Un análisis R potente y fácil de usar de conjuntos de datos a gran escala

Con la mayor disponibilidad de grandes conjuntos de datos en el campo científico, es importante desarrollar herramientas fáciles de usar que permitan a los investigadores analizar rápidamente estos grandes conjuntos de datos con precisión y facilidad. Un tipo de gran conjunto de datos común proviene del uso del gen de la luciferasa como informador, lo que ha permitido un examen fácil, continuo y no invasivo de la expresión génica en células y organismos vivos. La automatización en el registro de luminiscencia ha transformado la medición de la luminiscencia de la luciferasa y ha llevado a una expansión de la recopilación de datos, en particular, en el campo del reloj circadiano ^1,2. Usando microplacas de 96 pocillos y un lector automático de placas con un apilador, miles de muestras que expresan el gen de la luciferasa se pueden analizar individualmente en series temporales, a veces a intervalos de una hora durante días, en un experimento. Estos experimentos de alto rendimiento han dado como resultado la producción de grandes conjuntos de datos que los experimentos tradicionales de expresión génica que utilizan la recolección manual de muestras, seguida del procesamiento de ARN, no podrían lograr. Analizar conjuntos de datos tan grandes de manera oportuna es importante, pero puede ser un desafío.

Aunque existe una gran cantidad de herramientas para analizar los datos de ritmicidad, muchas de las herramientas analizan ensayos basados en el comportamiento animal en lugar de la expresión del reportero de luminiscencia 3,4,5,6,7 (Tabla complementaria S1). Algunas herramientas requieren que los investigadores tengan conocimientos previos de programación informática, como conocimientos de Python o acceso a MATLAB. Otras herramientas requieren la compra de software, lo que puede ser costoso. Algunas soluciones viables gratuitas están disponibles en línea. Una de esas herramientas es BioDare2⁸, que ofrece una variedad de métodos diferentes para analizar datos de ritmicidad. BioDare2 es una herramienta en línea fácil de usar y requiere una experiencia computacional mínima. Los usuarios deben cargar la entrada de datos en línea y descargar la salida de datos de la interfaz en línea para su posterior procesamiento.

Aquí, presentamos scripts de R fáciles de usar con múltiples capacidades para analizar conjuntos de datos a gran escala con facilidad. Usamos el software gratuito de código abierto RStudio⁹, una interfaz para R y Python, para ejecutar los scripts. RStudio se puede utilizar en varios sistemas informáticos, incluidos Windows, Mac y Linux. En este informe, se proporcionan instrucciones detalladas paso a paso para guiar a los usuarios sobre cómo usar los scripts de R, específicamente en las secciones 1 y 2 del protocolo. Este método requiere una entrada mínima del usuario. Un principiante que no tenga conocimientos previos de R y que no tenga experiencia en programación podrá utilizar el método para analizar grandes conjuntos de datos de ensayos de luciferasa u otros tipos de conjuntos de datos con datos de series temporales. Todos los datos de entrada y salida se almacenan en una computadora local y, por lo tanto, se puede realizar un análisis en cualquier lugar sin la restricción del acceso a Internet, una vez que se descargan todos los paquetes de R relevantes por primera vez. Los datos de salida se clasifican en carpetas bien organizadas con resultados listos para ser procesados para publicaciones. Los análisis estadísticos también se incluyen como parte de la salida para proporcionar una evaluación rápida de las diferencias entre las muestras. Por lo tanto, el método R podría proporcionar una solución fácil y poderosa para los investigadores en el análisis de grandes conjuntos de datos.

1. Análisis del reloj circadiano basado en luciferasa

1. Configuración experimental para el ensayo de luciferasa
   NOTA: El ensayo de luciferasa es un método común utilizado para medir la actividad del reloj circadiano en tiempo real. La luminiscencia, emitida por el reportero de luciferasa transportado por organismos y/o células transgénicas vivas, se puede registrar automáticamente, lo que lleva a la producción de conjuntos de datos de series temporales a gran escala. Nuestro laboratorio utiliza principalmente plántulas de Arabidopsis thaliana que expresan el gen de la luciferasa como indicador. La Figura 1 y la Figura 2 muestran un diagrama de flujo de la configuración experimental típica para el ensayo de luciferasa con plántulas en un formato de 96 pocillos en nuestro laboratorio, modificado en base a una descripción previa².
   1. Esterilice las semillas con el vapor de lejía generado agregando 3 ml de HCl al 36% (p/p) a 100 ml de lejía doméstica en un vaso de precipitados durante 3 h. Coloque el vaso de precipitados en una campana con tapa sellada, colocada en una campana extractora de productos químicos. Después de la esterilización, coloque las semillas en placas de 1/2MS que contengan 0,5% de sacarosa y 0,8% de agar (pH 5,7), utilizando una pipeta Pasteur de vidrio estéril, en una cabina de flujo laminar. Recoja los desechos químicos en un frasco con tapa y deséchelos trabajando con el departamento de servicios de salud ambiental institucional.
   2. Coloque las placas a 4 °C durante 2 días antes de trasladarlas a una cámara de cultivo de tejidos con un ciclo de luz de 12 h y un ciclo de luz oscura (LD) de 12 h.
   3. Deje que las plántulas crezcan durante 4 días en LD.
   4. Transfiera las plántulas a una placa de 96 pocillos; cada pocillo contiene 180 μL de medios de ensayo (1/2MS, 0,5% de sacarosa, 0,4% de agar, 0,25 mM de luciferina). Colocar los platos durante 1 día en LD seguido de 1 día en 24 h de luz constante (LL).
   5. Agregue tratamientos o solución simulada a los pocillos y registre la luminiscencia a intervalos de 1 h durante 5-7 días en LL. Ajuste la lente del filtro de emisión a 3.600 para la ganancia y el tiempo del intervalo de medición a 1 s.
      NOTA: La hora de inicio de la grabación puede ser en cualquier momento. Sin embargo, dado que el script de R solo toma enteros (números enteros), los intervalos de grabación deben ser un número entero. Por ejemplo, se permite un intervalo de 1 h, pero no se permite un intervalo de 15 min para el script de R.
   6. Al final de la grabación, tome una foto de la placa para registrar el crecimiento de las plántulas.
   7. Guarde los datos sin procesar como un archivo CSV para el análisis R, utilizando la función guardar como con el software de análisis de datos para el lector de placas.
2. Explicación paso a paso del análisis R de datos circadianos basados en luciferasa
   NOTA: Este análisis de R utiliza el script de RArchivo complementario 1(LUC_2025.R), desarrollado para el análisis de datos circadianos, y el archivo de entradaArchivo complementario 2(NO7.csv). El script R junto con el archivo de entrada está disponible públicamente a través de la plataforma de repositorio en línea Github (https://github.com/elvenfire29/Circadian-Luciferase-Analysis).
   1. Descargue el software RStudio que sea compatible con el sistema informático ^9,10.
   2. Descargue los paquetes algorítmicos de RStudio requeridos por el archivo complementario 1 (LUC_2025.R): MetaCycle¹¹: algoritmo ARSER¹² del paquete MetaCycle, ggplot2¹³, dplyr¹⁴, magrittr¹⁵, stringr¹⁶, filesstrings¹⁷, circular¹⁸, AICcmodavg¹⁹ y broom²⁰.
      NOTA: Consulte también la parte superior del script de R para ver la lista de paquetes.
   3. Cambiar la entrada del usuario I (de acuerdo con un conjunto de datos específico en una computadora local, incluido el directorio de trabajo, el nombre del archivo de entrada, las etiquetas de los tratamientos y la hora de inicio relativa del ensayo.
      NOTA: Los pasos 1.2.1 y 1.2.2 solo deben completarse una vez; después de lo cual la consola de interfaz RStudio está lista para recibir la entrada del usuario, con modificaciones para cada nuevo análisis. Hay dos partes en la sección Entrada del usuario (Figura complementaria S1).
      1. Seleccione el directorio de trabajo. Indique dónde reside el archivo de entrada. La misma carpeta será la ubicación de los archivos de salida.
      2. Seleccione el archivo de entrada, un archivo CSV con el formato correcto para el script de R (figura 2B). Específicamente, la fila superior tiene la serie temporal y la primera columna contiene posiciones de muestra individuales en una placa de 96 pocillos.
         NOTA: Puede encontrar un ejemplo de dicho archivo CSV de entrada en el Archivo complementario 2 (NO7.csv).
      3. Nombra las muestras y/o tratamientos. Como este análisis se utiliza para datos obtenidos de entornos de 96 pocillos con un curso de tiempo, diseñe los experimentos como 8 réplicas por tratamiento para un total de hasta 12 tratamientos por placa, o como 12 réplicas por tratamiento para un total de hasta 8 tratamientos por placa. Asegúrese de ingresar el número correcto de muestras, ya sea 8 o 12, porque el número de muestra cuenta; Si el recuento de muestras no es 8 o 12, el código no se ejecutará. Sin embargo, si hay filas de pozos vacíos, simplemente enumérelos como tales en el espacio para los nombres de tratamiento, por ejemplo, nombrando como vacío 1, vacío 2 ...
         NOTA: Para los nombres de muestra, se debe evitar el uso de barras invertidas o símbolos similares, ya que pueden causar problemas con el nombre de archivo. Además, también se debe evitar usar "NA" como etiqueta al seleccionar usar ANOVA en la entrada del usuario II. Cualquier tratamiento con exactamente el mismo nombre se combinará en un grupo de tratamiento grande.
      4. Indique la hora de inicio relativa del ensayo. Para un día determinado de 24 h, el amanecer subjetivo es cuando la luz de la cámara se enciende durante un ciclo normal de luz / oscuridad. Por ejemplo, si la luz está encendida a las 7 am, considere esta hora la hora circadiana 0. Si un ensayo de luciferasa comienza a las 9 am, el tiempo del ensayo es en el tiempo circadiano 2; entrada 2 como hora de inicio relativa.
         NOTA: La hora de inicio relativa debe ser un número entero y no puede ser negativa. Esto afectará la lectura de fase de las muestras.
   4. Cambie las opciones de entrada de usuario II según las necesidades específicas.
      NOTA: Las instrucciones a continuación proporcionan una explicación más detallada de las secciones de Entrada del usuario y una guía paso a paso para realizar los cambios.
      1. Incluya gráficos: curvas de luminiscencia, gráficos para el período, la fase y la amplitud por genotipo y tratamiento.
      2. Utilice la prueba ANOVA con el Tukey HSD para comparar tratamientos en su período, fase y amplitud. Elija un control para la salida de prueba de ANOVA; especifique el control para la prueba ANOVA o deje la opción vacía para usar cada tratamiento como control en la comparación por pares. Alternativamente, elija si desea numerar los archivos de salida de ANOVA para una referencia y organización más rápidas.
      3. Use una prueba t para comparar tratamientos en su período, fase y amplitud. Elija si la prueba t debe ser una comparación por pares; Si se selecciona una prueba t por pares, seleccione si los datos están emparejados. Elija un control para la prueba t; Especifique el control para la prueba t o deje la opción vacía para usar cada tratamiento como control. Elija si desea numerar los archivos de salida de la prueba t para una referencia y organización más rápidas.
         NOTA: Esto solo debe usarse para comparar dos tratamientos a la vez, como dos líneas del mismo genotipo con SA o Mock agregado. Los valores p que se muestran no se ajustan para tener en cuenta múltiples comparaciones con la misma línea.
      4. Elija si desea redondear los puntos de tiempo. Si los puntos de tiempo están desfasados solo uno o dos minutos, redondee a la hora más cercana y use este análisis.
         NOTA: Este código calcula el período, la fase y la amplitud utilizando el método ARS¹². Este método requiere una serie temporal coherente en horas para ejecutarse.
      5. Dependiendo de cómo el lector de placas registre los pocillos, cambie la forma en que se lee la entrada. Elija la lista de datos estándar de pozos por A1, A2, A3 ... o el de los pozos enumerados por A1, B1, C1...
   5. Ejecute el análisis simplemente haciendo clic en el botón Origen en la esquina superior derecha de la consola.
      NOTA: El análisis tarda menos de 1 minuto en completarse. La salida del análisis de R aparecerá automáticamente en la misma carpeta de archivos que el conjunto de datos de entrada.
   6. Ver salida: La carpeta de salida tiene varios documentos y subcarpetas para proporcionar un análisis completo, incluida información estadística del período, la fase y la amplitud promediados para las réplicas de cada genotipo y/o tratamiento.
      NOTA: Para el archivo de entrada Archivo complementario 2 (NO7.csv), en la Tabla 1 se describe una lista de los documentos de salida generados por el script Archivo complementario 1 (LUC_2025.R) en la sección 1 del protocolo y se puede ver convenientemente con la estructura de árbol en la Figura complementaria S2.

2. Ensayo ROS basado en luminol

1. Configuración experimental para el ensayo ROS
   1. Corte discos de hojas de 4 mm de diámetro de la cuarta a la séptima hoja de plantas de 25 días con un perforador de biopsia.
   2. Haga flotar los discos de las hojas con el lado piloso hacia arriba sobre 100 μL de agua estéril en una placa de 96 pocillos.
   3. Cubra el plato con papel de aluminio limpio y colóquelo en una cámara de crecimiento LD durante la noche.
   4. Reemplace el agua con 100 μL de solución de luminol (300 μM en tampón MOPS de 10 mM con pH 7.4 y 1 μM flg22 u otro elicitor). Utilice una solución simulada en lugar de flg22 como control.
   5. Comience inmediatamente a registrar lecturas de luminiscencia cada minuto durante 40-60 minutos.
2. Explicación paso a paso del análisis R de datos ROS
   NOTA: Este análisis de R utiliza Rstudio, el script de R,  el archivo complementario 3 (ROS_2025.R) y los archivos de entrada Archivo complementario 4 (ROS_flg22.csv) o Archivo complementario 5 (ROS_elf26.csv). El script de R junto con el archivo de entrada Archivo complementario 4 (ROS_flg22.csv) está disponible públicamente a través de la plataforma de repositorio en línea Github (https://github.com/elvenfire29/ROS-Luminol-Analysis)
   1. Descargue los paquetes de RStudio: gplot2¹³, dplyr¹⁴, magrittr¹⁵, stringr¹⁶ y filesstrings¹⁷.
      NOTA: Los pasos 2.2.1 solo deben completarse una vez. Para ayudar a los usuarios a adaptar cada análisis a un conjunto específico de datos en la computadora, se creó una sección llamada "Entrada del usuario" para permitir a los usuarios indicar parámetros específicos para sus experimentos (Figura complementaria S3).
   2. Cambie la entrada del usuario I de acuerdo con un conjunto de datos específico en un equipo local, incluido el directorio de trabajo, el nombre del archivo de entrada, las etiquetas de los tratamientos y la hora de inicio relativa del ensayo.
      1. Seleccione el directorio de trabajo. Indique dónde reside el archivo de entrada. La misma carpeta será la ubicación de los archivos de salida.
      2. Seleccione el archivo de entrada, un archivo CSV con el formato correcto para el script de R (figura 2B). Específicamente, la fila superior tiene la serie temporal y la primera columna contiene posiciones de muestra individuales en una placa de 96 pocillos.
         NOTA: Un ejemplo de dicho archivo CSV de entrada se puede encontrar en el material complementario, Archivo complementario 4 (ROS_flg22.csv) o Archivo complementario 5 (ROS_elf26.csv).
      3. Nombra las muestras y/o tratamientos. Como este análisis se utiliza para datos obtenidos de entornos de 96 pocillos con un curso de tiempo, diseñe los experimentos como 8 réplicas por tratamiento para un total de hasta 12 tratamientos por placa, o como 12 réplicas por tratamiento para un total de hasta 8 tratamientos por placa. Si hay filas de pozos vacíos, simplemente enumérelos como tales en el espacio para los nombres de tratamiento, por ejemplo, nombrando como vacío 1, vacío 2 ...
         NOTA: Es importante ingresar el número correcto de muestras, ya sea 8 o 12, porque el número de muestras cuenta. Si el recuento de muestras no es 8 o 12, el código no se ejecutará. Para los nombres de ejemplo, evite usar barras diagonales inversas o símbolos similares, ya que pueden causar problemas con los nombres de archivo. También evite usar "NA" como etiqueta al seleccionar usar ANOVA en la entrada del usuario II. A diferencia del script Archivo complementario 1 (LUC_2025.R), los tratamientos con el mismo nombre no se combinan en un solo grupo en este script Archivo complementario 3 (ROS_2025.R).
   3. Cambie las opciones de Entrada de usuario II según las necesidades específicas del usuario.
      NOTA: El ejemplo de entrada del usuario se puede ver en la Figura complementaria S3.
      1. Utilice la prueba ANOVA con el Tukey HSD para comparar las sumas de luminiscencia del tratamiento.
      2. Utilice una prueba t de dos lados para comparar los datos de solo dos tratamientos a la vez.
         NOTA: Los valores p que se muestran no se ajustan para tener en cuenta múltiples comparaciones con la misma línea.
      3. Grafique las curvas de fluorescencia y un gráfico de barras que compare la suma total de fluorescencia. Agregue la desviación estándar o el error estándar de la media a los gráficos.
      4. Dependiendo de cómo el lector de placas registre los pocillos, cambie la forma en que se lee la entrada. O bien utilice la lista de datos estándar de pozos por A1, A2, A3... o el de los pozos enumerados por A1, B1, C1...
3. Ejecute el análisis simplemente haciendo clic en el botón Origen en la esquina superior derecha de la consola.
   NOTA: El análisis tarda menos de 1 minuto en completarse. La salida del análisis de R aparecerá automáticamente en la misma carpeta de archivos que el conjunto de datos de entrada.
4. Ver salida: La carpeta de salida tiene varios documentos y subcarpetas para proporcionar un análisis completo.
   NOTA: Para el archivo de entrada Archivo complementario 4 (ROS_flg22.csv), se muestra una estructura de árbol de los documentos de salida generados por el script Archivo complementario 3 (ROS_2025.R) descrito en la sección 2 del protocolo en la Figura complementaria S4.

Estudio de caso 1. El ensayo de luminiscencia para la actividad del reloj circadiano con plántulas de Arabidopsis

Anteriormente demostramos que el gen GLYCINE-RICH RNA-BINDING PROTEIN 7 (GRP7) estaba controlado por la proteína del reloj maestro CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED 1 (CCA1) y la expresión circadiana de GRP7 es importante por su papel en la defensa de las plantas, utilizando plantas transgénicas Col-0 que expresan el reportero de luciferasa bajo el control del promotor de GRP7 de tipo salvaje (pGRP7wt:LUC)21. Analizamos las actividades del reloj circadiano de estas plantas transgénicas junto con la planta de control CCA1: LUC / Col-0, utilizando el script R llamado LUC_2025.R (Archivo complementario 1 en la sección 1 del protocolo).

El archivo de entrada denominado NO7.csv (Archivo complementario 2) tiene lecturas de luminiscencia para siete líneas pGRP7wt:LUC independientes y el control CCA1:LUC/Col-0 (Archivo complementario 2 (NO7.csv)). Después de ejecutar el script, la subcarpeta de salida llamada salida NO7 se generará en la misma carpeta que el archivo de entrada NO7.csv (Archivo complementario 2 (NO7.csv)). Los archivos de la carpeta de salida de NO7 se describen en la Tabla 1 y se pueden ver convenientemente con la estructura de árbol en la Figura complementaria S2. Los valores en la carpeta de salida de NO7 se procesaron aún más para hacer la Figura 3 y la Figura 4. La Figura 3 muestra que el reportero CCA1:LUC mostró una amplitud de 3.000 RLU, un período de 23,5 h y una fase de 3,5 h. Estos parámetros de reloj son en gran medida consistentes con informes anteriores22,23. Se observó un patrón de expresión diferente para las líneas pGRP7wt:Luc. Si bien todas las líneas pGRP7wt:LUC parecían ser similares en período y fase, hubo diferencias en los valores de amplitud de estas líneas, probablemente debido al efecto posicional de los transgenes en los cromosomas. Estas observaciones se confirmaron aún más cuando se calcularon los parámetros de período, amplitud y fase a través del script R (Figura 4). Para validar este análisis, el mismo conjunto de datos se volvió a analizar utilizando BioDare2, una plataforma en línea gratuita para el análisis de datos circadianos8. Los resultados del análisis R fueron comparables a los obtenidos con el algoritmo BioDare2 FFT-NLLS (NLLS) 8,24 (Figura 4).

Estudio de caso 2. El ensayo de luminiscencia para la actividad del reloj circadiano con células de mamíferos
El script R LUC_2025.R (Archivo complementario 1 se utilizó además para analizar la actividad del reloj circadiano mostrada por las células de mamíferos25. La línea celular U2 OS que expresa un indicador de reloj circadiano es una línea celular modelo de uso común para medir las actividades del reloj circadiano de los mamíferos26,27. Volvimos a analizar los datos de series temporales generados con células U2 OS que expresan el reportero Per2d:Luc cultivado en una placa de 96 pocillos. Las células fueron tratadas con moléculas de ARNip dirigidas a genes específicos. La Figura 5 muestra que las células de control negativo, que no fueron tratadas con ARNip, mostraron un período de 23,3 h, una fase de 2,8 h y una amplitud de 184,8 RLU. Como era de esperar, el siRNA dirigido al gen CRY2 amortiguó significativamente la amplitud y afectó el período y la fase del reportero. Los genes PSMD4 y PSMD7 codifican proteínas que forman parte del componente de la tapa del proteasoma 26S para la degradación de proteínas. De acuerdo con el informe anterior25, el análisis R muestra que la eliminación de PSMD4 o PSMD7 por sus respectivos ARNip no afecta los parámetros del reloj. Por lo tanto, esta escritura R es fácilmente aplicable a diferentes sistemas experimentales para estudios de reloj circadiano.

Estudio de caso 3. El ensayo ROS para una respuesta de defensa
Además de los grandes conjuntos de datos de los ensayos de reloj circadiano luminiscente, el script R se puede adaptar para analizar otros tipos de datos. Aquí presentamos una de esas aplicaciones para cuantificar las especies reactivas de oxígeno (ROS). Se sabe que las plantas han desarrollado varias estrategias para luchar contra la invasión de patógenos. Una de las estrategias es reconocer las moléculas no propias de un patógeno y posteriormente activar las respuestas inmunitarias innatas. Una de esas respuestas inmunitarias tempranas es una explosión de ROS, que ocurre en cuestión de minutos cuando un huésped se encuentra con una molécula que no es propia. Se realizó un ensayo típico de ROS con una placa de 96 pocillos, que contenía 12 discos foliares por genotipo por tratamiento (sección 2 del protocolo). Aquí, se utilizaron dos moléculas elicitoras comunes, flg22, un péptido de 22 aminoácidos derivado de la región conservada de las proteínas de flagelina bacterianas28, y elf26, un péptido de 26 aminoácidos del factor de elongación Tuproteína 29, para inducir el estallido de ROS. El script, Archivo Suplementario 3 (ROS_2025.R), fue desarrollado para el análisis de datos ROS. Dos archivos CVS de los ensayos ROS, el Archivo Suplementario 4 (ROS_flg22.csv) y el Archivo Suplementario 5 (ROS_elf26.csv), que se convirtieron al formato del análisis R, se pueden descargar desde la sección Material Suplementario. Después del análisis R, las carpetas de salida se generarán en la misma carpeta que cada archivo de entrada en el propio ordenador, conteniendo las curvas de ráfaga de ROS y los valores totales de ROS durante el tiempo de ensayo, junto con los análisis estadísticos (Figura complementaria S4). Los datos se procesaron posteriormente para hacer la Figura 6. Los resultados que se muestran aquí son similares a los publicados, que fueron procesados manualmente30.

Figura 1: Diagrama de flujo del ensayo de luciferasa para el análisis R. Las plántulas que expresaban un reportero de luciferasa impulsado por un promotor de reloj se esterilizaron y se cultivaron en 1/2 medio MS en LD durante 4 días. Las plántulas se transfirieron a placas de 96 pocillos que contenían 180 μL de medio 1/2 MS que contenía D-luciferina. Cada pozo contenía una plántula. Después de 1 día en LD seguido de 1 día en LL, la luminiscencia se registró con un lector de placas. Las plántulas en una placa se registraron típicamente para luminiscencia en LL a intervalos de 1 h durante 5-7 días. Después de la grabación, las placas se fotografiaron para evaluar el crecimiento de las plántulas y los datos sin procesar se guardaron como un archivo CSV para el análisis R. Abreviaturas: LD = 12 h claro/12 h oscuro; LL = luz constante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Diagrama de flujo de adquisición de datos de luminiscencia y análisis R. (A) Se describe un procedimiento de cinco pasos para el análisis del reloj circadiano utilizando el script R. Paso 1. Establecer experimentos como 8 o 12 plántulas por genotipo y/o por tratamiento; Paso 2. Registre la luminiscencia en LL a intervalos de 1 h durante 5-7 días; Paso 3. Obtener y formatear datos en un archivo CSV; Paso 4. Analizar datos usando R; y Paso 5. Ver datos de salida. La hora de inicio de la grabación puede ser en cualquier momento. Sin embargo, dado que el script de R solo toma enteros (números enteros), los intervalos de grabación deben ser un número entero. (B) Captura de pantalla de un archivo CSV de entrada con el formato correcto para el script de R. El archivo de entrada original, NO7.csv, se puede encontrar en el Archivo complementario 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Expresión circadiana de pGRP7wt:LUC en plantas transgénicas. Se muestran trazas de luminiscencia de pGRP7wt:LUC. Las barras debajo del eje x indican día subjetivo (barras abiertas) y noche (barras grises). El rastro de luminiscencia de cada genotipo es un promedio de 12 réplicas. Las barras de error no se mostraban debido a la gran cantidad de curvas. Abreviatura: RLU = Unidades de luminiscencia relativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Una comparación de los datos de salida del script R y BioDare2. El mismo conjunto de datos que se muestra en la Figura 3 fue analizado por el script R y por BioDare2 para los parámetros del reloj circadiano, la amplitud, el período y la fase. Los datos representan la media ± SEM (n = 12). Diferentes letras indican diferencia significativa entre las muestras (P < 0,05; ANOVA de una vía con prueba HSD de Tukey post hoc). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Análisis de la actividad del reloj circadiano con células de mamíferos. Los datos de series temporales generados con células de SG U2 que expresan el reportero Per2dLuc cultivado en una placa de 96 pocillos en DD se describieron previamente 25. Se utilizaron moléculas de ARNip dirigidas a CRY2, PSMD4 o PSMD7 para tratar las células. (A) Trazas de luminiscencia. (b) Amplitud, período y fase de Per2d:Luc. Los datos representan la media ± SEM (n = 3). Diferentes letras en el panel (B) indican una diferencia significativa entre el control negativo y una muestra tratada con ARNip (P<0.05; ANOVA de una vía con prueba HSD de Tukey post hoc). Abreviatura: RLU = unidad de luminiscencia relativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Análisis de ráfagas de ROS por R. Las plántulas se registraron para la unidad de luminiscencia relativa inmediatamente después de ser tratadas con 1 μM flg22 (izquierda) o 1 μM elf26 (derecha). (A) Trazas de luminiscencia promediadas de 12 plántulas por genotipo (n = 12) en un curso de tiempo posterior a la elicitación. Los valores medios por genotipo por tratamiento forman parte de la salida de R. (B) Recuentos de luminiscencia total promedio para cada genotipo con tratamiento flg22 o elf26. Los datos representan la media ± SEM (n = 12). Diferentes letras indican diferencia significativa entre las muestras (P < 0,05; ANOVA de una vía con prueba HSD de Tukey post hoc). Abreviatura: RLU = unidad de luminiscencia relativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Una lista de los documentos de salida del análisis de R. Se trata de una lista de los documentos de salida generados por el script LUC_2025.R (archivo complementario 1) y el archivo de entrada NO7.csv (archivo complementario 2).

Figura complementaria S1: Capturas de pantalla para la entrada I y la entrada II en la sección 1 del protocolo. La entrada del usuario I debe cambiarse para adaptar el análisis a un conjunto de datos específico en una computadora local. Los cambios en la entrada del usuario II son opcionales, dependiendo de la configuración experimental. Es importante tener en cuenta que el script Archivo complementario 1 (LUC_2025.R) espera que todos los pozos estén presentes en el archivo y no solo los pozos seleccionados o utilizados. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria S2: Estructura de árbol para los documentos de salida. Esta salida se generó mediante el script LUC_2025.R (archivo complementario 1) y el archivo de entrada NO7.csv (archivo complementario 2). El script LUC_2025.R genera una carpeta de salida basada en el nombre del archivo de entrada. Para obtener más detalles sobre los archivos de salida, consulte la Tabla 1. Los cuadros representan carpetas de archivos. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria S3: Capturas de pantalla para la entrada de usuario I y la entrada de usuario II en la sección 2 del protocolo. La secuencia de comandos del archivo complementario 3 (ROS_2025.R) utiliza el mismo formato de entrada general que la secuencia de comandos del archivo complementario 1 (LUC_2025.R). La entrada del usuario I debe cambiarse para adaptar el análisis a un conjunto de datos específico en una computadora local. Los cambios en la entrada del usuario II son opcionales, dependiendo de la configuración experimental. Es importante tener en cuenta que el script Archivo complementario 3 (ROS_2025.R) espera que todos los pozos estén presentes en el archivo y no solo los pozos seleccionados o utilizados. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Figura complementaria S4: Estructura de árbol para los documentos de salida. Esta salida se generó mediante el script ROS_2025.R (archivo complementario 3) y el archivo de entrada ROS_flg22.csv (archivo complementario 4). El script ROS_2025.R genera una carpeta de salida basada en el nombre del archivo de entrada. Dentro de esa carpeta hay un archivo para los recuentos totales de ROS y un archivo para gráficos. También hay subcarpetas para PRISM y datos gráficos, la prueba ANOVA y las pruebas t. Los cuadros representan carpetas de archivos. Haga clic aquí para descargar esta figura.

Tabla complementaria S1: Una lista de herramientas bioinformáticas disponibles para el análisis de datos circadianos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 1: LUC_2025.R. Este es el script R utilizado para analizar los datos del reloj circadiano. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: NO7.csv. Este es el archivo de entrada que contiene un ejemplo de datos de reloj circadiano. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 3: ROS_2025.R. Este es el script R utilizado para analizar los datos ROS. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 4: ROS_fig22.csv. Este es el archivo de entrada que contiene un ejemplo de datos ROS. ROS fue inducido por un tratamiento con flg22 de 1 μM. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 5: ROS_elf26.csv. Este es el archivo de entrada que contiene un ejemplo de datos ROS. Las ROS fueron inducidas por un tratamiento con 1 μM de elf26. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.