Artículo de método

Cuantificación de la absorción de ácidos grasos endoteliales utilizando análogos de ácidos grasos fluorescentes

DOI:

10.3791/68859

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15 de agosto de 2025

 ,  , 
1Department of Biology, Union College, 2Department of Biology, University of North Carolina Chapel Hill, 3Department of Pathology & Laboratory Medicine and McAllister Heart Institute, University of North Carolina Chapel Hill

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo detalla un ensayo in vitro para medir la captación de lípidos celulares en células endoteliales tras la estimulación con BODIPY-C12 y BODIPY-C16 , análogos fluorescentes de ácidos grasos saturados de cadena larga y cadena muy larga. Este método es eficiente y adaptable a otros tipos de células, ofreciendo un enfoque útil para estudiar el metabolismo de los lípidos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células endoteliales (CE) desempeñan un papel central en la regulación del transporte de ácidos grasos (AG) desde el torrente sanguíneo a los tejidos metabólicos, pero las herramientas para cuantificar la absorción de AG de CE de manera confiable y escalable siguen siendo limitadas. Aquí, presentamos un ensayo rápido, cuantitativo y rentable para medir la absorción de FA en CE utilizando análogos fluorescentes de FA (BODIPY-C12 y BODIPY-C16), que permiten la investigación de la dinámica de absorción específica de la longitud de la cadena en un formato de placa de 96 pocillos. El protocolo incorpora controles positivos (3-hidroxiisobutirato, lactato) y negativos (niclosamida) y está validado tanto en líneas EC primarias (HUVEC) como inmortalizadas (EA.hy926). El ensayo detecta la captación de FA dependiente del tiempo y la dosis, con resultados normalizados al número de células mediante tinción nuclear de Hoechst y corregidos por antecedentes utilizando controles apropiados. Se puede adaptar a una variedad de tipos de células, modalidades de imágenes y condiciones experimentales, incluidas las imágenes de células vivas y los formatos de persecución de pulsos. En comparación con la tinción de lípidos tradicional o los trazadores radiomarcados, este método ofrece mayor seguridad, velocidad y versatilidad al tiempo que captura la absorción dinámica de FA en células vivas. Este ensayo proporciona una plataforma sólida para estudiar la regulación del transporte de lípidos endoteliales y su contribución a la enfermedad metabólica.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para que los nutrientes transmitidos por la sangre, como los lípidos, ingresen al tejido metabólico, como el músculo esquelético, primero deben cruzar la barrera de células endoteliales (EC) que comprende las paredes de los vasos sanguíneos capilares. Si bien durante mucho tiempo se creyó que los ácidos grasos (AG) simplemente se difundían a través de esta barrera para llegar al tejido subyacente, la evidencia emergente sugiere que las CE regulan activamente este proceso a través de mecanismos de transporte especializados evolucionados para mover moléculas hidrófobas a través de mundos acuosos extracelulares e intracelulares1.

En el torrente sanguíneo, los AG existen como ácidos grasos libres unidos a albúmina (FFA) o están empaquetados dentro de lipoproteínas ricas en triglicéridos (TRL) como quilomicrones y lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL)2. En la superficie luminal de las CE, la lipoproteína lipasa (LPL) hidroliza las TRL para liberar FFA para su absorción. Una variedad de proteínas están involucradas en el transporte de FA, incluida CD36, que lleva a cabo la absorción real de la FA en la célula; proteínas transportadoras de ácidos grasos (FATP) y acil-CoA sintetasas (ACSL), que median el transporte vectorial; proteínas de unión a grasas (FAFP), que actúan como chaperonas lipofílicas, y muchas otras, algunas aún por descubrir y categorizar 2,3. El tejido subyacente también utiliza mecanismos similares para absorber la grasa transportada, aunque las isoformas específicas presentes a menudo difieren según el tipo de célula.

Estudios recientes han demostrado que las CE se coordinan con las células vecinas a través de la señalización paracrina para modular el transporte de FA a los tejidos diana. Por ejemplo, los miocitos esqueléticos secretan una colección de factores paracrinos como el 3-hidroxiisobutirato (3-HIB), el factor de crecimiento endotelial vascular B (VEGFB) y la apelina para promover el transporte de FA por el endoteliocercano 4,5,6. Curiosamente, el sistema endocrino también puede estar involucrado, como es el caso cuando la insulina estimula a los adipocitos para que liberen lactato, lo que también estimula a las CE a absorber los AG7.

Por lo tanto, las CE actúan como guardianes moduladores de la grasa, lo que sugiere que desempeñan un papel clave en los trastornos metabólicos de los lípidos, como las enfermedades cardiovasculares o la diabetes tipo 2. La evidencia reciente ha demostrado que las propias CE acumularán gotas de lípidos (LD) en respuesta a la sobrecarga de grasa, actuando potencialmente como un amortiguador que regula el suministro de ácidos grasos a los tejidos subyacentes 8,9. En el caso de un alto consumo de grasas, como es el caso de las dietas modernas, la acumulación excesiva de estas LD puede contribuir a la disfunción vascular y a enfermedades, incluida la hipertensiónarterial 10. En conjunto, una mejor comprensión de cómo las CE absorben y transportan las AF puede proporcionarnos nuevas formas terapéuticas para abordar las enfermedades transmitidas por lípidos.

En este estudio, describimos un ensayo simple, rápido y rentable para medir la captación endotelial de FA utilizando análogos fluorescentes de FA de cadena larga BODIPY-C12 y BODIPY-C16. Estos reactivos son bastante económicos y bastante seguros, especialmente en comparación con los AG marcados con isótopos radiactivos o pesados, que se han utilizado tradicionalmente para medir la absorción de grasa celular11,12. Es importante señalar que estos reactivos son distintos del colorante BODIPY "libre" no conjugado, que se acumula pasivamente en regiones hidrofóbicas de la célula, principalmente en LD13. Por el contrario, la conjugación de BODIPY con una cadena de FA alifática (por ejemplo, C12 o C16) produce una molécula que imita estructuralmente los FA nativos de cadena larga. Esta modificación permite la medición específica de la absorción dinámica de ácidos grasos en las células, en lugar de reflejar el almacenamiento intracelular de lípidos o la formación de gotas.

Una fortaleza clave de este enfoque es su flexibilidad. Los investigadores pueden usar otros tipos de células, tiempos de incubación variables y una variedad de análogos de FA conjugados con BODIPY para estudiar la absorción dependiente de la longitud de la cadena, o incluso lípidos naturalmente fluorescentes como el ácido graso cis-parinarico14. En general, este protocolo proporcionará a los investigadores una manera fácil de probar la captación celular de FA en múltiples condiciones y allanará el camino para responder preguntas fundamentales sobre el metabolismo de los lípidos, la biología endotelial y las enfermedades metabólicas (Figura 1).

Protocolo

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Todas las células endoteliales de origen humano (HUVEC) utilizadas en este estudio se obtuvieron de fuentes anónimas disponibles comercialmente de acuerdo con las pautas institucionales y de proveedores para el uso ético de materiales biológicos humanos. Realice todos los pasos en un ambiente estéril bajo una campana de flujo laminar. Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista de todos los reactivos y equipos.

1. Recubrimiento de gelatina de placa de 96 pocillos

  1. Prepare una solución de gelatina al 0,1% diluyendo 25 ml de caldo de gelatina al 2% en 500 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x.
  2. Mezcle bien y filtre y esterilice con un filtro de vacío de 0,2 μm (o autoclave).
  3. Agregue 100 μL por pocillo de gelatina al 0,1% a una placa negra de fondo transparente de 96 pocillos.
  4. Incubar a 37 °C durante al menos 30 min o idealmente durante la noche.

2. Siembra de células

  1. Prepare una suspensión unicelular de EC en medios completos.
    1. Prepare medios completos complementando el medio basal apropiado con 10% de suero fetal bovino y 1% de penicilina/estreptomicina (v/v para ambos).
      NOTA: El medio basal diferirá según el tipo de célula específico; en este estudio, se utilizó medio de crecimiento endotelial (EGM-2) y medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) para células HUVEC y EA.hy926, respectivamente.
  2. Pipetee 100 μL de la suspensión celular en cada pocillo a una densidad de siembra que permita que las células alcancen la confluencia al día siguiente.

3. Preparación y aplicación del reactivo de tratamiento

  1. Preparar todos los reactivos en PBS divalente (con Ca2+ y Mg2+) y precalentar a 37 °C.
    1. Prepare 3-HIB (control positivo) como una solución de trabajo de 20 mM. Disolver la solución madre a 1 M en agua bidestilada y almacenar a 4 °C.
    2. Preparar lactato (control positivo) como una solución de trabajo de 20 mM. Disolver la solución madre a 1 M en agua bidestilada y almacenar a 4 °C.
    3. Preparar niclosamida (control negativo) a una concentración final de 1 μM. Disolver la solución madre a 10 mM en DMSO. Alícuotas en volúmenes más pequeños para evitar el ciclo de congelación y descongelación, y almacenar a -20 °C.
  2. Lave las células una vez con PBS divalente precalentado.
  3. Añadir 50 μL por pocillo del reactivo de tratamiento adecuado (3-HIB, lactato o niclosamida) e incubar a 37° C durante 30 min (para niclosamida) o 60 min (para 3-HIB y lactato).

4. BODIPY-FA: Preparación y aplicación del complejo BSA

  1. Prepare complejos BODIPY-FA: BSA a concentraciones finales de 0,5 μM, 1 μM o 2 μM en PBS, utilizando una relación molar FA: BSA de 2:1. Para una solución de 2 μM DE BODIPY-FA, incube con 1 μM de BSA libre de FA en PBS. Para 1 μM BODIPY-FA, use 0.5 μM BSA, y así sucesivamente. Proteja siempre los complejos de la luz durante la incubación.
  2. Incube la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de usar.
  3. Agregue 50 μL del complejo a los pocillos tratados.
    NOTA: Utilice solo las 10 columnas centrales para evitar efectos de borde. Reserve las columnas exteriores como controles de autofluorescencia, agregando solo PBS a estos pocillos.
  4. Incube la placa a 37 °C durante 1 min, 5 min o 10 min.

5. Extinción de fluorescencia y detección de señales intracelulares

  1. Preparar 1 μM de BSA sin FA en PBS como tampón de lavado y precalentar a 37 °C.
  2. Retire BODIPY-FA: BSA y lave toda la placa dos veces con 50 μL de BSA sin FA de 1 μM precalentado en PBS. Realice cada lavado durante 1,5 min.
  3. Agregue 50 μL de azul de tripano al 0,08% para apagar la fluorescencia extracelular.
  4. Mida inmediatamente la fluorescencia intracelular utilizando un lector de microplacas con los siguientes ajustes: Excitación: 488 nm, Emisión: 515 nm, Corte: 495 nm, Modo: Lectura inferior.
    NOTA: Reste el fondo de autofluorescencia utilizando pocillos de columna externa que contengan células que no fueron tratadas con BODIPY-FA en el paso 4.

6. Tinción nuclear de Hoechst para la normalización celular

  1. Retire la solución de Trypan Blue y lave suavemente con PBS.
    NOTA: Las células pueden ser algo frágiles y propensas a desprenderse. Tenga cuidado al lavarse.
  2. Añadir 4 μg/mL Hoechst en medio al 10% e incubar 30 min a 37 °C.
    NOTA: El tiempo de incubación de Hoechst puede requerir optimización. Dependiendo del tipo de célula, pueden ser necesarios de 5 a 60 minutos para lograr un etiquetado nuclear uniforme y una intensidad de señal suficiente. No agregue Hoechst a las columnas exteriores.
  3. Lave el plato una vez con PBS.
  4. Agregue PBS nuevo y mida la fluorescencia de Hoechst usando los siguientes ajustes: Excitación: 350 nm, Emisión: 461 nm, Corte: 455 nm, Modo: Lectura inferior.
    NOTA: Reste el fondo de autofluorescencia de Hoechst utilizando pocillos de columna exterior.
  5. Normalice la fluorescencia de BODIPY-FA al número de celdas dividiendo los valores corregidos por autofluorescencia del paso 5.3 por los valores de Hoechst correspondientes obtenidos en el paso 6.4. Utilice valores corregidos en segundo plano para las señales BODIPY y Hoechst.
    NOTA: Los valores finales representan la captación de BODIPY-FA normalizada al número de células, corregida por autofluorescencia en los canales BODIPY y Hoechst.

7. Análisis estadístico

  1. Realice un análisis estadístico para la Figura 2 utilizando ANOVA bidireccional para evaluar los efectos del tiempo, la concentración y su interacción. Aplique la prueba post hoc de Tukey para comparaciones múltiples.
  2. Para la Figura 3 y la Figura 4, use la prueba t de dos colas no apareada de Student al comparar dos condiciones. Para experimentos que involucran tres o más condiciones, use ANOVA de una vía seguido de la prueba de Dunnett para comparaciones múltiples.

Resultados

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Como se ilustra en la Figura 1, este ensayo utiliza un formato de placa de 96 pocillos en el que los EC se siembran directamente en los pocillos. Los AG marcados con BODIPY se conjugan con albúmina sérica bovina (BSA) y se aplican tanto a pozos experimentales como de control. Antes del tratamiento de la Ataxia de Friedreich, las CE pueden manipularse mediante tratamientos farmacológicos o perturbaciones genéticas como la transfección de ARNip o la edición de genes CRISPR. Fundamentalmente, tales manipulaciones también permiten la inclusión de controles positivos y negativos apropiados para garantizar la confiabilidad del ensayo.

Se observó un claro aumento dependiente de la dosis y el tiempo en la señal intracelular de BODIPY-C12 después de incubar BODIPY-C12 a 0,5 μM, 1 μM y 2 μM durante 1 min, 5 min y 10 min tanto en HUVEC como en células EA.hy926 (Figura 2). Para tener en cuenta las posibles variaciones en el número de células por pocillo, los valores de BODIPY-C12 se normalizaron a la tinción nuclear de Hoechst y se midieron fluorescentemente. La autofluorescencia de fondo se corrigió utilizando pocillos de control sin BODIPY y sin Hoechst.

Para validar la reproducibilidad y el rango del ensayo, se probaron moduladores conocidos del metabolismo de los ácidos grasos en CE EA.hy926 utilizando BODIPY-C12 (Figura 3). El tratamiento de 1 h con concentraciones crecientes de lactato (0 mM, 5 mM, 20 mM) o 3-HIB (0 mM, 5 mM, 20 mM) mejoró la absorción de BODIPY-C12 de manera dependiente de la dosis, confirmando su papel como reguladores positivos de la absorción de FA. Por el contrario, se ha demostrado previamente que la niclosamida química puede inhibir la absorción de ácidos grasos a través del desacoplamiento mitocondrial15. De hecho, se reprodujeron resultados similares aquí, ya que 30 min de tratamiento con niclosamida (1 μM) redujeron significativamente la señal de BODIPY-C12 en relación con el control del vehículo, validando su utilidad como control negativo. Si bien estos datos se normalizan a Hoechst para tener en cuenta las diferencias en el número de células, ninguno de estos tratamientos alteró la viabilidad celular o los valores de fluorescencia de Hoechst.

Con el fin de evaluar la adaptabilidad del ensayo a diferentes análogos de ácidos grasos, se administró BODIPY-C16, que puede considerarse un sustituto de un ácido graso de cadena muy larga, a los HUVEC, y su absorción se midió después de incubaciones de 5 min (Figura 4). Se observó que el tratamiento con lactato (0 mM, 10 mM, 20 mM) aumentó la señal de BODIPY-C16 de manera dependiente de la dosis, mientras que la niclosamida (1 μM) redujo la señal, reflejando los resultados observados con BODIPY-C12.

En general, este ensayo ha permitido una cuantificación sólida y reproducible de la captación de FA tanto en CE primarias (HUVEC) como inmortalizadas (EA.hy926). Además, estos hallazgos demuestran la versatilidad del ensayo en los AG de diferentes longitudes de cadena, además de mostrar la validez de los controles positivos y negativos.

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Figura 1: Esquema del ensayo de absorción de ácidos grasos utilizando ácidos grasos marcados con BODIPY. Las células endoteliales se siembran en una placa negra de 96 pocillos de fondo transparente y se incuban con análogos de ácidos grasos conjugados (FA) de BODIPY para permitir la absorción intracelular. Después de la incubación, la fluorescencia extracelular se apaga con azul de tripano y la señal intracelular se mide utilizando un lector de microplacas de fluorescencia de lectura inferior. La tinción nuclear de Hoechst se aplica después de la medición de fluorescencia para cuantificar el número de células para la normalización. Se puede aplicar tratamiento farmacológico o perturbaciones genéticas antes de la incubación de BODIPY-FA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Cuantificación de la captación de BODIPY-C12 en células endoteliales primarias e inmortalizadas. (A) Aumento dependiente del tiempo y la concentración en la absorción de BODIPY-C12 en HUVEC después de incubaciones de 1 min, 5 min y 10 min a 0,5 μM, 1 μM y 2 μM BODIPY-C12 complejado a 0,25 μM, 0,5 μM y 1 μM BSA libre de FA, respectivamente. (B) Las células EA.hy926 exhibieron una absorción similar de BODIPY-C12 dependiente del tiempo y la dosis en condiciones idénticas. La intensidad media de fluorescencia se normalizó a núcleos teñidos con Hoechst (número de células) y controles sin BODIPY. Los datos se muestran como media ± DE. El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA de dos vías para evaluar los efectos del tiempo, la concentración y su interacción, seguido de la prueba post hoc de Tukey para comparaciones múltiples. Se observaron efectos principales significativos para el tiempo (p < 0,0001), la concentración (p < 0,0001) y su interacción (p = 0,0443). Las comparaciones por pares estadísticamente significativas identificadas por la prueba de Tukey se indican en el gráfico de barras de la siguiente manera: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 y ****p < 0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Validación del ensayo utilizando controles positivos y negativos en EA.hy926. (A) El tratamiento con lactato de 1 h (0 mM, 5 mM, 20 mM) aumentó la absorción de BODIPY-C12 de manera dependiente de la dosis. (B) El tratamiento con 3-HIB de 1 h (0 mM, 5 mM, 20 mM) aumentó de manera similar la absorción de FA. (C) El tratamiento con niclosamida de 30 minutos (1 μM) suprimió significativamente la absorción de BODIPY-C12 en relación con el control del vehículo (DMSO). La intensidad media de fluorescencia se normalizó a núcleos teñidos con Hoechst (número de células) y controles sin BODIPY. Los datos se muestran como media ± DE. Se incubó BODIPY-C12 de 2 μM (complejado a 1 μM de BSA libre de ácidos grasos) durante 5 min para todos los experimentos. Las estadísticas para (A) y (B) se determinaron utilizando ANOVA de una vía con la prueba de Dunnett para comparaciones múltiples, y para C usando la prueba T de dos colas no apareada de Student. p < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Validación de ensayos utilizando BODIPY-C16 en HUVEC. (A) El tratamiento con lactato (0 mM, 10 mM, 20 mM durante 1 h) mejoró la absorción de BODIPY-C16 de manera dependiente de la dosis. (B) El tratamiento con niclosamida (1 μM durante 1 h) redujo significativamente la señal de BODIPY-C16 en comparación con el control tratado con el vehículo. La intensidad media de fluorescencia se normalizó a núcleos teñidos con Hoechst (número de células) y controles sin BODIPY. Los datos se muestran como media ± DE. Se incubó BODIPY-C16 de 2 μM (complejado a 1 μM de BSA libre de ácidos grasos) durante 5 min para todos los experimentos. Las estadísticas para (A) se determinaron utilizando ANOVA de una vía con la prueba de Dunnett para comparaciones múltiples, y para B usando la prueba T de dos colas no apareada de Student. *p < 0,05, ***p < 0,001 y ****p < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

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Este ensayo ofrece un método rápido, cuantitativo y rentable para medir la absorción de FA en CE utilizando un formato basado en placas de 96 pocillos y análogos fluorescentes de FA de cadena larga. Al incorporar controles positivos y negativos y validar en CE primarios (HUVEC) e inmortalizados (EA.hy926), este protocolo demuestra robustez, reproducibilidad y amplia aplicabilidad.

Los análisis basados en fluorescencia han sido fundamentales para descubrir reguladores paracrinos del transporte endotelial de lípidos, como se mencionó anteriormente 4,5,7. Estos ejemplos destacan cómo un sistema estandarizado puede continuar dilucidando de manera confiable la regulación del transporte de lípidos impulsada por metabolitos en un entorno controlado in vitro. El protocolo descrito aquí establece parámetros clave para mediciones confiables de absorción de FA, incluido el uso de BODIPY-C12 y BODIPY-C16 en múltiples concentraciones (0,5-2 μM) y tiempos de incubación (1 min, 5 min y 10 min). También detectó eficazmente un aumento de la absorción en respuesta a 3-HIB y lactato, y una reducción de la absorción después del tratamiento con niclosamida, lo que confirma tanto su sensibilidad como su rango dinámico. Si bien está optimizado aquí para CE, este ensayo se puede adaptar fácilmente a otros tipos de células como adipocitos, miotubos o hepatocitos con ajustes a las proporciones BODIPY: BSA y las condiciones de tratamiento. También se puede modificar para obtener imágenes de células vivas utilizando placas compatibles o adaptar a un formato de persecución de pulsos para evaluar la retención, el metabolismo o el flujo de FA intracelular.

En comparación con otros enfoques, este método ofrece claras ventajas: es escalable, cuantitativo y adaptable a varias longitudes de cadena FA. Además, es rentable, implica solo un puñado de pasos y requiere instrumentos no más complejos que un lector de microplacas común, lo que permite a los nuevos usuarios, incluidos los estudiantes, dominar rápidamente este protocolo. Finalmente, a diferencia de los métodos basados en microscopía cualitativa o las tinciones de punto final como Oil Red O, que reflejan el contenido acumulado de lípidos, este protocolo captura la absorción de FA en tiempo real sin necesidad de fijación o lisis.

No obstante, se deben tener en cuenta varias limitaciones. El uso de un sistema de cultivo estático 2D no recapitula completamente la complejidad fisiológica del entorno vascular. Factores clave como el esfuerzo cortante o la lipólisis mediada por LPL, así como las interacciones endotelial-parenquimatosa, están ausentes de este modelo simplificado. Los sistemas avanzados, como los cocultivos 3D basados en microfluidos u organoides, imitan mejor la arquitectura y la señalización in vivo, aunque requieren una mayor experiencia técnica e infraestructura16,17. Por ejemplo, los biorreactores microfluídicos proporcionan un entorno en el que las CE pueden imitar la formación de microvasculatura e interactuar con otros tipos de tejidos, lo que permite a los investigadores modelar la dinámica paracrina en un entorno más fisiológico18. Además, trabajos recientes han demostrado que se pueden desarrollar sistemas especializados para llevar a cabo imágenes fluorescentes en vivo en cultivos de hidrogel 3D19. Estos avances proporcionan la confianza de que este ensayo podría algún día adaptarse a sistemas de cultivo celular que sean más representativos fisiológicamente, pero sería necesario realizar una optimización.

En resumen, este ensayo representa una plataforma flexible, accesible y reproducible para investigar la captación de AG celular en diversas condiciones. Si bien es más adecuado para estudios mecanicistas in vitro , los conocimientos obtenidos de este sistema pueden informar trabajos futuros utilizando modelos fisiológicamente más relevantes de transporte de lípidos endoteliales.

Divulgaciones

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Los autores han declarado que no existe ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

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Tanisha Choudhury fue financiada por una beca de investigación de pregrado de verano de la Oficina de Investigación de Pregrado de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill. Boa Kim recibió el apoyo de NHLBI (R56HL162660) y AHA (24CDA1264317). Ayon Ibrahim fue apoyado por el Fondo de Investigación de la Facultad de Union College.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
3-hidroxiisobutirato (3-HIB)Cayman Chemicals26105Control positivo, concentración final de 5 o 20 mM
Microplaca de poliestireno negra de 96 pozos, fondo transparenteSigma-AldrichCLS3603-48EAPara que se ensayen las células de chapado
BODIPY FL C12 (Bodipy-FA)Thermo Fisher ScientificD3822Ácido graso fluorescente verde de cadena larga
BODIPY FL C16 (Bodipy-FA)Thermo Fisher ScientificD3821Ácido graso de cadena muy larga fluorescente verde
Solución de albúmina sérica bovinaSigma-AldrichA9205-50MLUtilizado para preparar el complejo Bodipy:BSA
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD2650Disolvente para acciones farmacéuticas
Depósitos desechables de pipetosVWR89094-680Contiene las distintas soluciones que se pipetearán sobre las celdas
Dulbecco' s Modified Eagle' s MedioCiencias de la Vida de Corning10-013-CVMedios para celdas EA.hy926
Celdas EA.hy926ATCCCRL-2922 Línea híbrida de células endoteliales inmortalizadas
BulletKit EGM-2 Medio de Crecimiento Celular Endotelial BulletKitLonzaCC-3162Medios para HUVECs
Suero fetal bovino (FBS) y nbsp;VWR97068-085Suplemento del 10% en EGM-2 y DMEM
Lector de microplacas de fluorescenciaVariosN/ACualquier lector de microplacas capaz de mediciones de fluorescencia
Solución de gelatinaSigma-AldrichG1393-100mlSe utiliza para recubrir placas a una concentración de trabajo del 0,1%
Solución Hoechst 33342Ciencias de la Vida62249Tinción nuclear para la normalización celular (4 & mu; M)
Células endoteliales de la vena umbilical, humana (HUVEC)LonzaC2519ACélulas endoteliales humanas primarias
Pipeta multicanalVWR76627-768Para pipetear en una placa de 96 pozos
Niclosamida Millipore SigmaN3510-50GControl negativo, 1 y mu; M  Concentración final
PBS, con calcio y magnesioFisher Scientific21031CVSe utiliza para preparar tratamientos y como amortiguador de lavado (con BSA)
PBS, sin calcio ni magnesioGenesee Scientific25-508Para dilución de gelatina, tinción Hoechst y lavados generales
Penicilina/EstreptomicinaThermo Fisher Scientific15140122Suplemento del 1% en EGM-2 y DMEM
L-lactato sódicoSigma-AldrichL7022-5GControl positivo, concentración final de 5 o 20 mM
Solución de Trippan BlueSigma-AldrichT8154-20MLUsado al 0,08% para calmar la fluorescencia extracelular
Sistemas de filtro de vacío, membrana PES de 500 ml, 0,45 y micro; mGenClone25-227Para esterilizar la solución de gelatina

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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