Presentación de la modificación de la fosforilación mediante electroforesis en gel Phos-tag SDS-PAGE y ensayo de quinasa in vitro

Resumen

Este protocolo describe procedimientos para detectar cambios en las modificaciones de fosforilación de proteínas diana mediante electroforesis en gel Phos-tag en muestras clínicas y ensayos de quinasa in vitro .

Resumen

La fosforilación es una modificación postraduccional clásica que regula la función de las proteínas. Las proteínas suelen contener múltiples sitios potenciales de fosforilación, que pueden ser modificados por varias quinasas en diferentes lugares. El estudio de los cambios de fosforilación de las proteínas diana en la enfermedad a menudo requiere anticuerpos fosfoespecíficos. Sin embargo, las opciones comerciales pueden estar limitadas a un solo sitio o no estar disponibles en absoluto. Aquí, se describe un método para detectar cambios en las modificaciones de fosforilación de proteínas diana en muestras clínicas utilizando la electroforesis en gel Phos-tag e identificar sitios de fosforilación detallados a través de ensayos de quinasa in vitro . Las proteínas fosforiladas unidas a Phos-tag exhiben tasas de migración más lentas en la electroforesis en gel SDS-PAGE, lo que permite un análisis semicuantitativo de los cambios de fosforilación en los tejidos de la enfermedad en función de la intensidad media de píxeles de las bandas de migración lenta. Al combinar Phos-tag SDS-PAGE con inmunotransferencia utilizando anticuerpos panespecíficos contra múltiples proteínas candidatas, los investigadores pueden identificar de manera eficiente las proteínas diana con cambios de fosforilación. Después de la selección de quinasas candidatas, se realizan ensayos de quinasas in vitro con la proteína diana y los productos fosforilados resultantes se someten a espectrometría de masas para una identificación precisa del sitio. Este método no requiere anticuerpos específicos contra proteínas fosforiladas, lo que permite el cribado a gran escala de muestras de tejido para identificar estados alterados de fosforilación en la enfermedad. Además, los sitios de fosforilación identificados se pueden utilizar para desarrollar anticuerpos específicos para el análisis cuantitativo y de localización en los tejidos de la enfermedad, proporcionando una visión más profunda de sus funciones funcionales.

Introducción

La fosforilación es una modificación postraduccional clave para modular la localización subcelular, la actividad quinasa y la actividad transcripcional de las proteínas. Se han encontrado más de 500 genes de proteína quinasa en el genoma humano, que están involucrados en la transducción de señales, la expresión génica y la interacción proteína-proteína¹. La fosforilación y la desfosforilación están bajo el control de varias quinasas, que son rápidamente reversibles para regular la adhesión celular, la proliferación celular y la diferenciación celular². Sin embargo, las modificaciones anormales de la fosforilación de proteínas son responsables de muchas enfermedades humanas, incluida la tumorigénesis, los trastornos autoinmunes, la neurodegeneración y la subfertilidad ^3,4,5.

El perfil fosfoproteómico de las muestras clínicas produce múltiples proteínas candidatas fosforiladas diferencialmente⁶. Para revelar las modificaciones clave de fosforilación en enfermedades humanas, es necesario un método fácil y eficiente para detectar el estado de fosforilación de proteínas diana específicas. La fosforilación en diferentes sitios podría conducir a distintas alteraciones funcionales en la proteína. Por lo tanto, el uso de anticuerpos específicos de fosforilación dirigidos a sitios particulares de aminoácidos es sin duda el mejor método para detectar cambios en la fosforilación de proteínas. Sin embargo, los anticuerpos fosfoespecíficos bien caracterizados están ausentes para muchas proteínas. Además, se requiere un enfoque más adecuado para identificar nuevos sitios potenciales de fosforilación. La fosforilación en residuos de aminoácidos específicos a menudo altera la tasa de migración de una proteína en la electroforesis en gel, y las bandas de migración más lenta pueden reflejar cambios en el estado de fosforilación⁷. Sin embargo, estos cambios de movilidad suelen ser sutiles, lo que los hace difíciles de distinguir. Phos-tag es un compuesto químico sintetizado diseñado a partir de un dominio catalítico de fosfatasa alcalina como modelo, que puede capturar residuos fosforilados de Ser/Thr/Tyr y His/Asp/Lys. Por lo tanto, la conjugación phos-tag amplifica eficazmente las diferencias de la tasa de migración entre proteínas fosforiladas y no fosforiladas, al tiempo que distingue variaciones en el número de sitios de fosforilación⁸.

Esta metodología basada en etiquetas Phos para detectar cambios en la fosforilación de proteínas diana en muestras de tejido ofrece claras ventajas sobre los enfoques convencionales. Fundamentalmente, elimina el requisito de anticuerpos fosfoespecíficos, en su lugar utiliza anticuerpos específicos de proteínas estándar de grado WB para la detección. Las formas fosforiladas y no fosforiladas de las proteínas diana se resuelven como bandas distintas durante Phos-tag SDS-PAGE, lo que permite una evaluación semicuantitativa de las alteraciones del nivel de fosforilación en los estados de enfermedad a través del análisis comparativo de la intensidad de bandas. El flujo de trabajo en este protocolo incluye: (1) separación de muestras de proteínas Phos-tag SDS-PAGE, (2) detección de inmunoblot para objetivos fosforilados, (3) ensayos de quinasa in vitro con quinasas candidatas verificadas por anticuerpos fosfo-Ser/Thr. El análisis posterior de espectrometría de masas (realizado por una plataforma de servicio externa) identifica los sitios de fosforilación para permitir el desarrollo de anticuerpos específicos del sitio; La metodología detallada no está incluida en el protocolo actual. En particular, este enfoque se aplicó con éxito para detectar cambios de fosforilación de Nur77 en muestras clínicas, identificando la quinasa Mst1 como el regulador aguas arriba de la fosforilación de Nur77 y desarrollando un fosfoanticuerpo específico del sitio para la detección clínica de fosforilación en treonina 366 de Nur77⁹. Por lo tanto, este enfoque resulta particularmente valioso durante las fases preliminares de investigación cuando se investigan múltiples proteínas candidatas, ya que permite el cribado a gran escala de los cambios en el estado de fosforilación en numerosas dianas utilizando anticuerpos disponibles comercialmente.

Protocolo

Las Juntas de Revisión Institucional del Hospital Nanjing Drum Tower aprobaron la investigación en humanos (2013-408081-01). El protocolo actual se establece utilizando el tejido endometrial como modelo representativo. Con la optimización adecuada, esta metodología se puede extender a otras muestras clínicas, incluidos, entre otros, tejidos tumorales para la extracción de proteínas y análisis posteriores. La biopsia endometrial se realiza en la fase secretora media de mujeres fértiles (grupo Control) y mujeres con fallo recurrente de implantación embrionaria sometidas a fecundación-transferencia embrionariain vitro (grupo Enfermedad). Todos los pacientes dieron su consentimiento informado antes del procedimiento de muestreo. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de muestras

1. Enjuague las muestras de tejido fresco obtenidas dos veces con PBS preenfriado para eliminar las células sanguíneas y separe aproximadamente 100 mg de tejido en un tubo de centrífuga de 1,5 ml.
2. Coloque el tejido en un tubo de molienda de fondo redondo de 2 ml que contenga 1 ml de tampón de lisis de proteínas tisulares (150,0 mmol/L de NaCl, 1,0 % de NP-40, 50,0 mmol/L de Tris pH 8,0, 0,5 % de desoxicolato de sodio, cóctel de inhibidores de proteasa y cóctel de inhibidores de fosfatasa 2 y 3).
3. Ajuste la velocidad del dispersor de tejidos de alta velocidad al nivel 5 (de 6 niveles) y muela el tejido durante 10 s, seguido de 30 s de incubación en hielo. Repita este proceso 5 veces para obtener un homogeneizado de tejido.
4. Lisar el homogeneizado mediante rotación lenta en un agitador a 4 °C durante 30 min, luego centrifugar a 4 °C y 13.000 × g durante 10 min, y recoger el sobrenadante.
5. Determine la concentración de proteínas utilizando el método BCA.
6. Tome un total de 300 μg de proteína, ajústela a un volumen igual y mézclela con un tampón de muestra de proteína Laemmli 4×. Desnaturalice la mezcla calentándola a 95 °C durante 8 min, enfriándola a temperatura ambiente y luego cargándola para su posterior análisis.
   NOTA: Antes del paso 2, se recomiendan los análisis convencionales de Western blot para detectar la proteína de interés utilizando anticuerpos totales para evaluar los niveles de expresión.

2. Preparación en gel del gel Phos-tag SDS-PAGE

1. Prepare 100 ml de solución mixta de acrilamida al 30% p/v de N'-metileno-bisacrilamida añadiendo 29,0 g de acrilamida y 1,0 g de N, N'-metileno-bisacrilamida.
   NOTA: Mantener a 4 °C en la oscuridad.
2. Prepare una solución de Tris-HCl de 1,5 mol/L (pH 8,8), una solución de Tris-HCl de 0,5 mol/L (pH 6,8), una solución SDS al 10% p/v y una solución de persulfato de amonio al 10% p/v como se usa en SDS-PAGE convencional.
3. Prepare una solución de 5,0 mmol/L de Phos-tag y una solución de 10 mmol/L de MnCl₂ específica para el gel Phos-tag SDS-PAGE.
4. Preparar la solución de gel de resolución, en caso de preparación de la solución de 10 ml con gel de poliacrilamida al 6 p/v con 50 μM de solución Phos-tag y 100 μM de MnCl₂, mezclando 2 ml de solución mixta de acrilamida/bis-acrilamida al 30% (p/v), 2,5 mL de solución de Tris/HCl de 1,5 mol/L (pH 8,8), 0,1 mL de solución Phos-tag de 5,0 mmol/L, 0,1 ml de solución de MnCl₂ de 10 mmol/L, 0,1 ml de solución SDS al 10% (p/v), 10 μl de TEMED y 5,14 ml de agua destilada.
5. Agite suavemente la solución de gel de resolución preparada para garantizar la homogeneidad, luego coloque el tubo de solución de gel en un desecador al vacío y aplique un vacío (0,1 MPa) durante 2 min hasta que no queden burbujas visibles.
6. Agregue 50 μL de persulfato de amonio al 10% y mezcle suave pero bien.
7. Pipetee inmediatamente la solución en el casete de gel ensamblado hasta que alcance ~1 cm por debajo del borde superior de la placa corta. Evite introducir burbujas.
8. Coloque con cuidado una capa de 0,5 ml de agua destilada sobre el gel para excluir el aire y garantizar una interfaz plana. Deje la polimerización a temperatura ambiente durante 20-30 min.
9. Al mismo tiempo, prepare una solución de gel de apilamiento tamponado Tris-HCl estándar (gel de poliacrilamida al 4,5 % p/v) mezclando 0,6 ml de solución mixta de acrilamida/bisacrilamida al 30 % (p/v), 1 ml de solución Tris-HCl de 0,5 mol/l (pH 6,8), 40 μl de solución SDS al 10 % (p/v), 4 μl de TEMED y 2,33 ml de agua destilada. Suavemente vórtice y desgasifica.
10. Asegúrese de que el gel se haya solidificado por completo (incline el casete de gel para observar la inclinación de la capa superior de líquido mientras confirma la inmovilidad de la interfaz intermedia). Vierta con cuidado la capa de agua, luego escurra por completo.
11. Agregue 20 μl de persulfato de amonio al 10% en la solución de gel apilable preparada, mezcle suavemente e inmediatamente pipetee sobre el gel de resolución.
12. Coloque con cuidado un peine de 10 o 15 pocillos en la solución de gel apilable, evitando burbujas. Deje que el gel de apilamiento polimerice a temperatura ambiente durante 10 min.
    NOTA: Siempre prepare el gel justo antes de usarlo. Optimice las concentraciones de acrilamida y marcado con fos para cada proteína de interés.

3. Electroforesis de Phos-tag SDS-PAGE

1. Ensamble el equipo de electroforesis y llene las cámaras de electrodos con tampón de funcionamiento Tris / Glycine / SDS convencional.
2. Cargue una muestra de proteína de 30 μg en cada pocillo con una micropipeta.
3. Realice la electroforesis en condiciones de corriente constante (30 mA/gel) hasta que el azul de bromofenol llegue al fondo del gel de resolución.
4. Remoje los geles en tampón de transferencia SDS-PAGE sin metanol con EDTA 5 mM durante 10 min dos veces para eliminar los cationes bivalentes.
5. Transfiera las proteínas a la membrana de PVDF a 90 V durante 90 min utilizando sistemas de transferencia en húmedo / tanque.

4. Inmunotransferencia y análisis

1. Bloquear la membrana con una solución al 5% de leche desnatada o albúmina de suero bovino en polvo (diluida en solución 1×Tris-Borato-Sodio Tween-20, TBST) a temperatura ambiente durante 1 h.
2. Diluir el anticuerpo primario contra la proteína diana con una proporción adecuada e incubar con la membrana a 4 °C durante la noche.
3. Lave la membrana 3 veces con TBST, 10 min por lavado, a temperatura ambiente con agitación suave.
4. Incube la membrana con un anticuerpo secundario conjugado con HRP a temperatura ambiente durante 1 h.
5. Lave la membrana 3 veces con TBST, 10 min por lavado, a temperatura ambiente con agitación suave.
6. Incube con el sustrato de quimioluminiscencia mejorado en la oscuridad durante 1 min, seguido de la exposición.
7. Capture las imágenes utilizando un sistema automatizado de documentación de gel y cuantifique las bandas objetivo (proteína diana fosforilada de migración lenta y proteína diana no fosforilada de migración rápida) para la intensidad de escala de grises utilizando el software ImageJ.
   NOTA: Las transferencias Western de geles Phos-Tag no se pueden usar para realizar asignaciones de peso molecular.
8. Calcule la relación entre bandas fosforiladas de migración lenta y bandas no fosforiladas de migración rápida para cada muestra, y analice la diferencia estadística del porcentaje de fosforilación entre grupos.

5. Inmunoprecipitación de la proteína diana

1. Construir plásmidos de expresión que codifiquen etiquetas de epítopo etiquetadas con FLAG (o etiquetas de epítopos alternativas, incluidas, entre otras, HA, GFP, GST o His) fosfomutantes de tipo salvaje o específicos del sitio de la proteína diana.
2. Transfecte células HEK293 con plásmidos de expresión utilizando Lipofectamine 3000 según el protocolo del fabricante.
3. Lisar las células en 1 ml de tampón de lisis de proteínas tisulares como se describe en el paso 1 para extraer el sobrenadante proteico.
4. Incubar el sobrenadante con 20 μL de gel de afinidad Anti-FLAG M2 durante la noche a 4 °C con rotación.
5. Centrifugar (1000 × g, 3 min), recoger las perlas de agarosa y lavar con 10 volúmenes de columna de TBS para eliminar las proteínas unidas de forma no específica.
6. Disuelva el péptido FLAG en TBS a una concentración final de 100 μg/ml.
7. Eluya la proteína de fusión FLAG unida del gel de afinidad anti-FLAG M2 mediante elución competitiva con cinco volúmenes de una columna de solución peptídica FLAG (use una solución de 100 μL para perlas de agarosa de 20 μL) durante 5-10 min con una mezcla suave.
8. Centrifugar (1000 × g, 3 min) y recoger el sobrenadante.
   NOTA: Si se conoce la quinasa, continúe con el paso 6; de lo contrario, primero identifique las quinasas potenciales a través de la detección de dos híbridos de levadura o la predicción bioinformática (p. ej., usando PhosphositePlus o Group-based Prediction System) antes de continuar con el paso 6.

6. Ensayo de quinasa in vitro para identificar aminoácidos fosforilados

1. Preparar tampón quinasa (30 μL por reacción): 40 mM HEPES pH7,6, 10 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 2,5 mM de β-glicerofosfato, 200 μM de ATP, 100 ng de quinasa activa, proteína de fusión FLAG inmunoprecipitada.
2. Incubar a 30 °C durante 30 min en un termomezclador con agitación suave.
3. Detenga las reacciones añadiendo 10 μL 4× tampón Laemmli y desnaturalice a 95 °C durante 5 min.
4. Realice una electroforesis SDS-PAGE convencional utilizando proteína de fusión FLAG inmunoprecipitada que reacciona con o sin quinasa activa.
5. Sonda con anticuerpo anti-fosfo-Thr y anticuerpo anti-fosfo-Ser para identificar aminoácidos fosforilados. Sonda con anticuerpo Anti-Flag como control (ver Tabla de Materiales).
6. Complete la inmunotransferencia y el análisis como se describe en el paso 4.

Resultados

El perfil fosfoproteómico preliminar de muestras humanas del grupo de control y del grupo de la enfermedad identificó a Nur77 como una proteína fosforilada diferencialmente candidata. Para evaluar la eficacia de Phos-tag SDS-PAGE en la detección de la fosforilación de la proteína Nur77, se realizó un experimento Mn²⁺-Phos-tag SDS-PAGE. Después de la extracción total de proteínas de muestras de tejido, se cargaron 30 μg de proteína y se separaron mediante electroforesis en gel Mn²⁺-Phos-tag, seguida ...

Discusión

El enfoque basado en Phos-tag para detectar cambios de fosforilación de proteínas diana en tejidos clínicos ofrece ventajas significativas para la investigación de la fosforilación de proteínas. Las proteínas fosforiladas exhiben una movilidad electroforética reducida debido a la unión de Phos-tag, lo que permite un cribado de alto rendimiento del estado de fosforilación de las proteínas candidatas sin necesidad de anticuerpos fosfoespecíficos. Esto es particularmente valioso para el per...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución SDS al 10%	Sangon Biotech	B548118
10x Tris/Glicina/SDS	BIO-RAD
4&veces;   Tampón de muestra de proteína Laemmli	BIO-RAD	1610747
Acrilamida	Sangon Biotech	A601032
Persulfato de amonio		Sangon Biotech A100486
Anti-FLAG M2	Millipore	A2220
Kit de quimioluminiscencia mejorado	ThermoFisher	32106
Anticuerpo	FLAG CST	14793
BANDERA Péptido	Millipore	F3290
Anticuerpo secundario conjugado HRP	Bioworld Technology	BS13278
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015
Mini Trans-Blot Cell	BIO-RAD	1703930
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electroforesis Cell	BIO-RAD	1658005
Mst1 anticuerpo	CST	3682
N, N'-metileno-bisacrilamida	Sangon Biotech	A600025
N, N, N', N'-Tetrametiletilendiamina (TEMED)	Sangon Biotech	A610508
Nur77 anticuerpo	CST	3960
Cóctel inhibidor de la fosfatasa 2	Sigma	P5726	Para la inhibición de la proteína tirosina fosfatasas, ácido y fosfatasas alcalinas
Cóctel inhibidor de fosfatasa 3	Sigma	P0044	Para la inhibición de la proteína fosfatasa 2A, fosfatasas alcalinas, proteínas fosfatasas 1 y 2A
Anticuerpo fosfoserina	Sigma	P5747
Anticuerpo fosfo-treonina	Sigma	P6623
Phos-tag Acrilamida	Wako	304-93526	Para la preparación de Phos-tag Kit de
ensayo de proteína Pierce BCA	PAGE Thermo	23227
Cóctel inhibidor de proteasa	Sigma	S8830	sin EDTA, tableta, para la inhibición de la membrana PVDF de serina, cisteína, aspártico y metaloproteasa
	Dispersor	3010040001
ThermoMixer	Eppendorf	2231001127
	IKA	T 10	Para obtener homogeneizado de tejido
Tampón de Tris-HCl (0,5 M, pH 6,8)	B546020		Sangon Biotech
(1,5 M, pH 8,8)	de vacío B546019		Sangon Biotech
	ThermoFisher	5311-0250	Para desgasificar la solución de gel
β-Mercaptoetanol	Sigma	M3148