Fuerza de compensación"), la carga calculada representa un porcentaje del par activo máximo de 100 Hz (es decir, el par total menos el par pasivo de referencia), pero el par pasivo de referencia se vuelve a agregar porque el sistema no puede distinguir entre el par total y el par activo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Ejemplo de par bruto y trazas de posición de contracciones isocinéticas, a partir de las cuales se midieron el par máximo y el par medio durante el acortamiento. Las pruebas presentadas son a velocidades de 50, 100, 200, 300, 400, 600, 800 y 1000°/s (indicadas en los paneles de trazado de posición). Las líneas verticales discontinuas en la lectura de "Estimulación" indican el inicio y el final de la estimulación eléctrica (la estimulación real no es visible en estas fotografías de las lecturas de datos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Representación de los pasos necesarios para ajustar la curva del par (etiquetado como "fuerza" aquí) y datos de velocidad. Después de organizar cada conjunto individual de datos de torque y velocidad en su propia hoja etiquetada como [Nombre de la rata] [ISOK o ISOT] (ISOT = isotónico, ISOK = isocinético), se ejecuta el código. Aparecerá una ventana solicitando que se seleccione un archivo de Excel. Después de seleccionar el archivo que contiene todas las hojas etiquetadas, cada curva aparecerá una a la vez, lo que permitirá inspeccionarlas visualmente para garantizar que no haya errores en los datos ingresados. Cada curva muestra la velocidad máxima de acortamiento (Vmáx.), el valor de par máximo (Fmáx.) que se habría introducido a partir de los datos medidos, los coeficientes a y b de la curva, la curvatura de la curva de par-velocidad (a / Fmáx.), la potencia máxima, el valor de par que corresponde a la potencia máxima ("Opt Force"), el valor de velocidad angular que corresponde a la potencia máxima ("Opt Vel"), y el valor R2 que representa qué tan bien se ajustan los datos recopilados a la ecuación. Después de hacer clic en cada curva, se generará automáticamente un archivo de Excel que contiene todos los datos producidos a partir del ajuste de curvas para cada curva en la que se acaba de hacer clic. Recuerde guardar este archivo antes de cerrarlo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Curvas de par-velocidad-velocidad-potencia. (A) Las curvas de par y velocidad angular construidas a partir de datos brutos para las pruebas isotónicas (verde), las pruebas isocinéticas que utilizan el par medio durante el acortamiento (azul) y las pruebas isocinéticas que utilizan el par máximo durante el acortamiento (naranja). (B) Las curvas promedio generadas al ajustar estos datos a la ecuación1 de Hill junto con las curvas de torque-potencia creadas al multiplicar el torque y la velocidad angular. Los datos del panel A se presentan como la media ± la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Datos obtenidos del ajuste de curvas de los datos de par y velocidad angular. Comparación de (A) Vmáx., (B) potencia máxima, (C) par a potencia máxima, (D) velocidad a potencia máxima, (E) coeficiente a, (F) coeficiente b, (G) curvatura y (H) R2 entre las curvas generadas a partir de las pruebas isotónicas (ISOT), pruebas isocinéticas utilizando par medio (ISOK AVG) y pruebas isocinéticas utilizando par máximo (ISOK PEAK). *Diferencia significativa (P < 0,05). Los datos se presentan como la media ± la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Instrucciones de construcción del portaelectrodos y archivos de impresión 3D (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.28574951.v1)

Archivo complementario 2: Archivos de protocolo .dpf para el sistema 3 en 1 (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.29099018.v2) de Aurora Scientific

Archivo complementario 3: Código Python para datos de velocidad angular de par de ajuste de curvas (https://github.com/ahinks192/Torque-Velocity-Curve)

Discusión

El presente estudio muestra una configuración novedosa para pruebas in vivo de la función mecánica de los flexores plantares de rata mediante estimulación eléctrica transcutánea. Específicamente, el presente estudio demuestra cómo evaluar la relación torque-velocidad angular-potencia utilizando contracciones isotónicas, que se alinean mejor con las condiciones de carga constante y dependientes de la velocidad de los movimientos que ocurren fuera del laboratorio que las contracciones isocinéticas. Sin embargo, también se presenta cómo se pueden optimizar las mediciones de una relación isocinética de par angular-velocidad angular-potencia para imitar los resultados de las contracciones isotónicas. Debido a la naturaleza repetible de esta configuración experimental, estas evaluaciones del rendimiento dinámico a nivel articular tienen el potencial de mejorar enormemente la comprensión de cómo la edad, la enfermedad, la inmovilización y diversas intervenciones de ejercicio afectan la función contráctil muscular en modelos de roedores. De hecho, esta configuración se ha utilizado previamente para comparar la función mecánica de los flexores plantares entre ratas jóvenes y viejas, y antes y después de las intervenciones de yeso y entrenamiento 35,36,37,38,28.

Una ventaja importante de emplear los protocolos isotónicos sobre los protocolos isocinéticos es que los protocolos isotónicos pueden ser más individualizados para una rata determinada. Los protocolos isotónicos comienzan con la determinación de la capacidad máxima de producción de torque, luego las abrazaderas de carga se normalizan a ese valor específico (es decir, la curva isotónica tiene variación en los ejes de torque y velocidad en la Figura 5A). Con los protocolos isocinéticos, Vmax no se puede determinar por adelantado, por lo tanto, no es posible normalizar el rango de velocidades angulares submáximas a un valor de velocidad máxima y, en su lugar, usar un rango estandarizado de velocidades angulares (es decir, la curva isocinética solo tiene variación en el eje de torque). Este rango estandarizado podría convertirse en un problema para las ratas que intrínsecamente tienen una capacidad de producción de velocidad más lenta (por ejemplo, con un envejecimientode 16,40), ya que las pruebas solo capturarían un rango más pequeño de su curva de velocidad torque-angular, con algunas de las velocidades estandarizadas potencialmente cayendo cerca o más allá de Vmax. Las contracciones isotónicas, por lo tanto, permiten una mayor confianza en la captura de una representación completa de la curva de velocidad torque-angular y, por lo tanto, la producción de energía, en cualquier momento para cualquier estado de salud. En otras palabras, como señaló recientemente Thompson18, las pruebas isocinéticas no proporcionan distinción entre las mediciones de par máximo y potencia porque las velocidades están limitadas entre todos los participantes, mientras que las pruebas isotónicas desacoplan las mediciones de par y potencia al individualizar las cargas a la capacidad de par máximo de un participante determinado y capturar mejor la compensación entre par y velocidad.

La capacidad de una mejor individualización de las contracciones isotónicas puede explicar por qué la relación par-velocidad-potencia construida a partir de contracciones isotónicas produjo un Vmax más alto que cualquiera de los métodos isocinéticos (Figura 6A). Por lo tanto, si el objetivo principal de un estudio es evaluar los cambios en Vmax (por ejemplo, antes en comparación con después de una intervención de entrenamiento), se deben usar contracciones isotónicas porque las contracciones isocinéticas podrían subestimar este valor. Sin embargo, si un estudio está interesado en dilucidar los cambios en la potencia máxima, los valores de potencia producidos por las contracciones isocinéticas pueden ser similares a las contracciones isotónicas al registrar el par máximo (en lugar del par promedio) durante el acortamiento isocinético (Figura 6B).

La medición del par a la potencia máxima y la velocidad a la potencia máxima también puede ser valiosa para evaluar si la producción de par o velocidad se confía más en el rendimiento dinámico. Por ejemplo, si una enfermedad no muestra ningún cambio en la potencia máxima, sino un aumento en el par a la potencia máxima y una disminución en la velocidad a la potencia máxima, esta enfermedad afecta desproporcionadamente la velocidad y la producción de par compensa para preservar la potencia de salida. Si se intenta obtener valores de torque a potencia máxima y velocidad a potencia máxima a partir de contracciones isocinéticas que son similares a los valores obtenidos de contracciones isotónicas, se deben emplear los dos métodos isocinéticos mostrados en el presente estudio. Para el par a potencia máxima, el registro del par promedio de las contracciones isocinéticas coincide estrechamente con el obtenido de la relación par isotónico-velocidad (Figura 6C). Por el contrario, para la velocidad a potencia máxima, el registro del par máximo de las contracciones isocinéticas coincide más estrechamente con el obtenido de la relación par isotónico-velocidad, sin embargo, todavía con una subestimación del 15% (Figura 6D). Un comentario reciente18 señaló que, si se pretende describir de manera integral las capacidades funcionales de un músculo, puede ser deseable registrar pruebas isotónicas e isocinéticas independientemente, con pruebas isotónicas recomendadas para evaluar la potencia máxima y pruebas isocinéticas necesarias para evaluar la producción máxima de torque durante el acortamiento muscular.

La configuración experimental mostrada en el presente estudio también tiene ventajas para mejorar el flujo de trabajo de laboratorio en comparación con los métodos tradicionales (por ejemplo, electrodos permanentes, manguitos de nervios periféricos) para evaluar el rendimiento mecánico in vivo en roedores. El portaelectrodos personalizado permite un ajuste rápido de la altura de los electrodos y el ajuste de la distancia entre los electrodos (a través de los orificios en la pieza roja del portaelectrodos; Figura 1) para adaptarse a la longitud de la pata de cualquier rata individual. Estas características también facilitan la colocación/ubicación de los electrodos en la misma rata entre sesiones de prueba separadas, lo que es especialmente útil para estudios de entrenamiento longitudinales. De hecho, una sesión típica de entrenamiento de resistencia (4 series de 8-10 repeticiones) en esta configuración se ha completado a un ritmo de ~ 15 min por rata, o 10 ratas en ~ 2.5 h con pruebas continuas 35,36,37. Además, aunque no es el enfoque aquí, el presente grupo de investigación ha desarrollado una pieza de soporte de electrodo más pequeña para probar la función mecánica in vivo del flexor plantar del ratóntambién 41.

A pesar de las ventajas metodológicas de esta configuración, hay algunas limitaciones a tener en cuenta. Aquí usamos un rango de movimiento del tobillo de 70 ° a 110 ° porque ese es el límite del sistema de transductor de fuerza que usamos, y una posición de pierna más extendida para optimizar la producción de torque según lo informado por nuestros experimentos anteriores 35,36,37,38,28, sin embargo, esta configuración permite la modificación de estas posiciones (por ejemplo, posición de rodilla doblada, diferente rango de movimiento del tobillo, diferentes configuraciones de activación) para adaptarse a las necesidades experimentales de un investigador determinado. También debe tenerse en cuenta que esta configuración no captura completamente el comportamiento dinámico y de longitud variable característico de la función muscular in vivo durante la locomoción, ya que pueden ocurrir cambios en la carga durante las transiciones entre ángulos articulares que desafortunadamente no se pueden implementar en estos experimentos controlados de una sola articulación. Por último, el presente protocolo utilizó la ecuación de Hill para ajustar los datos de par y velocidad angular, que asume una curva de forma hiperbólica. Si bien esta forma de curva es confiable para determinar la potencia máxima (que ocurre a niveles submáximos de fuerza y velocidad), puede sobrestimar Vmax debido a la forma doble hiperbólica que se observa a menudo de la relación fuerza-velocidad 2,42. Por lo tanto, si el objetivo de un investigador es evaluar principalmente Vmax utilizando la configuración experimental presentada aquí, también se podría recomendar ajustar estos datos a una curva hiperbólica doble más compleja 2,42.

Las relaciones isotónicas e isocinéticas de par-velocidad angular-potencia presentadas aquí tenían fuertes ajustes (R2 > 0.98) a la ecuación de Hill (Figura 6H). Sin embargo, dadas las limitaciones señaladas anteriormente para las relaciones isocinéticas de par-velocidad angular-potencia, se recomienda el uso de pruebas isotónicas cuando sea posible, especialmente si se pretende evaluar la potencia máxima. Si en su lugar se deben usar pruebas isocinéticas, los hallazgos de este artículo se pueden usar como guía para comprender las limitaciones y maximizar la traducibilidad a contracciones de carga constante.

Divulgaciones

Christopher Rand y Matthew Borkowski son empleados de Aurora Scientific, Inc.

Agradecimientos

Agradecemos al personal de cuidado de animales de Salud Humana y Ciencias de la Nutrición por su ayuda con el cuidado de nuestras ratas. Este proyecto fue apoyado por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC), número de subvención RGPIN-2024-03782, y una subvención de la Alianza NSERC (ALLRP 603969-25) con Aurora Scientific inc.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1-1/2" clavos de acabado liso galvanizado en acero  The Hillman Group Canada ULC, Pickering, Ontario, Canadahttps://shop.hillmangroup.ca/ccrz__ProductDetails?sku=461146&cclcl=en_USPara el soporte electrodo hecho a medida (instrucciones de construcción proporcionadas en la Figura Suplementaria 1)
Aparatos para ratasAurora Scientific Inc. (Aurora, Ontario, Canadá)806D 
Accesorio personalizado para sujetar electrodos diseñado en Tinkercad (software de código abierto) e impreso en 3DAutodesk Tinkercad www.tinkercad.comPara el soporte electrodo hecho a medida (instrucciones de construcción proporcionadas en la Figura Suplementaria 1)
Estimulador bifásico de alta potenciaAurora Scientific Inc. (Aurora, Ontario, Canadá)701C
Piezas de LEGOBrickLink.comVéase la Figura Suplementaria S1 para los códigos BrickLink.com de todos los LEGO® PartesPara el soporte electrodo hecho a medida (instrucciones de construcción proporcionadas en la Figura Suplementaria 1)
Gel de electrodos Spectra 360Spectrahttps://www.orthocanada.com/en/spectra-electrode-gel?utm_term=&utm_campaign=Canada+EN+-+Search+-+OrthoCanada&utm_source=adwords&utm_medium=ppc&hsa_acc=1971735470&hsa_cam=136169080&hsa_grp=139530010212&hsa_ad=586754644289&hsa_src=g&hsa_tgt=dsa-19959388920&hsa_kw=&hsa_mt=&hsa_net=adwords&hsa_ver=3&gad_source=1&gad_campaignid=136169080&gbraid=0AAAAAD1V26BmzV4eR9tkH_8Truu4W7uu6&gclid=Cj0KCQjwnJfEBhCzARIsAIMtfKLpFSpoPZdXDBtyR8sRgHYCfYuELZFPs4g8U6r8t4_chBuz5KF0pBIaAoQ3EALw_wcB
Ungüento para ojos lubricante nocturno SystaneSystanehttps://www.amazon.ca/dp/B004RSQGWC?ref=nb_sb_ss_w_as-reorder_k0_1_12&=&crid=38CVEZ82H7F4&=&sprefix=eye+ointment
Diez hembras de rata Sprague-DawleyLaboratorios Charles River (Senneville, QC, Canadá)Código de deformación: 001
Cinta quirúrgica transpore3M (Milton, Ontario, Canadá)1527
Crema Depilatoria Veet PureVeethttps://www.walmart.ca/en/ip/Veet-Pure-Hair-Removal-Cream-Legs-Body-Sensitive-Skin-400-mL/10032637
Calentador/Circulador de aguaAurora Scientific Inc. (Aurora, Ontario, Canadá)827A y nbsp;

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