Artículo de método

Evaluación del efecto de los factores SASP en la proliferación de células cancerosas mediante un análisis comparativo de tres metodologías distintas

DOI:

10.3791/68883

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19 de septiembre de 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Gazi University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio evalúa los efectos proliferativos de los factores de fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP) de las células HeLa senescentes en células HeLa no senescentes utilizando tres modelos in vitro con monitoreo en tiempo real. Las ventajas y limitaciones de cada método se compararon sistemáticamente para comprender mejor las interacciones célula-célula en el cáncer.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células cancerosas senescentes inducidas por la quimioterapia también secretan varios factores, llamados fenotipo secretor asociado a la senescencia, para regular su microambiente extracelular. Estudios anteriores han informado que estos factores SASP ejercen efectos paracrinos perjudiciales en las células circundantes, incluida la promoción de la proliferación, la transición epitelio-mesenquimal (EMT), la angiogénesis y la migración. Varias técnicas de cocultivo in vitro se utilizan ampliamente para comprender los procesos celulares resultantes de la interacción mediante el cultivo conjunto de los mismos y diferentes tipos de células. Aquí, se investigaron los posibles efectos proliferativos de los factores SASP secretados por las células HeLa senescentes en las células HeLa no senescentes utilizando tres enfoques complementarios in vitro . El primer enfoque implicó el cocultivo de células senescentes y no senescentes para investigar la señalización paracrina mediada por el SASP. En el segundo enfoque, los medios condicionados recolectados de células cancerosas senescentes se concentraron y posteriormente se utilizaron para examinar el impacto de los medios acondicionados con monitoreo en tiempo real de la proliferación. En el tercer método, las células senescentes y no senescentes se cultivaron una al lado de la otra para evaluar los efectos yuxtacrinas de SASP a través del contacto directo de célula a célula. Los tres modelos experimentales demostraron consistentemente que los factores SASP mejoraron significativamente la proliferación de células cancerosas no senescentes. En particular, el cocultivo de células senescentes aumentó la tasa de proliferación en un 64,6%, y los medios acondicionados con SASP concentrados 3 veces aumentaron la proliferación en más del 50% en comparación con los controles. Las imágenes basadas en fluorescencia mostraron un aumento del 49,3% en el número de células positivas para GFP en condiciones yuxtacrinas. Estos métodos permitieron colectivamente la evaluación cuantitativa y cualitativa de los cambios proliferativos inducidos por SASP. El análisis comparativo de estos enfoques destaca sus respectivas fortalezas y limitaciones, proporcionando información valiosa sobre los efectos paracrinos de las células senescentes.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En los organismos multicelulares, las células se comunican a través de la señalización paracrina y yuxtacrina intercambiando mensajes con su microambiente, influyendo así en el comportamiento de las demás. Esta comunicación puede ocurrir directamente, a través de nanotubos de túnel y uniones gap, o indirectamente a través de la secreción de moléculas químicas solubles como citocinas, factores de crecimiento y quimiocinas en la matriz extracelular. Estos mecanismos de señalización desempeñan un papel esencial en la regulación de diversos procesos fisiológicos, incluido el desarrollo de tejidos y las respuestas de las células inmunitarias, y también están implicados en la patogénesis de numerosas enfermedades, como el cáncer, el VIH, la hipertensión y elAlzheimer.

En la década de 1960, Leonard Hayflick descubrió que los fibroblastos humanos normales tienen una capacidad limitada para replicarse in vitro2. Este estado de proliferación celular limitada que se desarrolla debido al acortamiento de la telomerasa se denomina senescencia replicativa. Estudios posteriores revelaron que varias formas de estrés celular también pueden desencadenar la senescencia celular. Se ha determinado que los tratamientos comunes contra el cáncer, como la quimioterapia y la radioterapia, también inducen senescencia celular tanto en el cáncer como en las células del estroma, llamada senescencia inducida por la terapia 3,4. La senescencia celular y el envejecimiento son procesos relacionados jerárquicamente; representan procesos biológicos distintos. La acumulación de células senescentes en el organismo contribuye al envejecimiento al promover la inflamación, la disfunción tisular y el desarrollo de enfermedades relacionadas con la edad. Sin embargo, el envejecimiento abarca una gama mucho más amplia de eventos y mecanismos sistémicos en comparación con la senescencia5.

Las células senescentes se caracterizan por que su citoplasma expandido es significativamente más grande y tiene una morfología aplanada en comparación con las células normales6. Estas células senescentes tienen una mayor actividad lisosomal y son positivas para la actividad de la β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal), una enzima lisosomal que permanece activa incluso a pH ácido de 6,0. La tinción SA-β-gal es el biomarcador más utilizado para detectar células senescentes7. El agrandamiento y la morfología irregular de los núcleos se observan comúnmente en las células que experimentan senescencia. Además, estas células se caracterizan por reordenamientos únicos de la cromatina llamados focos heterocromáticos asociados a la senescencia (SAHF) que median la detención irreversible del ciclo celular 8,9.

Aunque las células cancerosas senescentes finalmente perdieron su capacidad de proliferar, permanecieron viables y metabólicamente activas. Se sabe que las células senescentes también secretan diversos factores para regular su microambiente tumoral extracelular, llamado fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP)10,11. Estos factores SASP incluyen factores de señalización solubles (interleucinas, quimiocinas y factores de crecimiento), proteasas secretadas y proteínas insolubles secretadas / componentes de la matriz extracelular (MEC). En conjunto, estos factores ejercen efectos paracrinos perjudiciales, incluida la promoción de la proliferación, migración, invasión de células cancerosas y la inducción de la transición epitelial a mesenquimal (EMT)4,12. Además, los efectos adversos inducidos por la quimioterapia se han atribuido parcialmente a la acumulación de células senescentes13. Por lo tanto, investigar la interacción entre células senescentes y no senescentes se ha convertido en un área importante de investigación en el contexto de la terapia contra el cáncer. Especialmente el análisis de los factores SASP, en particular sus composiciones y los efectos sobre el microambiente del cáncer, se considera una estrategia prometedora para identificar nuevas moléculas diana para la terapia del cáncer y descubrir nuevos fármacos para estas moléculas.

Las técnicas de cocultivo in vitro se han utilizado durante mucho tiempo para estudiar la comprensión de las interacciones de célula a célula14. En este artículo metodológico, el objetivo fue evaluar la posible actividad proliferativa de los factores secretados por las células senescentes en células cancerosas no senescentes utilizando tres métodos diferentes. Además, se compararon los resultados obtenidos de los tres métodos diferentes y se evaluaron críticamente las ventajas y desventajas respectivas de cada enfoque.

En primer lugar, se estableció un modelo de cocultivo entre células HeLa senescentes y HeLa no senescentes para monitorizar los posibles cambios en la proliferación de células cancerosas en tiempo real utilizando el sistema de análisis celular en tiempo real12. Este sistema consta de dos placas para evaluar las interacciones célula-célula. La vista de la placa e, que forma la capa inferior, tiene una superficie donde se siembran las células objetivo, con microelectrodos colocados en la parte inferior de la placa. La resistencia eléctrica creada por la adhesión de las células diana a esta superficie se expresa mediante el parámetro medible Cell Index (CI). El valor de CI es proporcional al número de células y al grado de adhesión a la superficie15. Además, la vista de placa electrónica permite el examen morfológico de las células bajo un microscopio de contraste de fase. El inserto de la placa e, que forma la capa superior, es el área donde se siembran las células efectoras. La parte inferior de esta placa está cubierta con una membrana semipermeable de tamaño de poro de 0,4 μm. Los factores secretados por las células efectoras pueden atravesar la membrana y afectar a las células diana en la vista de la placa electrónica. Si esta interacción estimula la proliferación celular, esto se observa como un aumento en el valor de IC. Por lo tanto, las interacciones entre células se pueden evaluar cuantitativamente.

En el segundo método, los medios acondicionados recolectados de células HeLa senescentes se concentraron y se agregaron a células HeLa no senescentes. El efecto proliferativo potencial en estas células se monitoreó utilizando el sistema de análisis celular en tiempo real.

En el tercer método, se planificó co-cultivar las células HeLa senescentes y las células GFP-HeLa no senescentes directamente en 2D y monitorear las posibles alteraciones proliferativas en las células cancerosas en tiempo real bajo un microscopio.

El objetivo de este experimento es establecer tres modelos para estudiar la interacción entre las células HeLa senescentes y las células HeLa no senescentes y monitorear posibles cambios en la proliferación de células cancerosas en tiempo real. Por lo tanto, se puede investigar fácilmente el efecto de los factores SASP secretados por las células cancerosas senescentes sobre las otras células cancerosas. En consecuencia, se evaluaron sistemáticamente las ventajas y limitaciones de los tres enfoques.

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Protocolo

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NOTA: Todos los procedimientos de cultivo celular se llevaron a cabo en condiciones de nivel de bioseguridad II+ (BSL2+) dentro de un gabinete de seguridad certificado. La doxorrubicina es un agente quimioterapéutico peligroso. Todos los procedimientos deben realizarse en un gabinete certificado de bioseguridad de nivel II+ (BSL2+) utilizando el equipo de protección personal (EPP) adecuado, incluidas batas y guantes de laboratorio. Todos los desechos que contienen doxorrubicina, incluidos los medios y fijadores, deben recolectarse en contenedores de desechos peligrosos designados y claramente etiquetados y eliminarse a través del sistema institucional de manejo de desechos peligrosos.

1. Modelo 1: Co-cultivo utilizando el sistema de análisis celular en tiempo real

  1. Cultivo de células e inducción de senescencia (Día 1-2)
    1. Siembre 8 x 10 5células HeLa en un matraz de cultivo T25 que contenga 5 ml de medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (0,1 μg/ml) e incube las células a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2.
    2. Al día siguiente, reemplace el medio de las células con 5 ml de medio completo fresco. Trate las células con doxorrubicina de 300 nM directamente agregándolas al medio para inducir la senescencia celular. Mantener el matraz T25 en una incubadora con 5% deCO2 a 37 °C durante 72 h.
  2. Siembra de células no senescentes (Día 4)
    1. Siembra 8 x 105 células HeLa no tratadas (control no senescente) en un nuevo matraz T25 en 5 mL de DMEM suplementado con suero fetal bovino al 10%, penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (0,1 μg/mL) y mantenlo en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2.
  3. Confirmación de la inducción de la senescencia (Día 5)
    1. Para determinar si 72 h de tratamiento con doxorrubicina indujeron senescencia, realice la tinción SA-β-gal6. Realice este ensayo en un conjunto separado de células que no se utilizan en los experimentos principales. Para conocer los resultados obtenidos, ver Figura 1A,B.
    2. Medir la IL-6 en los medios acondicionados de las células HeLa de cáncer senescente para evaluar su actividad secretora. Tratar las células con doxorrubicina durante 72 h, seguido de incubación en medio sin suero y sin rojo de fenol durante 2 días más. Normalice los medios condicionados recolectados al número de células y mida los niveles de IL-6.
      NOTA: La IL-6 es una citocina distintiva de SASP12. Los resultados de la medición de IL-6 se presentan en la Figura 1C.
  4. Configuración del sistema de análisis de células en tiempo real (día 5)
    1. Encienda el sistema de análisis celular en tiempo real antes de la siembra celular. Inicie el software RTCA 2.0. Haga clic en el botón Exp Notes (Figura 2) e ingrese los detalles experimentales.
    2. Haga clic en el botón Programar y agregue dos pasos. El primer paso es para el fondo. El segundo paso es monitorear la proliferación celular cada 15 minutos durante 72 h.
    3. Elija el primer paso y haga clic en Reproducir para registrar la impedancia de fondo agregando 50 μL de medio completo a cada pocillo de la vista de la placa electrónica.
  5. Sembrando celdas en la vista de placa electrónica (Día 5)
    1. Revise las células HeLa tratadas con doxorrubicina (senescentes) y no tratadas (no senescentes) bajo un microscopio de contraste de fase con un aumento de 10x antes de sembrar las células. Bajo el microscopio, las células senescentes tienen una morfología mucho más agrandada que las células normales.
    2. Lave las células HeLa senescentes y no senescentes con 5 ml de PBS precalentado estéril y luego aspire.
    3. Añadir 1 ml de tripsina al 0,05% precalentada y mantener los matraces a 37 °C durante 2 min para separar las células. Neutralice la tripsina con 5 ml de DMEM completo suplementado con suero fetal bovino al 10%, penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (0,1 μg/ml).
    4. Centrifugar las células a 500 x g a temperatura ambiente durante 10 min, desechar el sobrenadante y volver a suspender los gránulos celulares en 5 ml de DMEM completo suplementado con suero fetal bovino al 10%, penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (0,1 μg/ml).
    5. Cuente las células viables utilizando el método de exclusión del colorante azul de tripano con un hemocitómetro.
    6. Siembre células HeLa no senescentes a una densidad de 5 x 103 células/pocillo en cada pocillo de una vista de placa electrónica en 100 μL completos de DMEM suplementados con suero bovino fetal al 10%, penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (0,1 μg/mL).
    7. Coloque la vista de la placa electrónica en la base del sistema de análisis celular en tiempo real para permitir que las células se adhieran a la superficie de la placa en la incubadora.
    8. Elija el segundo paso en el botón de programación y haga clic en el botón Reproducir para iniciar la medición de impedancia utilizando el software RTCA 2.0 durante 72 h (Figura 2).
  6. Siembra de células en el inserto de la placa electrónica
    1. Las células semilla en una placa electrónica insertan pocillos en 60 μL de DMEM completo suplementado con suero bovino fetal al 10%, penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (0,1 μg/mL).
    2. Células semilla en el inserto de la placa electrónica en tres configuraciones experimentales diferentes: Grupo 1 (control negativo): Sin células sembradas (solo medios)
      Grupo 2: 2 × 104 células HeLa no senescentes
      Grupo 3: 1 × 10 5células HeLa senescentes
    3. Mantenga el inserto de la placa electrónica a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2 durante 6 h para su fijación.
  7. Células de cocultivo
    1. Haga clic en Pausa después de 6 h de siembra de celdas. Aspire suavemente el medio de cultivo de cada pocillo de la vista de la placa electrónica para eliminar el suero y las células no adherentes.
    2. Lave los pocillos 2 veces con PBS precalentado a 37 °C.Agregue 140 μL de DMEM sin suero a cada pocillo de la vista de la placa electrónica.
    3. Tome el inserto de la placa electrónica y aspire el medio de cultivo. Lave los pocillos suavemente con PBS a 37 °C 2x y agregue 60 μL de DMEM sin suero.
    4. Coloque el inserto de la placa electrónica en la vista de la placa electrónica y presione suavemente hacia abajo hasta que el inserto esté completamente asentado en el pocillo.
    5. Inserte la placa combinada en el sistema de análisis de celdas en tiempo real y haga clic en Reproducir para reanudar el monitoreo en tiempo real de los valores del índice de celdas a intervalos de 15 minutos utilizando el software (Figura 2).
    6. Apague el sistema de análisis celular en tiempo real cuando termine el tiempo del experimento (Figura 3A).
  8. Imágenes de células en inserto de placa electrónica
    NOTA: Dado que hay una membrana en el pozo de inserción de la placa electrónica, las células sembradas aquí no se pueden visualizar en la membrana mediante microscopía de contraste de fase. Por lo tanto, para probar si las células mantuvieron la viabilidad hasta el final del experimento y si las células senescentes conservaron su integridad estructural, se tiñeron con DAPI (Figura 3B).
    1. Retire el inserto de la placa electrónica de la vista de la placa electrónica. Tiña las células en el inserto de la placa e con DAPI y verifica la presencia de células bajo un microscopio fluorescente16. Se sabe que los núcleos de las células senescentes son más grandes que los de las células normales. Por lo tanto, en función de los tamaños nucleares de las células teñidas con DAPI, determine qué pocillo se sembró con células no senescentes y cuál con células senescentes.
  9. Imágenes de células en la vista de placa electrónica
    1. Examine directamente la vista de la placa electrónica bajo un microscopio de contraste de fase con un aumento de 10x (Figura 3B). Dado que se eliminaron cuatro filas de sensores de microelectrodos del centro de cada pocillo en la vista de placa electrónica, se creó el espacio 6 para permitir el monitoreo celular mediante microscopía.
  10. Análisis de datos
    1. Normalice los valores de CI en el momento en que la vista de la placa electrónica y el inserto de la placa electrónica se combinan e insertan en el sistema de análisis de celdas en tiempo real.
    2. Haga clic en el botón Análisis de datos para calcular la tasa y la cantidad de proliferación utilizando los datos máximos de índice y pendiente de celda obtenidos del sistema de análisis de celdas en tiempo real (Figura 2). Luego, analice los datos utilizando un programa estadístico apropiado (Figura 3C, D).

2. Modelo 2: Ensayo de tratamiento de medios condicionados utilizando el sistema de análisis celular en tiempo real

  1. Cultivo de células e inducción de senescencia (Día 1-2)
    1. Siembre 35 x 10 4células HeLa en cada pocillo de placa de 6 pocillos que contenga 2,5 ml de medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (0,1 μg/ml) e incube las células a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2.
    2. Al día siguiente, reemplace el medio de las células con 2,5 ml de medio completo fresco. Trate las células con doxorrubicina de 300 nM directamente agregándola al medio para inducir la senescencia celular. Mantenga la placa de 6 pocillos en una incubadora con 5% deCO2 a 37 °C durante 72 h.
  2. Siembra de células no senescentes (Día 4)
    1. Siembre 35 x 104 células HeLa sin tratar (control no senescente) en cada pocillo de una nueva placa de 6 pocillos en 2,5 ml de DMEM suplementada con suero bovino fetal al 10%, penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (0,1 μg/ml) y manténgalas en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2.
  3. Llevar a cabo la confirmación de la inducción de la senescencia como se describe en el paso 1.3.
  4. Preparación de medio acondicionado a partir de células HeLa senescentes y no senescentes
    1. Revise tanto las células tratadas con doxorrubicina (células senescentes) como las células HeLa no tratadas (células no senescentes) bajo un microscopio de contraste de fase. Bajo el microscopio, las células senescentes tienen una morfología mucho más agrandada que las células normales.
    2. Aspire el medio de cultivo de dos placas de 6 pocillos (células HeLa senescentes y no senescentes). Lave las células 2 veces con PBS precalentado a 37 °C para eliminar el suero residual y los restos celulares.
    3. Agregue 2 ml de DMEM sin suero suplementado con penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (0,1 μg/ml) a cada pocillo. Incubar las células en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% deCO2 durante 48 h.
  5. Recolección y concentración de medios acondicionados (Día 7)
    1. Recoja los medios acondicionados de cada pocillo en tubos estériles en una cabina de seguridad laminar.
    2. Tripsinizar las células y contarlas utilizando el método de exclusión de colorante azul de tripano utilizando un hemocitómetro para normalizar los medios condicionados a números celulares.
    3. Ajuste los medios acondicionados, normalizados según el número de células, a un volumen final de 2 ml con DMEM sin suero suplementado con penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (0,1 μg/ml) en tubos estériles de 2 ml.
    4. Centrifugar el medio acondicionado recogido a 1.000 x g durante 10 min a 4 °C para eliminar los restos celulares, seguido de centrifugación a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C para obtener el sobrenadante clarificado.
    5. Centrifugar el medio acondicionado utilizando unidades de filtro ultracentrífugo de 2 ml a 4 °C durante 60 min a 3.000 x g para concentrarlo. Este procedimiento concentra los 2 ml de medios acondicionados a 5 veces los 400 μl concentrados de medios acondicionados.
    6. Diluir los 40 μL obtenidos de medios acondicionados con medio fresco sin suero para preparar medios acondicionados concentrados 1x, 2x y 3x en tubos estériles en una cabina de seguridad laminar.
      NOTA: Dado que el medio que queda en las células durante 48 h se agota debido al consumo celular, los medios acondicionados recolectados y concentrados se diluyen posteriormente con medio nuevo.
  6. Sembrar celdas a la vista de placa electrónica
    1. Configure el sistema de análisis celular en tiempo real como se describe en los pasos 1.1-1.4.Lave las células HeLa no senescentes con PBS precalentado y luego aspire.
    2. Añadir 1 ml de tripsina al 0,05% precalentada y mantener los matraces a 37 °C durante 2 min para separar las células. Neutralice la tripsina con 5 ml de DMEM completo suplementado con suero fetal bovino al 10%, penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (0,1 μg/ml).
    3. Centrifugar las células a 500 x g a temperatura ambiente durante 10 min, desechar el sobrenadante y volver a suspender los gránulos celulares en 5 ml de DMEM completo suplementado con suero fetal bovino al 10%, penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (0,1 μg/ml).
    4. Cuente las células viables utilizando el método de exclusión del colorante azul de tripano con un hemocitómetro.
    5. Siembre células HeLa no senescentes a una densidad de 5 x 103 células/pocillo en cada pocillo de una vista de placa electrónica en 200 μL de DMEM completo suplementado con suero bovino fetal al 10%, penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (0,1 μg/mL).
    6. Coloque la vista de la placa electrónica en la base del sistema de análisis celular en tiempo real para permitir que las células se adhieran a la superficie de la placa en la incubadora.
    7. Elija el segundo paso en el botón de programación y haga clic en el botón Reproducir para iniciar la medición de impedancia utilizando el software RTCA 2.0 (Figura 2). Haga clic en el botón Pausa en el software después de 6 h de enchapado de células HeLa no senescentes (Figura 2).
    8. Aspire suavemente el medio de cultivo de cada pocillo de la vista de la placa electrónica para eliminar el suero y las células no adherentes. Lave los pocillos 2 veces con PBS precalentado a 37 °C.
    9. Añadir los medios acondicionados precalentados a 37 °C en los grupos apropiados:
      Grupo 1: Medios frescos
      Grupo 2: 1x medio acondicionado con células HeLa no senescentes
      Grupo 3: 2 medios acondicionados con células HeLa no senescentes
      Grupo 4: 3 medios acondicionados con células HeLa no senescentes
      Grupo 5: 1x medio senescente condicionado con células HeLa
      Grupo 6: 2x medios acondicionados con células HeLa senescentes
      Grupo 7: 3x medios acondicionados con células HeLa senescentes
    10. Inserte la vista de la placa electrónica en el sistema de análisis de celdas en tiempo real y haga clic en Reproducir para reanudar el monitoreo en tiempo real de los valores del índice de celdas a intervalos de 15 minutos durante 48 h (Figura 2).
    11. Apague el sistema de análisis celular en tiempo real cuando termine el tiempo del experimento (Figura 4A).
  7. Imágenes de células en la vista de placa electrónica
    1. Examine directamente la vista de la placa electrónica bajo un microscopio de contraste de fase con un aumento de 10x (Figura 4B). Dado que se retiraron cuatro filas de sensores de microelectrodos del centro de cada pocillo en la vista de placa electrónica, se creó espacio para permitir el monitoreo celular mediante microsopía.
  8. Análisis de datos
    1. Normalizar los valores de IC en el momento en que se administraron los medios condicionados concentrados a las células HeLa no senescentes.
    2. Haga clic en el botón Análisis de datos para calcular la tasa y cantidad de proliferación utilizando los datos máximos de índice y pendiente de células obtenidos del sistema de análisis celular en tiempo real (Figura 2). Luego, analice los datos utilizando un programa estadístico apropiado (Figura 4C, D).

3. Modelo 3: Monitoreo en tiempo real de la interacción célula-célula

  1. Cultivo de células e inducción de senescencia (Día 1-2)
    1. Siembre 8 x 10 5células HeLa en un matraz de cultivo T25 que contenga 5 ml de medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (0,1 μg/ml) e incube las células a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2.
    2. Al día siguiente, reemplace el medio de las células con 5 ml de medio completo fresco. Trate las células con doxorrubicina de 300 nM directamente agregándolas al medio para inducir la senescencia celular. Mantener el matraz T25 en una incubadora con 5% deCO2 a 37 °C durante 72 h.
  2. Siembra de células no senescentes (Día 4)
    1. Sembrar 8 x 105 células GFP-HeLa (control no senescente) en un nuevo matraz T25 en 5 mL de DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10%, penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (0,1 μg/mL) y mantener en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2.
    2. Siembra 8 x 105 células HeLa (control no senescente) en un nuevo matraz T25 en 5 mL de DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10%, penicilina (100 U/mL) y estreptomicina (0,1 μg/mL) y mantener en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2.
  3. Llevar a cabo la confirmación de la inducción de la senescencia como se describe en el paso 1.3 (día 5).
  4. Células de cocultivo
    1. Revise las células tratadas con doxorrubicina, las células GFP-HeLa no tratadas y las células HeLa no tratadas bajo un microscopio de contraste de fase antes de sembrar las células. Bajo el microscopio, las células senescentes tienen una morfología mucho más agrandada que las células normales.
    2. Lave los tres matraces T25 con 5 ml de PBS precalentado estéril y luego aspire. Añadir 1 ml de tripsina al 0,05% precalentada y mantener los matraces a 37 °C durante 2 min para separar las células.
    3. Neutralice la tripsina con 5 ml de DMEM completo suplementado con suero fetal bovino al 10%, penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (0,1 μg/ml).
    4. Centrifugar las células a 500 x g a temperatura ambiente durante 10 min, desechar el sobrenadante y volver a suspender los gránulos celulares en 5 ml de DMEM completo suplementado con suero fetal bovino al 10%, penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (0,1 μg/ml).
    5. Cuente las células viables utilizando el método de exclusión del colorante azul de tripano con un hemocitómetro. Células semilla en 200 μL de DMEM completo suplementado con suero bovino fetal al 10%, penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (0,1 μg/mL).
    6. Células semilla en μ portaobjetos de 8 pocillos de altura en tres configuraciones experimentales diferentes:
      Grupo 1: 7 x 103 células GFP-HeLa
      Grupo 2: 18 x 103 células HeLa no senescentes + 7 x 103 células GFP-HeLa
      Grupo 3: 18 x 103 células HeLa senescentes + 7 x 103 células GFP-HeLa
    7. Mantenga el portaobjetos μ durante 8 h para su fijación a 37 °C en una incubadora con un 5% de CO2. Después de 8 h, lave las células con PBS precalentado (37 °C) 2 veces para eliminar el efecto del suero sobre las células.
    8. Agregue 200 μL de DMEM sin suero que contenga penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (0,1 μg/ml) a cada pocillo.
  5. Configuración del microscopio
    1. Encienda el controlador de temperatura y el controlador de CO2 y deje que el sistema de incubación de la platina se estabilice durante 30 minutos.
    2. Compruebe manualmente la concentración deCO2 y los ajustes de temperatura y asegúrese de que se alcanzan las condiciones fisiológicas (5% de CO2, 37 °C).
    3. Encienda el microscopio de fluorescencia invertida y permita que el sistema complete la autocalibración. Encienda la fuente de luz de fluorescencia. Inicie el software de imágenes y análisis para controlar los parámetros de imágenes y la adquisición de imágenes.
  6. Imágenes de lapso de tiempo
    1. Coloque el portaobjetos en la cámara de incubación de la microscopía de fluorescencia invertida con una cámara digital de alta resolución. Abra el software y seleccione los modos X, Y, Z y T de la Parte, y realice experimentos en configuraciones de adquisición (Figura 5A).
    2. Seleccione un objetivo de 20x con alto contraste para imágenes de fluorescencia y contraste de fase (Figura 5A). Agregue los canales de contraste de fase y fluorescencia (filtro FITC) para permitir la obtención de imágenes en ambos modos (Figura 5A).
    3. Haga clic en el botón Live para iniciar la obtención de imágenes de células vivas y, a continuación, enfoque las células bajo contraste de fase (Figura 5A). Abra la ventana de la pila z y marque la posición de las celdas de interés (que contienen células HeLa senescentes/no senescentes y células HeLa GFP). Navegue por la etapa entre pocillos utilizando el controlador automático de etapas, lo que permite la ubicación precisa de las áreas seleccionadas para el marcado de posición (Figura 5A).
      NOTA: De esta manera, se puede seleccionar más de un área en el mismo pocillo de una diapositiva.
    4. Cambie el canal al canal de fluorescencia para comenzar la obtención de imágenes de fluorescencia. Establezca los ajustes adecuados de exposición (89,506 ms), ganancia (10) e intensidad (136) (Figura 5A).
      NOTA: Estos parámetros varían según la intensidad de fluorescencia de las células que expresan la proteína fluorescente.
    5. Seleccione un intervalo de pila z de μm, establezca las posiciones superior e inferior y configure la pila z bajo contraste de fase (Figura 5A). Haga clic en Detener para cerrar la opción En vivo.
    6. Establezca la duración (48 h) y el intervalo de tiempo (30 min) utilizando los campos Duración e Intervalo de tiempo para la obtención de imágenes de lapso de tiempo.
    7. Haga clic en Iniciar para comenzar a obtener imágenes durante 48 h (Figura 5A). Guarde el proyecto después de 48 h (Figura 5A).
    8. En cada punto de tiempo (0 h y 48 h), seleccione el mejor fotograma de la pila z y exporte la imagen (Figura 5A).
    9. Cuente las células positivas para GFP a las 0 h y 48 h, calcule el aumento porcentual de las células positivas para GFP y analice los datos utilizando un programa de software apropiado (Figura 1D, E).
  7. Generación de películas
    1. Haga clic en Mostrar galería para mostrar todas las imágenes capturadas organizadas por puntos de tiempo y capas de pila z (Figura 5B).
    2. Para cada punto de tiempo, haga clic con el botón derecho en la imagen mejor enfocada de la pila z correspondiente y seleccione Seleccionar miniaturas en una fila. Guarde los fotogramas seleccionados (Figura 5B).
    3. Repita este proceso individualmente para cada posición. Para ayudar a seleccionar las imágenes más enfocadas, utilice la función Buscar los mejores fotogramas enfocados. Guarde las imágenes seleccionadas a través de la opción Guardar fotogramas seleccionados. Las imágenes guardadas se cargan automáticamente en la sección Abrir proyecto.
    4. Haga clic con el botón derecho en la película y seleccione Exportar imagen una vez que las secuencias de imágenes estén completamente cargadas.
    5. Vaya a la pestaña Película en la ventana de exportación, establezca la velocidad de fotogramas deseada (fotogramas por segundo), seleccione opciones adicionales como barra de escala, marca de tiempo, etc., si es necesario, y finalice la exportación eligiendo un destino usando la opción Examinar (Figura 5B, Video 1, Video 2 y Video 3).

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Resultados

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Este conjunto representativo de experimentos investigó los efectos potenciales del fenotipo secretor asociado a la senescencia derivado de las células cancerosas senescentes en otras células cancerosas. Por lo tanto, primero se confirmó si el tratamiento con doxorrubicina durante 72 h podría inducir senescencia en células HeLa mediante tinción SA-β-Gal. En las células senescentes, la enzima lisosomal β-galactosidasa permanece activa incluso a pH bajo y escinde el sustrato cromogénico X-gal, formando un precipitado azul

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Discusión

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Las interacciones dinámicas de las células cancerosas en su microambiente son cruciales para la progresión tumoral, lo que influye en la inducción de metástasis y el desarrollo de un tumor secundario. También se informa que el cáncer senescente y las células estromales regulan los microambientes tumorales a través de los factores secretados por las células senescentes4. Estos factores estimulan la proliferación, migración, invasión, diferenciación celular y aument...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este estudio fue apoyado por la Unidad de Proyectos Científicos de la Universidad de Gazi (código de subvención: TOA-2021-7321) y TUBITAK (código de subvención: 122S564 y 223S969).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
µ-Slide 8 Pozo altofigure-materials-1bidi80806
0,05 % Tripsina-EDTA (1X)Gibco25300-054
Unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra (Ultracel-3K)MilliporeUFC200324
Incubadora CO2 (37° C, 5% CO2)Sanyo
CO2-Controller 2000 Pecon 
DMEMGibco41966-029
DoxorrubicinaTocris2252
Placa E INSERT 16 ACEA Biosciences/Agilent6 465 382 001
E-plate VIEW 16 ACEA Biosciences/Agilent300 601 140
FBSGibcoA5256701
Células HeLafigure-materials-2AP Institute, Ankara, TurquíaHÜ KÜ K No: 90061901 
Microscopio de fluorescencia invertida Leica DMi8  Leica
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Gibco70011-044
Kit de tinción de β-galactosidasa (SA-β-gal) asociada a senescencia, kit  Señalización celularAÑOS 9860
Sistema de incubación en la parte superior de la etapaPecon 
Controlador de temperatura 2002-2 Pecon 
Tinte azul de tripánSigmaT8154
xCELLigence RTCA DP system ACEA Biosciences/Agilent

Referencias

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  1. Su, J., et al. Cell-cell communication: new insights and clinical implications. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 196(2024).
  2. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp Cell Res. 25, 585-621 (1961).
  3. Ewald, J. A., Desotelle, J. A., Wilding, G., Jarrard, D. F. Therapy-induced senescence in cancer. J Natl Cancer Inst. 102 (20), 1536-1546 (2010).
  4. Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent Cells in Cancer Therapy: Friends or Foes. Trends Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).
  5. Wang, J., et al. The Common Hallmarks and Interconnected Pathways of Aging, Circadian Rhythms, and Cancer: Implications for Therapeutic Strategies. Research (Wash D C). 8, 0612(2025).
  6. Simay, Y. D., Ozdemir, A., Ibisoglu, B., Ark, M. The connection between the cardiac glycoside-induced senescent cell morphology and Rho/Rho kinase pathway. Cytoskeleton (Hoboken). 75 (11), 461-471 (2018).
  7. Ozdemir, A., Simay Demir, Y. D., Yesilyurt, Z. E., Ark, M. Senescent cells and SASP in cancer microenvironment: New approaches in cancer therapy. Adv Protein Chem Struct Biol. 133, 115-158 (2023).
  8. Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
  9. Heckenbach, I., et al. Nuclear morphology is a deep learning biomarker of cellular senescence. Nat Aging. 2 (8), 742-755 (2022).
  10. Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
  11. Kuilman, T., Peeper, D. S. Senescence-messaging secretome: SMS-ing cellular stress. Nat Rev Cancer. 9 (2), 81-94 (2009).
  12. Simay Demir, Y. D., Ozdemir, A., Sucularli, C., Benhur, E., Ark, M. The implication of ROCK 2 as a potential senotherapeutic target via the suppression of the harmful effects of the SASP: Do senescent cancer cells really engulf the other cells. Cell Signal. 84, 110007(2021).
  13. Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discov. 7 (2), 165-176 (2017).
  14. Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Multifunction co-culture model for evaluating cell-cell interactions. Methods Mol Biol. 1202, 29-36 (2014).
  15. Ozdemir, A., et al. Cardiac glycoside-induced cell death and Rho/Rho kinase pathway: Implication of different regulation in cancer cell lines. Steroids. 109, 29-43 (2016).
  16. zdemir, A., Ibisoglu, B., Simay, Y. D., Polat, B., Ark, M. Ouabain induces Rho-dependent rock activation and membrane blebbing in cultured endothelial cells. Mol Biol. 49 (1), 138-143 (2015).
  17. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  18. Simay Demir, Y. D., et al. Antimigratory effect of pyrazole derivatives through the induction of STAT1 phosphorylation in A549 cancer cells. J Pharm Pharmacol. 73 (6), 808-815 (2021).
  19. Ariffin, N. S. The CellProfiler pipeline analysis of cell migration. Acta Histochem. 125 (7), 152074(2023).
  20. Li, D., et al. Decoding the crossroads of aging and cancer through single-cell analysis: Implications for precision oncology. Int J Cancer. 157 (5), 807-818 (2025).

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