Manipulación y análisis de procesos dependientes del ciclo celular en levaduras en ciernes

Summary

Este protocolo detalla dos métodos de detención del ciclo celular de levadura y liberación opcional, y elabora el uso de microscopía de fluorescencia para estudiar los procesos dependientes del ciclo celular en S. cerevisiae.

Abstract

Las células eucariotas siguen un ciclo celular conservado que regula diversos procesos, incluido el mantenimiento del ADN y la homeostasis de los orgánulos. A menudo es necesario estudiar los procesos celulares de una manera dependiente del ciclo celular para interpretar adecuadamente los resultados experimentales. Existen métodos químicos y genéticos disponibles para producir la sincronización del ciclo celular en células cultivadas en una amplia franja de organismos, incluidos modelos de vertebrados, lo que permite el estudio de los procesos dependientes del ciclo celular. Sin embargo, entre los organismos modelo, la levadura en ciernes sigue siendo una fuente inagotable para el análisis del ciclo celular debido a sus métodos de sincronización particularmente robustos, tiempo de generación corto y tratabilidad genética. La levadura comparte la maquinaria central del ciclo celular con otros eucariotas, lo que ha permitido descubrimientos históricos en la regulación del ciclo celular. Este protocolo detalla métodos para el análisis del ciclo celular en levaduras, centrándose en experimentos de detención y liberación mitótica de G1, incluida la construcción de cepas, la preparación de cultivos y la microscopía. Se presentan métodos de marcado por PCR para producir cepas adecuadas para la detención del ciclo celular y la microscopía de fluorescencia. Se logra una detención de G1 utilizando el factor de α de feromonas peptídicas, y los lavados breves dan como resultado una liberación sincrónica y una progresión del ciclo celular. Las muestras se toman en diferentes momentos después de la liberación en el ciclo celular y se fijan para microscopía. Un segundo método detiene las células de levadura en mitosis al agotar el regulador del ciclo celular Cdc20 para lograr una población detenida en metafase, así como una liberación opcional en anafase. Las muestras se fijan y preparan para obtener imágenes antes y después de la liberación, y se obtienen imágenes y se analizan. El análisis de imágenes se centra en catalogar la localización dinámica y los cambios de abundancia poblacional de proteínas en el ciclo celular. Estos métodos de sincronización son adecuados para diversas manipulaciones del ciclo celular y, aunque aquí se destaca su uso en la obtención de imágenes de células fijas, pueden adaptarse para muchos otros análisis, incluidas las imágenes de células vivas, así como los ensayos bioquímicos y moleculares.

Introduction

La división celular eucariota está altamente regulada a través de un programa llamado ciclo celular. Los procesos altamente conservados y dinámicos que ocurren en el ciclo celular hacen que sea interesante estudiarlo en sí mismo, pero también tienen implicaciones generalizadas que informan las investigaciones de otros procesos biológicos celulares: por ejemplo, muchos orgánulos experimentan una remodelación dramática durante la división celular, y la abundancia y localización de muchas proteínas está altamente regulada a lo largo de ^1,2,3. Au....

Protocol

1. Construcción de cepas para análisis de ciclo celular e imágenes

1. Diseñe cebadores para etiquetar C-terminalmente el gen de interés utilizando plásmidos de etiquetado de Pringle (plásmidos plastivos pFA6a)²⁴. En resumen, diseñe cebadores F2 y R1 que, cuando se usan con un plásmido de la serie pFA6a, producen un producto de PCR que se puede transformar directamente en levadura para generar una versión 'etiquetada' del gen de interés. Utilice los pares de cebadores y plásmidos contenidos en la Tabla 1 para etiquetar los genes de interés en este protocolo. Longtine et

Results

El análisis de los cambios en la localización de proteínas dependientes del ciclo celular mediante microscopía de fluorescencia se puede lograr fácilmente utilizando los métodos que describimos aquí. Nuestro grupo ha estado interesado durante mucho tiempo en la regulación dinámica y la función del huso mitótico. En la levadura, los cuerpos polares del huso (marcados por el componente Spc110) funcionan como centros organizadores de microtúbulos de los que .......

Discussion

La utilización de la sincronización del ciclo celular en levadura en ciernes permite estudiar mecanismos importantes para una variedad de procesos celulares. El uso de G1 detiene y libera con tratamiento de factor α permite la progresión sincrónica de una población de células a través de las etapas del ciclo celular y, como mostramos, puede revelar patrones de localización dinámicos de reguladores celulares como Stu2³⁶. Las detenciones del ciclo celular también se.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
?-factor	Instalación de Síntesis Núcleo de la Universidad de Utah		Secuencia: WHWLQLKPGQPMY
Tubos Eppendorf de 1,5 mL	Axygen	MCT-175-C
Mezcla dNTP de 10mM	Termo Científica	R0193
Tubos cónicos de 50 mL	Greiner Bio-One	227 261
5x buffer de reacción HF Phusion	New England BioLabs	B0518S
Ácido acético, glaciar	Fisher Chemical	BP2401C-212
Sal de hemisulfato de adenina	Sigma-Aldrich	A9126-100G
Agar, granulado	Apex Chemicals and Reactivos	20-275
agarosa	Productos de Apex Bioresearch	20-102GP
Esterilizador de vapor Autoclave Amsco Century	Steris	SV-1262
Agua DI autoclave
Auxina	Sigma-Aldrich	Cat#I3750-5G-A; CAS: 87-51-4
Cargille Laser Liquid	Laboratorios Cargille	20130
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-500G
DAPI (40,6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidrocloruro)	Sondas moleculares	Cat#D1306
Sal sódica de ácido desoxirribonucleico procedente de testiculos de salmón	Sigma-Aldrich	D1626
Dextrosa	Fisher Chemical	D16-10
Tetraacetato de etilendiamina disódico	Fisher Chemical	S811-10
DMSO	Termo Científica	20688
FIJI/ImageJ2 vs 2.14.0/1.54f	ImageJ2	https://imagej.net/software/fiji/
Mezclador de vórtices de velocidad fija	VWR	https://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
Microscopio fluorescente DV Ultra	Leica	https://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwE	Serie #: NV01063. Ya no soportado
Formaldehído	Fisher Chemical	Cat#F79-500
Aparato de gel	Termo Científica	Owl EasyCast B1
Mezcla de escaleras de ADN GeneRuler	Fermentas	SM0333
Cuentas de vidrio	Fisher Scientific	11312A
Diapositivas de vidrio	VWR	48300-026
Innova 2300 Plataforma Agitadora	New Brunswick	NB-2300
Kimwipes	Kimtech	06-666
Centrífuga de laboratorio para tubos de 1,5 mL	Eppendorf	2525
Centrífuga de laboratorio para tubos de 50 mL	Eppendorf	5804
Dihidrato de acetato de litio	Sigma-Aldrich	L4158-250G
Master cycler nexus X2	eppendorf	https://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
Micropipetas p2, p20, p200 y p1000 y puntas correspondientes	Rainin	L-2XLS+R, L-20XLS-R, L-200XLS-R, L-1000XLS-R
Vidrio de la cubierta del microscopio	Fisher Scientific	12541014
Nocodazol	Calbiochem	Cat#487928; CAS: 31430-18-9; Lote#B35705
Orange G	Sigma-Aldrich	O7252
CLAVIJA	Investigación Hampton	HR2-591
Peptona granulada	Biorreactivos de Fisher	BP9725-5
Polimerasa de ADN HF Phusion	New England BioLabs	M0530L
Pipet-X	Rainin	PX-100R
Fosfato de potasio, dibásico	Termo Científica	424195000
Fosfato de potasio, monobásico	Termo Científica	424200025
Fuente de energía	Bio-Rad	23786
Empezar a adquirir Ultra 1.2.2	softWoRx Cytiva	Obtención con DV Ultra
Tris Base	Biorreactivos de Fisher	BP152-10
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
rotador de tubos	VWR	10136-084
Baños de agua	VWR	WBE10A11B
Agua, ultra pura	Productos de Apex Bioresearch	18-194
Extracto de levadura granulado	Biorreactivos de Fisher	BP9727-5