Evaluación del efecto de los factores SASP en la proliferación de células cancerosas mediante un análisis comparativo de tres metodologías distintas

Resumen

Este estudio evalúa los efectos proliferativos de los factores de fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP) de las células HeLa senescentes en células HeLa no senescentes utilizando tres modelos in vitro con monitoreo en tiempo real. Las ventajas y limitaciones de cada método se compararon sistemáticamente para comprender mejor las interacciones célula-célula en el cáncer.

Resumen

Las células cancerosas senescentes inducidas por la quimioterapia también secretan varios factores, llamados fenotipo secretor asociado a la senescencia, para regular su microambiente extracelular. Estudios anteriores han informado que estos factores SASP ejercen efectos paracrinos perjudiciales en las células circundantes, incluida la promoción de la proliferación, la transición epitelio-mesenquimal (EMT), la angiogénesis y la migración. Varias técnicas de cocultivo in vitro se utilizan ampliamente para comprender los procesos celulares resultantes de la interacción mediante el cultivo conjunto de los mismos y diferentes tipos de células. Aquí, se investigaron los posibles efectos proliferativos de los factores SASP secretados por las células HeLa senescentes en las células HeLa no senescentes utilizando tres enfoques complementarios in vitro . El primer enfoque implicó el cocultivo de células senescentes y no senescentes para investigar la señalización paracrina mediada por el SASP. En el segundo enfoque, los medios condicionados recolectados de células cancerosas senescentes se concentraron y posteriormente se utilizaron para examinar el impacto de los medios acondicionados con monitoreo en tiempo real de la proliferación. En el tercer método, las células senescentes y no senescentes se cultivaron una al lado de la otra para evaluar los efectos yuxtacrinas de SASP a través del contacto directo de célula a célula. Los tres modelos experimentales demostraron consistentemente que los factores SASP mejoraron significativamente la proliferación de células cancerosas no senescentes. En particular, el cocultivo de células senescentes aumentó la tasa de proliferación en un 64,6%, y los medios acondicionados con SASP concentrados 3 veces aumentaron la proliferación en más del 50% en comparación con los controles. Las imágenes basadas en fluorescencia mostraron un aumento del 49,3% en el número de células positivas para GFP en condiciones yuxtacrinas. Estos métodos permitieron colectivamente la evaluación cuantitativa y cualitativa de los cambios proliferativos inducidos por SASP. El análisis comparativo de estos enfoques destaca sus respectivas fortalezas y limitaciones, proporcionando información valiosa sobre los efectos paracrinos de las células senescentes.

Introducción

En los organismos multicelulares, las células se comunican a través de la señalización paracrina y yuxtacrina intercambiando mensajes con su microambiente, influyendo así en el comportamiento de las demás. Esta comunicación puede ocurrir directamente, a través de nanotubos de túnel y uniones gap, o indirectamente a través de la secreción de moléculas químicas solubles como citocinas, factores de crecimiento y quimiocinas en la matriz extracelular. Estos mecanismos de señalización desempeñan un papel esencial en la regulación de diversos procesos fisiológicos, incluido el desarrollo de tejidos y las respuestas de las células inmunitari....

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos de cultivo celular se llevaron a cabo en condiciones de nivel de bioseguridad II+ (BSL2+) dentro de un gabinete de seguridad certificado. La doxorrubicina es un agente quimioterapéutico peligroso. Todos los procedimientos deben realizarse en un gabinete certificado de bioseguridad de nivel II+ (BSL2+) utilizando el equipo de protección personal (EPP) adecuado, incluidas batas y guantes de laboratorio. Todos los desechos que contienen doxorrubicina, incluidos los medios y fijadores, deben recolectarse en contenedores de desechos peligrosos designados y claramente etiquetados y eliminarse a través del sist....

Resultados

Este conjunto representativo de experimentos investigó los efectos potenciales del fenotipo secretor asociado a la senescencia derivado de las células cancerosas senescentes en otras células cancerosas. Por lo tanto, primero se confirmó si el tratamiento con doxorrubicina durante 72 h podría inducir senescencia en células HeLa mediante tinción SA-β-Gal. En las células senescentes, la enzima lisosomal β-galactosidasa permanece activa incluso a pH bajo y escinde el sustrato cromogénico X-gal, formando un precipitado azul

Discusión

Las interacciones dinámicas de las células cancerosas en su microambiente son cruciales para la progresión tumoral, lo que influye en la inducción de metástasis y el desarrollo de un tumor secundario. También se informa que el cáncer senescente y las células estromales regulan los microambientes tumorales a través de los factores secretados por las células senescentes⁴. Estos factores estimulan la proliferación, migración, invasión, diferenciación celular y aument.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
µ-Slide 8 Pozo alto	bidi	80806
0,05 % Tripsina-EDTA (1X)	Gibco	25300-054
Unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra (Ultracel-3K)	Millipore	UFC200324
Incubadora CO2 (37° C, 5% CO2)	Sanyo
CO2-Controller 2000	Pecon
DMEM	Gibco	41966-029
Doxorrubicina	Tocris	2252
Placa E INSERT 16	ACEA Biosciences/Agilent	6 465 382 001
E-plate VIEW 16	ACEA Biosciences/Agilent	300 601 140
FBS	Gibco	A5256701
Células HeLa	AP Institute, Ankara, Turquía	HÜ KÜ K No: 90061901
Microscopio de fluorescencia invertida Leica DMi8	Leica
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Gibco	70011-044
Kit de tinción de β-galactosidasa (SA-β-gal) asociada a senescencia, kit	Señalización celular	AÑOS 9860
Sistema de incubación en la parte superior de la etapa	Pecon
Controlador de temperatura 2002-2	Pecon
Tinte azul de tripán	Sigma	T8154
xCELLigence RTCA DP system	ACEA Biosciences/Agilent