Method Article

Manipulación y análisis de procesos dependientes del ciclo celular en levaduras en ciernes

DOI:

10.3791/68887

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September 26th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Howard Hughes Medical Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

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Este protocolo detalla dos métodos de detención del ciclo celular de levadura y liberación opcional, y elabora el uso de microscopía de fluorescencia para estudiar los procesos dependientes del ciclo celular en S. cerevisiae.

Abstract

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Las células eucariotas siguen un ciclo celular conservado que regula diversos procesos, incluido el mantenimiento del ADN y la homeostasis de los orgánulos. A menudo es necesario estudiar los procesos celulares de una manera dependiente del ciclo celular para interpretar adecuadamente los resultados experimentales. Existen métodos químicos y genéticos disponibles para producir la sincronización del ciclo celular en células cultivadas en una amplia franja de organismos, incluidos modelos de vertebrados, lo que permite el estudio de los procesos dependientes del ciclo celular. Sin embargo, entre los organismos modelo, la levadura en ciernes sigue siendo una fuente inagotable para el análisis del ciclo celular debido a sus métodos de sincronización particularmente robustos, tiempo de generación corto y tratabilidad genética. La levadura comparte la maquinaria central del ciclo celular con otros eucariotas, lo que ha permitido descubrimientos históricos en la regulación del ciclo celular. Este protocolo detalla métodos para el análisis del ciclo celular en levaduras, centrándose en experimentos de detención y liberación mitótica de G1, incluida la construcción de cepas, la preparación de cultivos y la microscopía. Se presentan métodos de marcado por PCR para producir cepas adecuadas para la detención del ciclo celular y la microscopía de fluorescencia. Se logra una detención de G1 utilizando el factor de α de feromonas peptídicas, y los lavados breves dan como resultado una liberación sincrónica y una progresión del ciclo celular. Las muestras se toman en diferentes momentos después de la liberación en el ciclo celular y se fijan para microscopía. Un segundo método detiene las células de levadura en mitosis al agotar el regulador del ciclo celular Cdc20 para lograr una población detenida en metafase, así como una liberación opcional en anafase. Las muestras se fijan y preparan para obtener imágenes antes y después de la liberación, y se obtienen imágenes y se analizan. El análisis de imágenes se centra en catalogar la localización dinámica y los cambios de abundancia poblacional de proteínas en el ciclo celular. Estos métodos de sincronización son adecuados para diversas manipulaciones del ciclo celular y, aunque aquí se destaca su uso en la obtención de imágenes de células fijas, pueden adaptarse para muchos otros análisis, incluidas las imágenes de células vivas, así como los ensayos bioquímicos y moleculares.

Introduction

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La división celular eucariota está altamente regulada a través de un programa llamado ciclo celular. Los procesos altamente conservados y dinámicos que ocurren en el ciclo celular hacen que sea interesante estudiarlo en sí mismo, pero también tienen implicaciones generalizadas que informan las investigaciones de otros procesos biológicos celulares: por ejemplo, muchos orgánulos experimentan una remodelación dramática durante la división celular, y la abundancia y localización de muchas proteínas está altamente regulada a lo largo de 1,2,3. Aunque hay algunas capas adicionales de complejidad presentes en los sistemas metazoarios en comparación con la levadura, incluida una mayor variedad de quinasas y proteínas reguladoras, así como información adicional de señalización externa en los metazoos, la división celular está en general muy bien conservada en todos los eucariotas 4,5. En la levadura se realizó gran parte del trabajo fundamental que establece información clave sobre la progresión del ciclo celular y los pasos reguladores cruciales, y sigue siendo un organismo extremadamente atractivo para estudiar cuestiones relacionadas con el ciclo celular por una multitud de razones 6,7. El principal de ellos es la amplia gama de métodos disponibles para manipular el ciclo celular, lo que permite la detención en varias etapas y la sincronización de las células. Las ventajas adicionales incluyen el ciclo celular corto de la levadura (~ 90-150 min dependiendo de la temperatura y las condiciones del medio), la facilidad de manipulación genética y la gran amplitud de alelos condicionales que permiten el estudio en un contexto de tipo salvaje.

La progresión a través de las diferentes fases del ciclo celular está impulsada por la actividad de varias quinasas clave, incluida la omnipresente quinasa dependiente de ciclina (Cdk), la quinasa tipo Polo y las quinasas Aurora. Los puntos de control del ciclo celular regulan la progresión a través del ciclo celular, asegurando que las células no progresen a la siguiente etapa de división a menos que se cumplan condiciones específicas 8,9. Estos puntos de control, y las transiciones que regulan, pueden ser secuestrados por los investigadores para lograr una detención a largo plazo, o una detención y liberación transitoria para sincronizar una población de células (Figura 1). Por ejemplo, el punto de control de compromiso del ciclo celular (punto de restricción o inicio en levadura) asegura que la célula tenga suficientes nutrientes para comprometerse a la división antes de comenzar la replicación del ADN10. Este punto de control se puede manipular en levadura haploide para lograr una detención de G1, aprovechando el programa de apareamiento de levadura que interactúa con el ciclo celular. En la levadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae), las células haploides tienen uno de dos tipos de apareamiento, MATa o MATα, que está determinado genéticamente por un locus de tipo de apareamiento. Las levaduras de un tipo de apareamiento son sensibles a la feromona de apareamiento del otro tipo de apareamiento y responden activando una cascada de señalización de la quinasa MAP que finalmente fosforila y estabiliza el inhibidor de Cdk Far1, que evita la entrada en el ciclo celular al unirse al complejo Cln1 / 2-Cdk y bloquear su actividad 11,12,13. Las células que responden a las feromonas de apareamiento se pueden determinar visualmente por la presencia de una proyección de apareamiento o shmoo (Figura 1). Por lo tanto, se puede agregar un factor de α sintetizado químicamente a los cultivos de células MATa para lograr una detención G1. Otra transición del ciclo celular a la que los investigadores pueden apuntar para sincronizar las células de levadura es la transición de metafase a anafase. Durante la mitosis, el punto de control del ensamblaje del huso (SAC) monitorea la unión de cinetocoros a los microtúbulos e inhibe el complejo / ciclosoma promotor de la anafase (APC / C) al secuestrar su activador, Cdc20, cuando se detectan cinetocoros no unidos. El APC/C es un complejo ligasa E3 que es esencial para la entrada en anafase. Cuando se satisface el SAC, Cdc20 se une al APC / C, y APC / C ubiquitina varias proteínas, principalmente securina y ciclina B, que se dirigen a ellas para su degradación y promueve la segregación cromosómica y la salida mitótica14,15. Aunque Cdc20 en sí mismo no es un componente del SAC, su inhibición es el objetivo de la activación del SAC; por lo tanto, se puede aprovechar el agotamiento inducible de Cdc20 para detener un cultivo de levadura en metafase (Figura 1)16.

Este protocolo abarca dos métodos de manipulación del ciclo celular de levadura, así como una aplicación de ejemplo de cada método. En el primero, se usa α-factor para detener las células en G1, seguido de un paso de lavado para liberar las células de la detención, lo que resulta en una reentrada sincrónica del ciclo celular. Las células sincronizadas continuarán durante todo el ciclo celular, lo que permitirá a los investigadores rastrear y estudiar las células en cada etapa del ciclo celular. En este método, se monitorea la localización dinámica de una proteína de interés marcada con GFP, Stu2, y se rastrea su asociación con el huso mitótico. Este método también aprovecha un componente del cuerpo del polo del huso (SPB) etiquetado, Spc110-mCherry, que permite medir la longitud del huso mitótico y es un excelente indicador de la progresión del ciclo celular17. Este método demuestra cómo la detención y liberación del ciclo celular permiten la sincronización de las poblaciones celulares, facilitando el estudio de una proteína u otro componente de interés a lo largo del ciclo celular.

En el segundo método, se logra una detención mitótica a través del agotamiento de Cdc20 utilizando un sistema de degrón inducible por auxina (AID)18. En las células que expresan TIR1 (una proteína de caja F de origen vegetal), cualquier proteína con una etiqueta AID se ubiquitinará y degradará con la adición de auxina. Aquí, usamos un Cdc20 marcado con AID para permitir la degradación inducible de Cdc20, lo que provoca una detención en metafase. Luego, esta población celular se monitorea para el reclutamiento del componente SAC marcado Bub1-GFP a los cinetocoros, utilizando la proteína cinetocoro etiquetada Mtw1-mCherry como marcador fiducial. Aunque Bub1 desempeña funciones independientes de SAC en los cinetocoros y se localiza en cinetocoros en la mitosis temprana, su localización persistente de cinetocoro en células detenidas indica uniones inadecuadas de cinetocoro-microtúbulos19. Demostramos esto tratando las células con el veneno de microtúbulos, nocodazol, que interrumpe las uniones cinetocoro-microtúbulo. Este experimento destaca cómo se pueden estudiar los procesos específicos de una fase distinta del ciclo celular utilizando métodos de detención altamente sintonizables. Además, demostramos que la auxina se puede eliminar de los cultivos cdc20-AID, lo que permite la liberación en anafase y la entrada en un nuevo ciclo celular, aunque en nuestra experiencia, estos cultivos no se liberan tan sincrónicamente como una detención-liberación de factor α. Estos dos métodos de detención y liberación son efectivos y fáciles de implementar, pero los investigadores de levadura disponen de muchos otros métodos para detener las células en diferentes etapas del ciclo celular 20,21,22,23. Se pueden encontrar más detalles de estos métodos en la Discusión.

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Protocol

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1. Construcción de cepas para análisis de ciclo celular e imágenes

  1. Diseñe cebadores para etiquetar C-terminalmente el gen de interés utilizando plásmidos de etiquetado de Pringle (plásmidos plastivos pFA6a)24. En resumen, diseñe cebadores F2 y R1 que, cuando se usan con un plásmido de la serie pFA6a, producen un producto de PCR que se puede transformar directamente en levadura para generar una versión 'etiquetada' del gen de interés. Utilice los pares de cebadores y plásmidos contenidos en la Tabla 1 para etiquetar los genes de interés en este protocolo. Longtine et al.24 describen en detalle las estrategias de diseño de plásmidos y cebadores para el marcado C-terminal de genes de levadura24.
    NOTA: Este método se puede utilizar para producir proteínas marcadas con fluorescencia para imágenes, o proteínas marcadas con Degron inducible por auxina (AID) para facilitar la detención del ciclo celular y otros experimentos habilitados por la degradación de una proteína diana18. Por ejemplo, para etiquetar CDC20 con la etiqueta AID (IAA7), el cebador de etiquetado directo consta de 25-40 bases del gen CDC20 inmediatamente antes del codón de terminación, excluyendo el codón STOP (5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
    CAGCCAATATTTGATCAGG 3'), y también la secuencia adaptadora del plásmido de Pringle F2 (5' cggatccccgggttaattaa 3') anexada al extremo 3' para producir la secuencia de cebadores final (5' TACAAGGAGGCCCTCTAGTAC
    CAGCCAATATTTGATCAGG cggatccccgggttaattaa 3'). El cebador de etiquetado CDC20 inverso contiene el complemento inverso de los 25-40 pares de bases inmediatamente después del codón STOP (5' ATTATGCCTTGACATGAA
    CTTTTATTTTTTTTTTATTATTA 3') y la secuencia adaptadora del plásmido Pringle R1 (5' gaattcgagctcgtttaaac 3') para producir la secuencia de cebadores final (5' ATTATATGCCTTGACATGAACTTTTATT
    TTTTTTATTTTA gaattcgagctcgtttaaac 3'). También es importante tener en cuenta que el uso de cebadores de PCR de menos de 40 pares de bases reducirá la eficiencia de la integración en el genoma de la levadura.
  2. Diluya los cebadores en agua de grado de biología molecular a 10 μM.
  3. Realice la PCR con el par de plásmidos F2 y R1 y el plásmido de marcado apropiado utilizando métodos estándar, siguiendo el programa de termociclador contenido en la Tabla 2, luego confirme el tamaño del producto de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa.
  4. Inocular la cepa de levadura para transformarla en 25 mL de cultivo de extracto de levadura peptona adenina dextrosa (YPAD) y cultivar durante la noche a 23 °C. Para construir levadura cdc20-AID (que degradará Cdc20 tras el tratamiento con auxina), la cepa transformada puede contener ya OsTIR1 expresado a partir de un locus ectópico, o OsTIR1 puede cruzarse en18 posteriores.
  5. A la mañana siguiente, verifique el OD600 del cultivo nocturno. Si cultiva OD <2.0, continúe con el paso 1.6. Si la DO > 2.0, diluya a ~ 0.2-0.4 y permita 2-3 ciclos de crecimiento.
  6. Recolecte las células en OD600 = ~ 0.4-2.0 para asegurarse de que estén en fase de crecimiento logarítmico. Recolecte 5 OD de células por transformación (p. ej., 5 ml de OD600 = 1.0). Si se realiza más de una transformación de la misma cepa, las células se pueden combinar en esta etapa. Cosechar células centrifugando a 3.000 x g durante 5 min a 23 °C.
  7. Deseche el sobrenadante y lave el sedimento celular con 25 ml de agua, seguido de centrifugación a 3.000 x g durante 5 min a 23 °C.
  8. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 ml de acetato de litio 0,1 M (LiAc) y transfiéralo a tubos de 1,6 ml. Si realiza más de una transformación, divida la resuspensión de 1 ml en varios tubos (p. ej., para 2 transformaciones divididas 2x 500 μL; para 3 transformaciones divididas 3x 333 μL, etc.).
  9. Centrifugar las células a 1.000 x g durante 2 min a 23 °C y desechar el sobrenadante.
  10. Agregue lo siguiente al sedimento celular (en este orden): i) 240 μL de PEG (50%), ii) 36 μL de 1.0 M LiAc, iii) 20 μL = 50 μg de ADN de esperma de salmón prehervido durante 5 min, iv) 54 μL de agua.
  11. Agregue 10 μL de producto de PCR (obtenido en el paso 1.3) a las células y vórtice durante 1 min, asegurándose de que todo esté bien mezclado.
  12. Incubar las células a 30 °C durante 30 min en un tambor de rodillos en una habitación cálida o en un termoagitador a 1000 rpm.
  13. Celdas de choque térmico a 42 °C durante 15 min en un baño de agua.
    NOTA: El tiempo óptimo de choque térmico puede diferir según el fondo de la cepa de levadura. Este protocolo está optimizado para el fondo de la cepa W303.
  14. Centrifugar celdas a 1.000 x g durante 2 min a 23 °C. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente en 100 μL de agua.
  15. Para transformaciones que utilizan KanMX u otra selección de fármacos, coloque células en placas en YPAD e incube las placas a 23 ° C, luego repita la placa a la placa del fármaco al día siguiente.
    NOTA: Permitir un día de crecimiento en YPAD es fundamental para permitir la expresión de genes de resistencia a los medicamentos en células transformadas.
  16. Para transformaciones que utilizan marcadores auxotróficos (URA, HIS, etc.), placas de células directamente en medio selectivo.
  17. Incubar placas a 23 °C durante 3 días para permitir que crezcan las colonias de transformadores de levadura.
  18. Verificar el correcto marcaje del gen mediante PCR genómica o mediante western blotting. Estos métodos son descritos en detalle por Burnette25 y Chu et al26.
    NOTA: Para producir cepas con múltiples alelos marcados, no se recomienda la transformación repetida sin retrocruzamiento, ya que la transformación puede ser un proceso mutagénico. Para producir la cepa que contiene Stu2-GFP y Spc110-mCherry, por ejemplo, recomendamos transformar las cepas por separado para producir Stu2-GFP y Spc110-mCherry, y luego combinar estos alelos en una cepa haploide mediante cruce de levadura, esporulación, disección de tétradas y análisis genotípico. Más información sobre los cruces de levadura está disponible en Stansfield y Stark27 y Morin et al.28. Para realizar una liberación de detención de factor α, la cepa haploide utilizada debe ser MATa.

2. Cultivo de levadura y sincronización del ciclo celular: α factor de detención y liberación

  1. Inocular la levadura en 25 mL de cultivo YPAD durante la noche a 23 °C, para estar a OD600 = 0,5-2,0 a la mañana siguiente.
    1. Si las células están por encima de OD600 = 2.0 por la mañana, diluya nuevamente a OD600 = 0.2-0.4 y déjelas crecer durante al menos 1 ciclo celular (2-3 h a 23 ° C).
  2. Diluya las células de nuevo a OD600 = 0,5 y agregue factor de α a una concentración final de 1 μg/ml (stock de 10 mg/ml en DMSO). Idealmente, las células tendrían una mutación bar1 (por ejemplo, bar1-1), lo que las hace más sensibles al factor α. Las células de tipo salvaje BAR1 son menos sensibles al factor de α y requieren una concentración de factor de α que es al menos un orden de magnitud más alta para detenerse correctamente, lo que es menos económico.
  3. A las 2,5-3,5 h después del arresto, verifique el grado de arresto contando el porcentaje de células no brotadas. Cuando el 90-95% de las células estén descubiertas (detenidas en G1), proceda a la liberación. El tiempo diferirá según la cepa de levadura, el medio de crecimiento y la temperatura.
  4. Libere las células de la detención del factor α girando hacia abajo en centrifugadora a 3.000 x g durante 3-5 min a 23 ° C y luego vertiendo sobrenadante.
  5. Lave las células resuspendiendo el gránulo en 25 ml de YPAD + 1% de DMSO.
  6. Repita los pasos 2.4-2.5 dos veces para un total de tres lavados, cambiando el tubo usado una vez después del primer lavado.
  7. Agregue YPAD a las células para llevar el volumen final a 25 ml y transfiera las células a un nuevo matraz.
    NOTA: El uso de un matraz nuevo es fundamental para eliminar trazas de factor de α que podrían impedir la liberación.
  8. Tome una muestra de punto de tiempo (0 min) y corrija (consulte las instrucciones de fijación en los pasos 4.1 a 4.4).
  9. Continúe tomando muestras de puntos de tiempo cada 15 minutos si el crecimiento tiene lugar a 23 ° C. Este tiempo cambiará a otras temperaturas según la rapidez con la que crezcan las células.
  10. En el punto de tiempo 60 min, juzgue la sincronía de la liberación verificando si hay brotes pequeños uniformes (tamaño de brote < 25% del tamaño de la célula madre) bajo un microscopio óptico.
  11. Opcional) A los 60 min después de la liberación, agregue α-factor nuevamente a una concentración final de 1 μg / ml para evitar la progresión al siguiente ciclo celular. Confirme la liberación de células sincrónicas verificando la morfología uniforme de yemas pequeñas antes de la adición.
  12. Continúe tomando muestras de puntos de tiempo hasta 180 min, o el tiempo que desee. A 23 °C, la metafase ocurre ~ 45-60 min después de la liberación, la anafase ocurre ~ 60-90 min después de la liberación, y la mayoría de las células estarán en el nuevo G1 a los 120 min después de la liberación.

3. Cultivo de levadura y sincronización del ciclo celular: detención y liberación del agotamiento de Cdc20

  1. Inocular un cultivo de levadura durante la noche a 23 °C para estar a un OD600 = 0,5-2,0 a la mañana siguiente.
    1. Si las células están por encima de OD600 = 2.0 a la mañana siguiente, diluya nuevamente a OD600 = 0.2-0.4 y déjelas crecer durante al menos 1 ciclo celular (2-3 h a 23 ° C).
  2. Diluir de nuevo a OD600 = 0,5 y añadir auxina a una concentración final de 500 μM de stock de 1 M (500x) a todos los cultivos. Para cultivos que reciben otros fármacos (nocodazol), agréguelos simultáneamente con auxina a la concentración adecuada (p. ej., ~ 10 μg / ml de nocodazol).
  3. A las 2 h después del paro, verifique el grado de arresto contando el porcentaje de células de yemas grandes (las de yemas grandes se determinan como la presencia de yemas > el 25% del tamaño de la célula madre). Cuando el 90-95% de las células están detenidas en mitosis, proceda a recolectar muestras o liberar células de la detención, según la aplicación experimental. Si el 90% de las células no están detenidas, deje que el cultivo continúe creciendo y revíselo cada 15-30 minutos. El tiempo diferirá según la cepa de levadura, el medio de crecimiento y la temperatura.
    NOTA: No es aconsejable permitir que los arrestos continúen durante demasiado tiempo (más de 4 h) si se liberan, ya que los arrestos prolongados pueden reducir la viabilidad celular.
  4. Para liberar de la detención del agotamiento de Cdc20, coseche el cultivo por centrifugación a 3000 x g durante 3-5 min a 23 °C.
  5. Lave las células resuspendiendo el pellet en 25 ml de YPAD + 1% de DMSO, luego recolecte por centrifugación a 3.000 x g durante 3-5 min a 23 °C.
  6. Repita los pasos 3.4-3.5 para un total de 2 lavados.
  7. Agregue YPAD a las células para llevar el volumen final a 25 ml y transfiera las células a un nuevo matraz.
    NOTA: El uso de un matraz nuevo es fundamental para eliminar trazas de auxina que podrían evitar una liberación.
  8. Tome el punto de tiempo 0 y corrija (consulte las instrucciones de fijación en los pasos 4.1 a 4.4).
  9. Continúe tomando puntos de tiempo cada 10-15 minutos durante la duración deseada del curso de tiempo. A 23 °C, la mayoría de las células habrían sido liberadas del arresto después de 50-70 min.
    NOTA: Las células no se liberan tan sincrónicamente de esta detención de agotamiento de Cdc20 como lo hacen con la detención de factor α. Sin embargo, puede ser útil estudiar eventos de salida anásica o mitótica. Además, una limitación técnica de esta detención-liberación es que en puntos de tiempo posteriores a la liberación, es más difícil diferenciar entre las células de metafase que aún no se han liberado y las células que se liberaron antes y han alcanzado la metafase de su próximo ciclo celular. Si es necesario, esto se puede superar haciendo imágenes de células vivas para rastrear células individuales a medida que se liberan de la detención o agregando factor de α al cultivo (suponiendo que las células sean MATa) para detener las células en G1 después de la salida mitótica.

4. Fijación de levadura

  1. Centrifugar 1 ml (o 0,5-1,5 OD) de cultivo durante 1 min a velocidad máxima (~20.000 x g) a 23 °C.
  2. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 500 μL de solución fijadora (formaldehído al 3,7% en fosfato de potasio (KPi) 0,1 M pH 6,4).
  3. Incubar las células en la solución fijadora durante 2-15 min a
    23 °C. Para experimentos de curso de tiempo, generalmente es aconsejable fijar las células durante 15 minutos para alinear el momento de centrifugación de las células al tomar muestras.
    NOTA: El tiempo de fijación debe optimizarse para fluoróforos y proteínas específicos de interés.
  4. Centrifugar las celdas durante 1 min a velocidad máxima a 23 °C, aspirar el sobrenadante y volver a suspender en 500 μL de 0,1 M KPi (pH 6,4). Las células en KPi se pueden almacenar a 4 °C hasta que estén listas para la imagen.
    NOTA: La señal de fluorescencia de celda fija puede durar hasta 2 semanas, dependiendo del fluoróforo, sin embargo, para la cuantificación de señales fluorescentes, recopile imágenes dentro de los 7 días.

5. Preparación de portaobjetos para imágenes

  1. Cuando esté preparado para obtener imágenes, centrifugar las celdas durante 1 min a velocidad máxima a 23 °C y desechar el sobrenadante. Resuspender las células en 10-100 μL de solución Triton/DAPI/sorbitol (1,2 M de sorbitol, 1% de tritón, 0,1 M de KPi, pH 7,5, 2 μg/mL de DAPI).
  2. Pipetee ~0,8 μL de células directamente sobre un cubreobjetos limpio. Utilice una punta de pipeta para esparcir suavemente la gota de célula en un círculo de aproximadamente 1 cm2 en el centro del cubreobjetos.
  3. Coloque el cubreobjetos en un portaobjetos de microscopía. Use un Kimwipe para presionar suavemente alrededor del portaobjetos para distribuir la muestra.
  4. Selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas.
  5. Opcionalmente, almacene en un lugar fresco y oscuro durante un máximo de 4 a 6 h antes de obtener imágenes para ayudar a que las células se asienten y evitar el exceso de movimiento.

6. Imágenes

  1. Lleve el portaobjetos a un microscopio equipado con un objetivo de aceite de 60x / 1.42 y un juego de filtros y láser rojo, verde, azul, rojo lejano. También se pueden utilizar objetivos de mayor aumento (hasta 100x).
  2. Enfoque el microscopio en las células de levadura adheridas al cubreobjetos.
    NOTA: Si las células de levadura se mueven demasiado, los portaobjetos se pueden dejar en un lugar fresco y oscuro durante 20-60 minutos para que se asienten.
  3. Una vez que la levadura esté enfocada, ajuste la configuración de exposición de cada canal para producir una relación señal / ruido de al menos 3: 1, asegurándose de que no haya puntos fluorescentes sobreexpuestos.
    NOTA: Por ejemplo, en un sistema de imágenes que usamos con una cámara CMOS científica, usando un objetivo de 60x 550 y aceite de inmersión con un índice de refracción de n = 1.516, configurando la señal máxima del canal rojo en 1000-2000 UA, el canal verde en 3000 UA, el canal azul en 3000 UA y el canal DIC en 4000-5000 UA produce imágenes de alta calidad.
  4. Ajuste la configuración de adquisición para tomar 14-20 pilas Z de 0,2 μm para abarcar un total de 2-4 μm.
  5. Para microscopios equipados con módulos de posprocesamiento, seleccione Deconvolución y Proyección rápida para cada pila.
  6. Recolecte pilas Z de celdas, tomando suficientes imágenes para capturar ~ 100-200 celdas para cada condición o punto de tiempo.
  7. Consulte el archivo complementario 1 para obtener instrucciones de software con capturas de pantalla del software de imágenes.

7. Análisis de imágenes

  1. Abra las imágenes proyectadas en ImageJ y ajuste el brillo y el contraste para ver diferentes canales. Si el microscopio utilizado para la obtención de imágenes no tiene módulos de posprocesamiento, realice la proyección máxima de las pilas Z en esta etapa.
  2. Para determinar la progresión del ciclo celular, cuente 100 células por punto de tiempo y clasifíquelas como que contienen uno o dos núcleos. Alternativamente, calcule la longitud del husillo o la distancia entre los cuerpos de los polos del husillo para definir el estado del ciclo de celda. La distancia entre los focos Spc110 < 1,5 μm corresponde a las células de metafase, y la distancia > 1,5 μm se corresponde con las células de anafase.
  3. Para calcular las intensidades de los puntos de proteína (por ejemplo, Stu2-GFP), use la herramienta de selección a mano alzada para dibujar alrededor del límite de la señal de interés. Agregue esta señal al administrador de ROI (región de interés) presionando T o usando el menú. En el administrador de ROI , seleccione Medir para calcular la intensidad de cada punto seleccionado. Para ver los cambios en la señal de puntos a lo largo del tiempo, represente la intensidad media con un intervalo de confianza del 95 % en un gráfico de líneas para cada punto de tiempo.
  4. Para calcular el porcentaje de celdas con puntos Bub1-GFP, asegúrese de que la configuración de brillo mínimo y máximo del canal verde sea la misma en diferentes imágenes. Las células con un puntal Bub1-GFP que muestra superposición con un puntal Mtw1-mCherry se cuentan como Bub1 localizado en el cinetocoro; de lo contrario, la célula se cuenta como negativa. Cuente ~ 100 celdas por condición. Aravamudhan et al.29 contiene más información sobre la localización de Bub1 a cinetocoros.
  5. Para calcular el porcentaje de células mononucleares de yemas grandes, cuente el número de células con una yema grande y un núcleo (una señal DAPI) en la población y divídalo por el número total de células.
  6. Consulte el archivo complementario 1 para obtener las instrucciones del software con capturas de pantalla del software de imágenes.

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Results

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El análisis de los cambios en la localización de proteínas dependientes del ciclo celular mediante microscopía de fluorescencia se puede lograr fácilmente utilizando los métodos que describimos aquí. Nuestro grupo ha estado interesado durante mucho tiempo en la regulación dinámica y la función del huso mitótico. En la levadura, los cuerpos polares del huso (marcados por el componente Spc110) funcionan como centros organizadores de microtúbulos de los que ...

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Discussion

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La utilización de la sincronización del ciclo celular en levadura en ciernes permite estudiar mecanismos importantes para una variedad de procesos celulares. El uso de G1 detiene y libera con tratamiento de factor α permite la progresión sincrónica de una población de células a través de las etapas del ciclo celular y, como mostramos, puede revelar patrones de localización dinámicos de reguladores celulares como Stu236. Las detenciones del ciclo celular también se...

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Disclosures

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos al Centro de Imágenes Celulares de la Universidad de Utah por mantener las instalaciones del microscopio Delta Vision. Este trabajo fue apoyado en parte por las subvenciones de los NIH F31CA2717405 (a MGS) y T32GM141848 (a MGS y TCS), 5 For the Fight (a MPM), Pew Biomedical Scholars (a MPM) y R35GM142749 de subvenciones de los NIH (a MPM).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
?-factorInstalación de Síntesis Núcleo de la Universidad de UtahSecuencia: WHWLQLKPGQPMY
Tubos Eppendorf de 1,5 mLAxygenMCT-175-C
Mezcla dNTP de 10mMTermo CientíficaR0193
Tubos cónicos de 50 mLGreiner Bio-One227 261
5x buffer de reacción HF PhusionNew England BioLabsB0518S
Ácido acético, glaciarFisher ChemicalBP2401C-212
Sal de hemisulfato de adeninaSigma-AldrichA9126-100G
Agar, granuladoApex Chemicals and Reactivos20-275
agarosaProductos de Apex Bioresearch20-102GP
Esterilizador de vapor Autoclave Amsco CenturySterisSV-1262
Agua DI autoclave
AuxinaSigma-AldrichCat#I3750-5G-A; CAS: 87-51-4
Cargille Laser LiquidLaboratorios Cargille20130
D-SorbitolSigma-AldrichS1876-500G
DAPI (40,6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidrocloruro)Sondas molecularesCat#D1306
Sal sódica de ácido desoxirribonucleico procedente de testiculos de salmónSigma-AldrichD1626
DextrosaFisher ChemicalD16-10
Tetraacetato de etilendiamina disódicoFisher ChemicalS811-10
DMSOTermo Científica20688
FIJI/ImageJ2 vs 2.14.0/1.54fImageJ2https://imagej.net/software/fiji/
Mezclador de vórtices de velocidad fijaVWRhttps://dabos.com/product/vortex-mixers-vwr-fixed-speed-vortex-mixer-00001-24763?srsltid=AfmBOoo5TH0aoExvrrrphDaFt8XAsDqLvkjxtEUj1QWlFbWh7_gwzMObLT4&gQT=2
Microscopio fluorescente DV UltraLeicahttps://www.leica-microsystems.com/c/am/lsr-w/fluorescence-microscope-wf/?nlc=20250214-SFDC-022570&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=25-AM-LSR-L3-LSPO-LSWF-SE-Google-Ads-WF-Thunder-Search&utm_content=text_ad&utm_term=fluorescence%20microscopes&gad_source=1&gad_campaignid=170130111&gbraid=0AAAAADrbsAF-dGDbxzgT8m_cvXSlf4BB0&gclid=CjwKCAjwmenCBhA4EiwAtVjzmkMJUGFksaHezZvlBUlbbS1tR8RqXP24dbSRzcRgTT8RmJy7nyeThBoC3yQQAvD_BwESerie #: NV01063. Ya no soportado
FormaldehídoFisher ChemicalCat#F79-500
Aparato de gelTermo CientíficaOwl EasyCast B1
Mezcla de escaleras de ADN GeneRulerFermentasSM0333
Cuentas de vidrioFisher Scientific11312A
Diapositivas de vidrioVWR48300-026
Innova 2300 Plataforma AgitadoraNew BrunswickNB-2300
KimwipesKimtech06-666
Centrífuga de laboratorio para tubos de 1,5 mLEppendorf2525
Centrífuga de laboratorio para tubos de 50 mLEppendorf5804
Dihidrato de acetato de litioSigma-AldrichL4158-250G
Master cycler nexus X2eppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/PCR/Thermocyclers/Mastercycler-nexus-X2-p-PF-82586
Micropipetas p2, p20, p200 y p1000 y puntas correspondientesRaininL-2XLS+R, L-20XLS-R, L-200XLS-R, L-1000XLS-R
Vidrio de la cubierta del microscopioFisher Scientific12541014
NocodazolCalbiochemCat#487928; CAS: 31430-18-9; Lote#B35705
Orange GSigma-AldrichO7252
CLAVIJAInvestigación HamptonHR2-591
Peptona granulada Biorreactivos de FisherBP9725-5
Polimerasa de ADN HF PhusionNew England BioLabsM0530L
Pipet-XRaininPX-100R
Fosfato de potasio, dibásicoTermo Científica424195000
Fosfato de potasio, monobásicoTermo Científica424200025
Fuente de energíaBio-Rad23786
Empezar a adquirir Ultra 1.2.2softWoRx CytivaObtención con DV Ultra
Tris BaseBiorreactivos de FisherBP152-10
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1
rotador de tubosVWR10136-084
Baños de aguaVWRWBE10A11B
Agua, ultra puraProductos de Apex Bioresearch18-194
Extracto de levadura granuladoBiorreactivos de FisherBP9727-5

References

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