Artículo de método

Revelando el control electromecánico de la homeostasis tisular mediante un dispositivo microfluídico de dos capas

DOI:

10.3791/68894

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19 de septiembre de 2025

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1School of Life Sciences, Westlake University, 2Mechanobiology Institute, National University of Singapore, 3Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 4Research Center for Industries of the Future, Westlake University

En este artículo

Resumen

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Aquí, presentamos un protocolo para fabricar un dispositivo microfluídico único de dos capas para estudiar la regulación electromecánica de la homeostasis del tejido epitelial. El dispositivo aplica corrientes eléctricas fisiológicas estáticas perpendiculares al plano tisular, lo que afecta la adhesión, proliferación y extrusión célula-célula. Las imágenes de células vivas y las mediciones de estrés mecánico revelan mecanismos de estos procesos.

Resumen

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El comportamiento celular y el destino celular se ven afectados por corrientes eléctricas o campos que son endógenos o aplicados externamente. Las señales eléctricas estáticas se pueden aplicar en dispositivos microfluídicos personalizados para imitar el entorno eléctrico en procesos fisiológicos lentos como el desarrollo, la cicatrización de heridas y la homeostasis. Una clase importante de estudios eléctricos celulares es el control de la migración celular mediante corrientes galvánicas estáticas en el plano en canales microfluídicos simples que imitan las corrientes de la herida, con densidades de corriente de ~ 0.1-1000 A / m2. Sin embargo, debido a la geometría incompatible, estos dispositivos no son apropiados para estudiar los efectos eléctricos en la homeostasis tisular, donde las células adoptan una polaridad apico-basal y una diferencia de potencial transepitelial (TEPD). Aquí, detallamos un dispositivo único basado en microfluidos que aplica corrientes iónicas fisiológicas perpendiculares al plano de las capas de células epiteliales confluentes para perturbar el TEPD e investigar la regulación eléctrica de los estados estacionarios de los tejidos. La configuración está hecha de un polímero curable con UV de dos capas incrustado con un sustrato de gel de poliacrilamida suave recubierto con proteína de matriz extracelular de elección. Este dispositivo microfluídico proporciona la geometría correcta y el sustrato permeable para inducir una corriente iónica relativamente uniforme a través de las capas celulares a escala centimétrica. La configuración es compatible con imágenes confocales de células vivas y microscopía de fuerza de tracción para inferir tensiones mecánicas inducidas por las corrientes transepiteliales. Sorprendentemente, la proliferación, extrusión y migración de células se ven influenciadas colectivamente dentro del epitelio confluente dependiendo de la dirección de la corriente iónica, induciendo un nuevo estado tisular caracterizado por diferentes fuerzas de interacción célula-célula, eventos celulares (muerte y proliferación) y estructuras tisulares. Los comportamientos celulares controlados eléctricamente pueden entenderse como un estrés mecánico inducido eléctricamente y una respuesta celular. Este novedoso dispositivo y protocolo microfluídico proporciona la herramienta y la documentación necesarias para que las comunidades de mecanobiología y bioingeniería estudien los efectos eléctricos en la homeostasis tisular y desarrollen nuevas aplicaciones de ingeniería tisular.

Introducción

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Las señales bioeléctricas son factores biofísicos importantes que contribuyen a gobernar el comportamiento celular. El ejemplo más famoso es el potencial de acción en las neuronas y las células cardíacas, que transmiten señales eléctricas a largas distancias (hasta un metro) y a altas frecuencias (hasta cientos de hercios)1. Los pulsos eléctricos aplicados con electrodos se pueden utilizar para estimular el disparo del potencial de acción y son útiles en aplicaciones médicas y de investigación2. Las señales bioeléctricas endógenas en procesos fisiológicos lentos como el desarrollo, la cicatrización de heridas y la homeostasis 3,4,5,6,7,8 también se han medido 9,10 en períodos de horas a días. Un ejemplo importante son las capas epiteliales confluentes que mantienen activamente una diferencia de potencial transepitelial (TEPD) que va desde unos pocos hasta decenas de milivoltios 4,11. Un corte o herida en estas capas confluentes genera una corriente de cortocircuito, impulsada por la actividad eléctrica del tejido12,13. Se han descrito corrientes de bobinado de hasta decenas de μA/cm2 y campos eléctricos de hasta cientos de mV/mm con diferentes técnicas. Los estudios sugieren que estas señales eléctricas producen una señal direccional para que las células migren hacia los sitios de la herida o la infección que es importante para el proceso de curación 3,6,14. En general, tanto las señales eléctricas estáticas (o de variación lenta) como las de variación rápida son importantes y desencadenan diferentes respuestas celulares o tisulares.

Dentro del ámbito de las señales de variación lenta, un fenómeno importante es el proceso de migración impulsado eléctricamente denominado "galvanotaxis". Las corrientes galvánicas controladas en el plano se pueden aplicar en dispositivos microfluídicos con canales simples para imitar las corrientes de la herida mientras se investiga la migración celular en función de la densidad de corriente15,16. Se encuentra que los campos eléctricos de 0,1-1000 V/m (densidad de corriente correspondiente de 0,1-1000 A/m2) impulsan la migración celular en muchos tipos de células en este entorno in vitro 17, mientras que las vías de señalización canónicas a la quimiotaxis (migración celular guiada por gradientes químicos), como PI3K, se han implicado en la galvanotaxis 7,18. Los dispositivos microfluídicos "bare-bones" para el estudio de la galvanotaxia se pueden fabricar con técnicas estándar de litografía blanda y microfabricación19. Estos dispositivos generalmente comprenden un sustrato de polidimetil-siloxano (PDMS) de un solo canal unido a un portaobjetos de vidrio (tamaño de la sección transversal del canal: cientos de micrómetros, longitud: centímetros). Los electrodos utilizados para suministrar la corriente estática se instalan lejos de la región de la celda y se conectan con o sin puentes de sal. La conexión del puente de sal se puede realizar mediante orificios perforados a través del sustrato PDMS, conectores microfluídicos y tubos llenos de agar. El portaobjetos de vidrio simple (generalmente de 170 μm de grosor) debajo del canal también admite imágenes de células vivas de alta resolución durante los experimentos de galvanotataxis, que es una característica crucial para estudiar el proceso.

El papel de las señales eléctricas endógenas en el mantenimiento de la homeostasis tisular es mucho menos conocido que en la cicatrización de heridas. Una razón importante es la falta de herramientas apropiadas para estudiar estos efectos en tejidos intactos. El dispositivo microfluídico para galvanotaxis no es adecuado para este propósito debido a su geometría, que solo admite corrientes eléctricas en el plano. En el contexto de la homeostasis epitelial, se necesita un nuevo dispositivo para controlar y perturbar el TEPD o las corrientes fuera del plano a través de una capa epitelial confluente. Para lograr el objetivo de aplicar una densidad de corriente iónica relativamente uniforme a través de una monocapa, hemos diseñado y fabricado un dispositivo microfluídico con innovaciones en la geometría del dispositivo, el uso de materiales y las capacidades de medición biomecánica in situ 4. Esta última capacidad es importante ya que los efectos eléctricos pueden estar afectando el comportamiento celular a través del acoplamiento con vías biomecánicas y mecanobiológicas, que se pueden estudiar con esta característica.

Este nuevo dispositivo exhibe múltiples características innovadoras. Está diseñado con dos capas en lugar del canal único que se encuentra en los dispositivos de galvanotaxis (innovación en geometría), manteniendo la conexión a las cámaras de electrodos similar a la de estas últimas. La primera capa microfluídica tiene canales para dirigir las corrientes iónicas hacia (o lejos de) la región del tejido, mientras que la segunda capa tiene una abertura que dirigirá esta corriente perpendicularmente a través del epitelio que se encuentra encima de esta segunda capa microfluídica (Figura 1A, B). Las técnicas de microfabricación se utilizan para producir capas suficientemente delgadas como para que sea posible obtener imágenes confocales de alta resolución a pesar del apilamiento de capas microfluídicas que aumenta el grosor de la muestra. Para las otras innovaciones importantes, se incorpora un hidrogel sintético de poliacrilamida (PA) en el centro del dispositivo, que juega un papel crucial (Figura 1A, B). Las propiedades físico-químicas de este gel, como la química disponible para recubrir las proteínas de la matriz extracelular, la permeabilidad a los iones, así como la elasticidad conocida, son respectivamente esenciales para la unión y el crecimiento celular, la aplicación de corrientes fuera del plano y la medición del estrés mecánico20 durante la estimulación eléctrica. Las estructuras de barrera se incorporan en la Capa 1 de la región tisular para el confinamiento de la solución precursora del gel PA, como se hizo en dispositivos microfluídicos anteriores21 (Figura 1A, B). Por último, pero no menos importante, dado que la polimerización en gel de PA es inhibida por oxígeno en superficies PDMS permeables al gas oxígeno, se utiliza otro material22 para la fabricación de dispositivos, que puede permitir la polimerización y la unión estrecha del gel de PA. Todas las características innovadoras son cruciales para que el nuevo dispositivo funcione.

En general, el estudio en profundidad de las señales bioeléctricas estáticas o de variación lenta en la homeostasis de tejidos intactos es posible con este nuevo dispositivo, cuyo protocolo se detallará a continuación. El protocolo y los resultados a los que se hace referencia aquí se centran en la línea celular epitelial Madin Darby Canine Kidney II (MDCK II), incluidos los eventos celulares (proliferación, muerte, extrusión y migración) y los cambios estructurales tisulares inducidos por la corriente eléctrica. Estos estudios también son instructivos para los investigadores que estén interesados en aplicar esta técnica para estudiar la regulación eléctrica del transporte epitelial y la inducción de eventos celulares y cambios en el destino celular en capas celulares y sistemas más complejos, como células primarias y organoides 2D.

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Protocolo

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NOTA: Este protocolo proporciona pasos para construir una configuración que aplique corrientes eléctricas estáticas y perturbe el TEPD del epitelio confluente y para estudiar sus efectos a través de imágenes de células vivas y técnicas de mecanobiología (Figura 1). La configuración consiste en dispositivos hechos de chips microfluídicos unidos a cartuchos, insertos y soportes para albergar múltiples dispositivos para experimentos multiplexados en un microscopio, un par de cámaras de electrodos conectadas a un medidor fuente y dispositivos, y una tapa de cámara de células vivas para el mantenimiento de las condiciones adecuadas de células vivas (Figura 1C). Los principios de diseño y los dibujos del archivo CAD del cartucho y otros componentes importantes de la configuración se pueden encontrar en el Archivo complementario 1. Los pasos incluyen: 1) litografía blanda PDMS; 2) Fabricación de chips y ensamblaje de dispositivos; 3) Finalización de la configuración; y 4) Crecimiento monocapa y experimentos con células vivas. La información detallada sobre los reactivos y materiales utilizados en este protocolo se proporciona en la Tabla de materiales.

1. Litografía blanda PDMS

NOTA: Esta sección detalla la producción de elastómeros PDMS a partir de obleas SU-8 (Figura 2A, B) para moldear capas a base de adhesivo curables por UV del chip microfluídico.

  1. Litografía blanda PDMS
    1. Fabrique una oblea separada basada en SU-8 para cada capa microfluídica, Capa 1 y 2, utilizando técnicas de fotolitografía (Archivo complementario 2 y Archivo complementario 3).
      NOTA: La fabricación de obleas puede demorar un mes si se envía una solicitud a una instalación de microfabricación / sala limpia. También se puede utilizar la técnica de grabado de silicio para la fabricación de obleas.
    2. Silanizar la oblea de silicio para permitir el desmoldeo de PDMS19.
      1. Limpie la oblea con una pistola de aire comprimido de nitrógeno a presión. Active la superficie de la oblea aplicando un proceso corto de plasma de oxígeno (30 s, 30 W en un flujo de gas de 20 sccm O2 a una presión de reactor de 1-3 mbar)23.
      2. Pipetear 200 μL de tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctil-1-triclorosilano en un tapón de plástico limpio (diámetro 60 mm, altura 15 mm). Coloque la tapa junto a la oblea en el desecador al vacío (solo para silanización). Encienda la bomba de vacío y espere 1-2 h, mientras el silano vaporizado se deposita como una monocapa sobre la oblea de silicio.
        PRECAUCIÓN: El silano es corrosivo y tóxico. Use guantes y gafas de seguridad, y opere en una campana extractora para garantizar una operación segura.
        NOTA: Se puede usar una oblea recién silanizada para fabricar de 10 a 20 piezas de moldes PDMS. El tiempo de vacío depende del estado de la bomba de vacío. La silanización excesiva provoca un espesor desigual y da como resultado una apariencia turbia, que debe evitarse. Guarde las obleas en cámaras con humedad controlada cuando no estén en uso. Las estructuras PDMS hechas de nuevas obleas se pueden verificar mediante microscopía electrónica de barrido (SEM).
    3. Mezcle bien suficiente resina base PDMS y agente reticulante (w: w = 10: 1 y 70-80 g) durante unos minutos en una placa de Petri (diámetro 150 mm, altura 25 mm). Asegúrese de que se formen pequeñas burbujas de manera uniforme en la mezcla, lo que confirma una buena mezcla. Transfiera la mezcla a tubos de centrífuga de 50 ml y centrifugue a 550 x g durante 3 minutos para eliminar completamente las burbujas de aire.
      NOTA: El líquido PDMS es pegajoso y difícil de limpiar; Tenga cuidado al verter. Limpie con isopropanol si las superficies de la mesa están contaminadas por una mezcla de PDMS derramada.
    4. Vierta suavemente la mezcla de PDMS sobre la oblea en un plato de plástico o vidrio (diámetro 150 mm, altura 25 mm) con un fondo plano, luego empuje hacia abajo la oblea para purgar PDMS de la parte inferior de la oblea. Desgasificar la mezcla con una bomba de vacío.
      NOTA: Es importante purgar el PDMS líquido del fondo de la oblea; una capa gruesa de PDMS en la parte inferior dificulta la extracción de la oblea del plato de plástico, lo que aumenta la probabilidad de que la oblea se rompa. Alternativamente, se puede cortar el PDMS a lo largo del borde de la oblea y mantener la oblea en la placa de Petri. Asegúrese de que el grosor del PDMS sea de aproximadamente 1,5 mm para la capa 1 para garantizar la flexibilidad del molde en los pasos de fabricación posteriores. Asegúrese de que el grosor del PDMS sea de aproximadamente 2,5 mm para la capa 2 para reducir la probabilidad de que se hunda en los pasos posteriores de fabricación. El espesor del PDMS se mide con una regla después de cortar los moldes del PDMS en las formas necesarias.
    5. Cure el PDMS en un horno a 80 °C durante 2 h y asegúrese de que el plato se coloque lo más horizontalmente posible durante el proceso. Deje que el molde y la oblea PDMS se enfríen a temperatura ambiente. Retire con cuidado el molde PDMS en su totalidad de la oblea con una cuchilla quirúrgica afilada y pinzas acolchadas.
      NOTA: Tenga cuidado de no rayar la superficie de la oblea. Compruebe si se forman restos de PDMS en la superficie de la oblea cuando se despega el PDMS. Esto indica que la superficie de la oblea debe volver a silanizarse.
    6. Corte el molde PDMS en bloques que contengan las características de interés y almacene estos bloques en placas de Petri limpias (diámetro 150 mm, altura 25 mm) o en una cámara de vacío cuando no esté en uso. Manipule el molde PDMS sin tocar las características esenciales.

2. Fabricación de chips y ensamblaje de dispositivos

NOTA: Utilice un polímero curable con UV de baja viscosidad (rango máximo de absorción UV de 350-380 nm) para fabricar el chip microfluídico mediante moldeo PDMS. El adhesivo curable con UV permite la integración del hidrogel de poliacrilamida (PA) como sustrato celular transparente, permeable a los iones y elástico. Las propiedades del gel PA lo respaldan como un sensor de estrés mecánico tisular que permite la obtención de imágenes de células vivas y la estimulación de corriente estática. El chip finalmente se conectará a un cartucho que alberga el medio de cultivo y se conecta a las cámaras de electrodos.

  1. Preparación de la base de cubreobjetos de vidrio
    1. Marque la cantidad requerida de cubreobjetos de vidrio rectangulares (170 μm) con un cortador de diamante a un tamaño de 37 × 24 mm2, para adaptarse a las dimensiones del cartucho (Archivo complementario 4).
      NOTA: El cubreobjetos tiene un grosor de 170 μm compatible con imágenes de alta resolución, pero es frágil y requiere un manejo cuidadoso. Use guantes y protección para los ojos. Deseche los cubreobjetos de vidrio rectangulares inmediatamente si aparecen grietas visibles, ya que las astillas de estos cubreobjetos de vidrio rectangulares pueden presentar un riesgo de fugas. Alternativamente, solicite cubreobjetos del tamaño correcto a los fabricantes de cubreobjetos. Evite tocar las superficies de los cubreobjetos de vidrio rectangulares con las manos desnudas y deje manchas que puedan deteriorar la calidad de la imagen.
    2. Coloque los cubreobjetos rectangulares en una placa de Petri limpia sin superponerlos y transfiéralos a una cámara de plasma. Inducir una condición de vacío, pero dejar entrar un poco de aire al final. Active las superficies de los cubreobjetos de vidrio rectangulares utilizando plasma de aire (30 s a 5 min, 29,6 W, dependiendo del estado del equipo)
      NOTA: Solo se deben usar los lados completamente expuestos al plasma (es decir, las superficies superiores) en el paso siguiente (paso 2.1.3). Complete el paso 2.1.3 dentro de los 30 minutos posteriores a la exposición al plasma. La cámara debería aparecer como rosa-púrpura en esta etapa si se ha generado plasma de aire. Si los últimos pasos de unión tienen éxito, reduzca la duración del plasma para mayor comodidad.
    3. Prepare 10 ml de solución de tratamiento de superficies hecha de ácido acético al 0,3% y metacrilato de 3-(trimetoxisilil)propilo al 0,5% disuelto en etanol al 100%. Trate los cubreobjetos de vidrio rectangulares con esta solución en una placa de Petri (diámetro 150 mm, altura 25 mm) durante 5 minutos en un agitador, para permitir una buena unión con capas microfluídicas a base de adhesivo curable por UV. Asegúrese de que los cubreobjetos rectangulares de vidrio estén completamente sumergidos en la solución y que ambos lados estén tratados.
      PRECAUCIÓN: La solución de tratamiento de superficies es corrosiva. Manéjelo en una campana extractora.
    4. Enjuague los cubreobjetos de vidrio rectangulares con etanol al 100% tres veces, sin dejar que se sequen durante el proceso. Seque los cubreobjetos rectangulares de vidrio uno a uno con gas nitrógeno y una pistola de soplado. Asegure una velocidad de soplado suficiente que elimine limpiamente las gotas de líquido de las superficies de la base del cubreobjetos, evitando manchas de líquido. Guarde los cubreobjetos de vidrio rectangulares en una placa de Petri limpia (diámetro 150 mm, altura 25 mm).
      NOTA: Use una pistola de soplado para dirigir el flujo de aire paralelo a las bases de cubreobjetos y evite usar una velocidad de soplado excesiva para evitar que los vidrios se rompan.
  2. Fabricación de capa 1 (Figura 2C)
    1. Coloque y aplana un molde PDMS de capa 1 limpio, boca arriba, sobre una tapa de plato de plástico limpia (diámetro 60 mm, altura 15 mm). Pipetear 500 μL de adhesivo líquido curable con UV sobre el molde lentamente, humedeciendo cuidadosamente todas las estructuras sobresalientes con la ayuda de una espátula. Elimine las burbujas de aire debido al proceso de humectación.
      NOTA: Los moldes limpios de PDMS se pueden preparar usando cinta adhesiva para eliminar el polvo o los restos de adhesivo curables por UV, o limpiando con etanol. Para precaución adicional, mantenga los moldes PDMS en cámaras de vacío cuando no estén en uso.
    2. Presione suavemente el cubreobjetos sobre el molde PDMS. Evite que el exceso de adhesivo curable por UV humedezca la parte superior del cubreobjetos, ya que los restos de adhesivo curable por UV pueden impedir un cubreobjetos limpio y plano. Elimine el exceso de adhesivo curable con UV con paños de laboratorio.
      NOTA: Es fundamental asegurarse de que las características del molde PDMS transferido a la capa adhesiva curable por UV se alineen con el cartucho al que se unirá. Para ello, marque el cubreobjetos con un rotulador soluble donde se ubicarán los centros de los pocillos del cartucho (tres de ellos). Utilice estas marcas para alinear el cubreobjetos con las características del molde PDMS al presionar el cubreobjetos de vidrio rectangular hacia abajo.
    3. Cure parcialmente la estructura bajo una luz UV iluminada uniformemente (363-370 nm, 224 mW / cm2) durante 10 s. Limpie las marcas con etanol al 75% más tarde. Sostenga la estructura firmemente sobre una superficie plana y retire lentamente el molde PDMS de la capa 1.
      NOTA: El curado parcial permite la formación de una capa adhesiva curable con UV suficientemente sólida, lo que permite el pelado del molde PDMS en esta etapa. Esto también facilita la unión con una capa 2 parcialmente curada en los pasos posteriores para la fabricación de una estructura adhesiva curable con UV de dos capas. El molde PDMS de capa 1, que se preparó con un espesor de 1,5 mm (paso 1.2.4), garantiza una flexibilidad de PDMS suficiente que reduce la probabilidad de que el cubreobjetos delgado se rompa durante el proceso de pelado. El molde PDMS se puede reutilizar hasta diez o veinte veces, después de lo cual puede haber una capa blanquecina de restos adhesivos curables por UV en la superficie de PDMS, lo que reduce el grosor de la estructura. Utilice nuevos moldes PDMS en este caso.
  3. Fabricación de capa 2 (Figura 2D)
    1. Coloque un molde de PDMS de capa 2 limpio, boca abajo, sobre una losa plana de PDMS (espesor de losa de > 2,5 mm para garantizar una alta rigidez). Toque suavemente las funciones desde arriba con una pinza. Observe la interfaz para ver si hay oscurecimiento o contraste óptico debajo de las características, esto indica un contacto adecuado.
      NOTA: Los pilares de soporte que rodean las características principales (dos aberturas redondas y una hendidura) son cruciales para evitar que la superficie del molde PDMS se hunda.
    2. Rellene el espacio entre el molde y la losa de PDMS con adhesivo líquido curable por UV mediante efecto capilar. Curar parcialmente la estructura bajo luz ultravioleta (363-370 nm, 224 mW/cm2) durante 10 s.
    3. Despegue suavemente la capa adhesiva compuesta curable con UV y el molde PDMS de la losa PDMS con una pinza acolchada suave. Recorte el exceso de bordes de la capa adhesiva curable con UV con unas tijeras afiladas si es necesario.
  4. Unión de capas 1 y 2 (Figura 2E)
    1. Coloque la capa 1 unida a un cubreobjetos de vidrio rectangular sobre una superficie plana. Alinee la Capa 2 (aún unida a su molde PDMS) con la Capa 1 y presione ambas capas con firmeza, asegurándose de que aparezcan "sombras" debajo de las características.
    2. Cure la estructura bajo luz ultravioleta (363-370 nm, 224 mW / cm²) durante 10 s para unir las capas 1 y 2, que forman la estructura de dos capas del chip microfluídico. Despegue suavemente el molde PDMS del chip.
      NOTA: Para garantizar el pelado exitoso del molde PDMS del chip, use pinzas para separar cada pilar de soporte PDMS de la capa 2 de adhesivo curable por UV en el paso 2.4.1. Esta acción ayuda a reducir la adhesión general entre el molde PDMS y la capa 2, que es importante para el pelado.
  5. Integración en gel de poliacrilamida (Figura 2F)
    NOTA: Antes de esta sección, prepare tantos chips como sea necesario para un experimento multiplexado.
    1. Prepare la solución precursora del gel de PA mezclando suavemente los ingredientes de la tabla siguiente, correspondientes a la rigidez del gel de PA de elección24 (consulte la Tabla 1). Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire durante el pipeteo, ya que el oxígeno inhibe la gelificación.
      PRECAUCIÓN: TEMED y APS son tóxicos. Trabaje en una campana extractora y use guantes.
      NOTA: Se requiere un pipeteo y una manipulación cuidadosos, ya que se trata de pequeños volúmenes de líquidos (1 μl de TEMED por 1 ml de solución precursora de gel de PA). La rigidez del gel puede influir en el comportamiento celular, como se muestra en muchos estudios de mecanobiología. Elija la rigidez más adecuada para sus experimentos. Las perlas fluorescentes sirven como marcadores fiduciales para la deformación del gel y la inferencia de tensión mecánica. Solución de perlas de vórtice antes de pipetear la solución en la solución precursora de gel de PA. Se recomienda no mezclar el TEMED de pequeño volumen al final, ya que las soluciones precursoras de gel de PA comienzan a gelificarse cuando se agregan ambos iniciadores y los volúmenes pequeños son difíciles de mezclar bien durante este corto tiempo.
    2. Pipetear inmediatamente 10 μL de la solución precursora de gel PA en el centro de la región del tejido y encima de la hendidura de la capa 2 (Fig. 1B, 2F). Presione suavemente con un cubreobjetos de vidrio redondo (diámetro 10 mm) para formar un gel plano. Observe cómo la solución de PA fluye hacia la capa 1 a través de la rendija y deténgase en la fila de pilares de barrera.
      NOTA: El volumen de 10 μL de solución precursora de gel de PA produce un gel de 100 μm de espesor por encima de la capa 2. Cambie este volumen según el grosor del gel requerido. Pipetee la solución en el chip lo antes posible, ya que la solución de PA comienza a polimerizarse una vez que se agregan los iniciadores. Presione la solución con la cantidad correcta de fuerza para evitar que la solución se desborde a través de los pilares de la barrera y bloquee el canal. Deseche el chip si los canales están bloqueados. Para geles blandos con una rigidez de 5 kPa o menos, use repelente al agua de vidrio para tratar los cubreobjetos de vidrio redondos para que los cubreobjetos sean hidrofóbicos. En particular, sumerja los cubreobjetos en vidrio repelente al agua durante 5 minutos, enjuague con etanol al 100% 3 veces y seque con gas nitrógeno. Esto facilita el despegado del cubreobjetos del gel polimerizado más tarde sin destruir el gel.
    3. Cure inmediatamente el chip microfluídico bajo luz ultravioleta (363-370 nm, 224 mW / cm2) durante 5 min. Espere al menos ~ 1 h para que el gel PA se solidifique por completo.
      NOTA: Esto curará completamente el chip y permitirá que el gel de PA polimerizado se adhiera a la estructura. Los pasos 2.5.1, 2.5.2 y 2.5.3 deben completarse en rápida sucesión.
    4. Incube bien el chip en HEPES (0,1 M, pH 7,4) durante al menos 1 h o más para humedecer el gel y aflojar la adhesión entre el cubreobjetos y el gel. Retire suavemente el cubreobjetos con unas pinzas afiladas.
      NOTA: Para geles más blandos con una rigidez de 5 kPa o menos, aumente el período de incubación hasta 10 h en un agitador para garantizar una extracción limpia del vidrio de cobertura del gel sin alterar la estructura del gel. A veces, se pueden formar patrones estructurales de varias decenas y cientos de micrómetros entre la base rectangular del cubreobjetos y la capa 1 a base de adhesivo curable por UV. Estos patrones pueden interferir con las imágenes de campo claro, pero tienen efectos mínimos en las imágenes de fluorescencia. Esto se puede mejorar mediante la activación por plasma de cubreobjetos rectangulares como en el paso 2.1.2.
  6. Unión de chips y cartuchos (Figura 2F)
    1. Coloque un cartucho de policarbonato de grado médico limpio (Archivo complementario 4) sobre una superficie plana, con la parte inferior hacia arriba. Seque el gel en el chip con toallitas de laboratorio desde el costado. Alinee el chip, boca abajo, con el cartucho.
      NOTA: Al probar nuevos diseños de cartuchos, se pueden utilizar métodos de mecanizado o impresión 3D. Cuando se establece el diseño, se puede utilizar el moldeo por inyección para producir grandes cantidades del cartucho.
    2. Pipetee el adhesivo curable con UV en las grietas entre el chip y el cartucho, que se llenarán mediante efecto capilar. Curar con luz UV (363-370 nm, 224 mW/cm2) durante 5 min.
      NOTA: Tenga cuidado de evitar que el adhesivo curable con UV se desborde en los canales o en el otro lado de la base del cubreobjetos.
  7. Eliminación de la solución de PA no polimerizada
    1. Use un tapón PDMS y una jeringa para extraer aproximadamente 5 ml de HEPES (0,1 M, pH 7,4) a través de los canales de eliminación de desechos para eliminar la solución precursora de gel de PA no polimerizada que es tóxica para las células.
    2. Incube el gel en el dispositivo con 2 ml de HEPES (0,1 M, pH 7,4) por dispositivo y colóquelo en un agitador durante 1-2 días, para garantizar la eliminación completa de la solución precursora de gel de PA no polimerizada.

3. Finalización de la configuración

NOTA: Con los dispositivos fabricados, complete la configuración (Figura 1C) recubriendo el gel PA con proteína ECM para la siembra celular, conectando los dispositivos a la cámara de electrodos para estimulación eléctrica y colocando los dispositivos en insertos, soportes y una tapa de cámara de células vivas para experimentos de imágenes de células vivas multiplexados.

  1. Preparación de componentes esterilizados
    1. Todos los componentes de la configuración que no sean el dispositivo (Tabla de materiales) deben sonicarse en el siguiente orden: primero en agua jabonosa durante 30 min, luego en agua MQ durante 30 min y finalmente en etanol al 75% durante 30 min. Después de eso, sécalos en un horno a 60 °C y trátalos con luz UV a 200-280 nm en un gabinete de bioseguridad durante 30 min para lograr la esterilización.
  2. Funcionalización del gel PA con proteína ECM
    1. Esterilice los dispositivos con luz ultravioleta (200-280 nm) en un gabinete de bioseguridad.
    2. Prepare la cantidad requerida de 50 μg/ml de solución de trabajo de colágeno I en 1x DPBS con hielo.
      NOTA: Mantenga el stock de colágeno I en hielo para evitar la gelificación. Se requieren 100-150 μL de solución de trabajo de colágeno I para cada dispositivo para sumergir completamente el gel. Pipetea suavemente las soluciones de colágeno I para evitar la formación de fibra.
    3. Prepare la cantidad requerida de solución de trabajo Sulfo-SANPAH (SS) en hielo. Cada tratamiento en gel requiere aproximadamente 80 μL de solución de trabajo SS, donde 2 μL de solución madre SS (disuelta en DMSO anhidro) se diluyen en 80 μL de HEPES frío (de refrigerador de 4 °C, 0,1 M, pH 7,4).
      NOTA: SS es sensible a la humedad; Evite la condensación de humedad en el producto equilibrando los viales de stock a temperatura ambiente antes de abrirlos. Utilice SS sin peso para obtener el mejor rendimiento y prepare las existencias en DMSO anhidro. Úselo lo antes posible. Se utiliza un tampón HEPES frío para reducir la tasa de hidrólisis de SS en preparación para la solución de trabajo de SS. Cada gel requiere dos tratamientos con la solución de trabajo SS para garantizar que la superficie del gel de PA se funcionalice bien.
    4. Seque el gel en el dispositivo frotando con toallitas de laboratorio en los bordes del gel. Pipetear 80 μL de solución de trabajo SS sobre el gel, asegurando que la superficie del gel esté completamente sumergida con solución SS. Tratar el gel con UV (363-370 nm, 24,5 mW/cm2) durante 5 min para activar el SS. Enjuagar 3 veces con HEPES frío (0,1 M, pH 7,4).
      NOTA: Pipetee con cuidado SS en el centro del cartucho para evitar que SS sea atraído por la pared.
    5. Repita el paso 3.2.4, pero enjuague tres veces con 1x DPBS frío al final.
      NOTA: Los pasos 3.2.3 a 3.2.5 deben realizarse en rápida sucesión para evitar la hidrólisis de SS. El gel enjuagado debe aparecer como un tono rojo más oscuro en esta etapa si la activación de la superficie por SS es exitosa.
    6. Pipetear 100 μL de solución de colágeno I en gel PA, asegurándose de sumergir completamente el gel. Incube a temperatura ambiente durante 1 h, luego enjuague el colágeno no adherido con 1x DPBS tres veces. Sumerja el gel en 1x DPBS antes de usarlo.
      NOTA: La muestra recubierta de colágeno I se puede almacenar en un refrigerador a 4 ° C durante algunos días.
  3. Conexión de dispositivos a cámaras de electrodos
    1. Fije los dispositivos a los insertos con tornillos (Figura 1C, tipo de tornillo: M3 X 10 mm). A continuación, fije hasta cuatro conjuntos de inserto de dispositivo al soporte diseñado para el montaje en una platina de microscopio (tipo de tornillo: M3 X 5 mm).
      NOTA: Si no se utiliza el número máximo de conjuntos de inserto de dispositivo, se recomienda llenar todas las demás ranuras de soporte con dispositivos vacíos para sellar el espacio de modo que se puedan preservar buenas condiciones de células vivas para los experimentos de imágenes posteriores. Los dispositivos vacíos se pueden fabricar simplemente uniendo cartuchos a cubreobjetos de vidrio rectangulares desnudos.
    2. Llene los dispositivos con medio de cultivo (DMEM ++, 2 ml en cada uno de los pocillos principales). Además, extraiga 2 ml de medio a través de los canales de eliminación de desechos para enjuagar y reemplazar el 1x DPBS.
    3. Prepare dos tubos de 50 ml con tapas que tengan orificios pasantes para funcionar como cámaras de electrodos. Cree orificios del tamaño y la cantidad adecuados para que se ajusten de forma segura a los electrodos de platino y los tubos Tygon, conectando las cámaras de electrodos a los dispositivos. Llene cada cámara de electrodos con 45 ml de medio de cultivo.
      NOTA: Se pueden crear fácilmente agujeros en las tapas con cuchillas quirúrgicas afiladas.
    4. Prepare la conexión entre las cámaras de electrodos y los dispositivos: Conecte dos conectores de tubería a cada dispositivo. Coloque un clip de tubería en cada tubería Tygon (Figura 1C). Tire del medio de cultivo a través de los tubos con una jeringa y sujételos firmemente. Conecte un extremo del tubo de llenado medio a la cámara del electrodo y el otro al dispositivo.
      NOTA: Reduzca la probabilidad de aparición de burbujas en la tubería utilizando medio precalentado y/o desgasificando el medio en una cámara de vacío. Evite que se formen burbujas de aire en la interfaz entre la tubería Tygon y el conector de la tubería, pellizque los extremos de la tubería para abultar la superficie del medio antes de sumergirla en el medio en el tubo, o haga una conexión física a los conectores de la tubería.
    5. Ajuste las alturas relativas entre las superficies del medio de cultivo en los dispositivos y las cámaras de electrodos con un conector de laboratorio. Suelte los clips de tubería y deje que todas las superficies medianas se equilibren a la misma altura.
      NOTA: Recuerde sujetar los clips de los tubos cada vez que se mueva toda la configuración para evitar el desbordamiento de fluidos.
    6. Realice un control de calidad midiendo la resistencia de cada dispositivo por separado utilizando un medidor de fuente eléctrica.
      NOTA: Asegúrese de soltar solo el clip de tubo del dispositivo para el que se está midiendo la resistencia, mientras mantiene los clips de los otros dispositivos conectados en paralelo bien sujetos.

4. Crecimiento monocapa y experimentos con células vivas

NOTA: Para formar una monocapa confluente adecuada y lograr una densidad de corriente eléctrica uniformemente distribuida que depende de la confluencia y resistencia eléctrica de la monocapa. Luego, asegúrese de que las condiciones adecuadas de las células vivas en un microscopio para obtener imágenes a largo plazo y experimentos de estimulación eléctrica.

  1. Crecimiento monocapa
    1. Separe las células MDCK usando tripsina de los matraces T25. Centrifugar y contar el volumen medio necesario para obtener 0,1 millones de células. Suspenda este número de células y mézclelas bien en medio de 2 ml en tubos de centrífuga.
    2. Pipetee todo el medio cargado de células en el pocillo sobre la región del tejido. Deje que las células se sedimenten durante 15 minutos antes de transferir lentamente toda la configuración a una incubadora de cultivo de tejidos.
      NOTA: Para cada dispositivo, una densidad de siembra de 0,1 millones de células corresponde a 0,06 millones de células por centímetro cuadrado (6 × 104 células/cm2). Esta densidad de siembra es lo suficientemente escasa y las células crecen durante 2 días antes de alcanzar un estado confluente. Este proceso asegura una monocapa homogénea y correctamente polarizada, sin necesidad de enjuagar el exceso de células sueltas que corren el riesgo de perturbar el tejido. Es importante dejar el paso de sedimentación sin perturbar para que haya una siembra uniforme de las células.
    3. Deje que las células crezcan en la incubadora (37 °C, 5% de CO2, 90% de humedad) durante 72 h para alcanzar una densidad celular de >~50 células/100 μm2. Verifique diariamente en un microscopio de sobremesa, con contraste de fase, para monitorear el proceso de crecimiento.
      NOTA: Con este número de células sembradas, las células MDCK habrán alcanzado una confluencia del 70% al 80% después de 24 h, una confluencia completa después de 48 h y un mayor aumento de la densidad celular y la maduración del tejido hasta 72 h. Después de 24 h, la longitud media de la célula es de unos 10-20 μm. A las 48 h, las uniones célula-célula y el cuerpo celular tienen un contraste claro bajo imágenes de contraste de fase. Este contraste se reduce drásticamente después de 72 h.
  2. Imágenes de células vivas
    1. Elija un microscopio de epifluorescencia o confocal según las necesidades experimentales. Cuando las células se expresan o se tiñen con marcadores fluorescentes, elija confocal para la observación tridimensional de la forma celular y las deformaciones del sustrato de gel. Para la observación bidimensional, elija el contraste de fase y la epifluorescencia, que producen menos fototoxicidad. Encienda el sistema de células vivas 1 h antes de llevar la configuración al microscopio, permitiendo que la incubadora de la platina del microscopio se estabilice a 37 °C, 5% de CO2 y 90% de humedad.
      NOTA: El controlador del sistema de células vivas muestra las condiciones en la incubadora de la parte superior de la platina y emitirá una advertencia cuando las condiciones no sean óptimas. Dado que la tapa de la incubadora de la platina es diferente de la comercial debido a la necesidad de acomodar tubos del dispositivo que se extienden hacia afuera, el sistema necesita recalibración para garantizar buenas condiciones de células vivas para experimentos a largo plazo (desde unos pocos días hasta una semana). La calibración se puede realizar según el manual del usuario, y las posiciones de los sensores deben mantenerse iguales en los experimentos que en las condiciones de calibración. Verifique la velocidad de evaporación del medio en la incubadora de la parte superior del escenario y las condiciones de pH con medio infundido con rojo de fenol.
    2. Monte la configuración en el microscopio, con las cámaras de electrodos a los lados. Asegúrese de que la platina electrónica del microscopio tenga suficiente espacio para moverse y no chocar con las cámaras de electrodos. Asegúrese de que las alturas superficiales medias estén equilibradas y a la misma altura entre las de los dispositivos y las cámaras de electrodos.
      NOTA: La superficie media en los pocillos del dispositivo, donde se encuentra la región del tejido (Figura 1C), tiene un impacto significativo en las imágenes de campo claro y contraste de fase. El menisco causará un enfoque de luz no deseado. Asegúrese de que la superficie del medio sea plana en el borde del pozo, pero tenga en cuenta que la evaporación del medio en la cámara de células vivas conducirá a la distorsión de esta superficie plana después de algún tiempo. Para superar este problema, una solución es colocar un cubreobjetos de vidrio plano en contacto con la superficie del medio para aplanar esta superficie. Este cubreobjetos debe tener un área más pequeña que el pozo para que no obstruya el intercambio de gases, que es importante para el crecimiento celular. Otra opción es colocar capas de aceite mineral de grado de cultivo celular en el medio.
    3. Configurar software.
      1. Elija lentes de objetivo de 10x o 20x para obtener imágenes de tejido completo con un microscopio de epifluorescencia y lentes de objetivo de 30x (WD 0,8 mm, NA 1,05) para obtener imágenes confocales de mayor resolución.
      2. Para obtener imágenes de tejido completo, elija varias posiciones para cubrir el área rectangular en la región del tejido (Figura 1A, por ejemplo, 5 filas por 5 columnas, la fila central cubre la hendidura, mientras que las otras fuera de la hendidura). Elija los canales fluorescentes y de campo claro de acuerdo con las líneas celulares utilizadas en la parte de resultados (canal 488 para fluorescencia verde y canal 561 para fluorescencia roja). Elija un intervalo de tiempo de 1 h para reducir la fototoxicidad en este experimento de imágenes a largo plazo durante un máximo de unos días.
        NOTA: Se pueden elegir otras lentes de objetivo, como 4x, si se necesita una vista más amplia de todo el tejido.
  3. Estimulación eléctrica
    1. Verifique la cantidad de dispositivos, la resistencia relativa del dispositivo y la corriente eléctrica objetivo de cada dispositivo. Decida la corriente eléctrica total que se obtendrá durante unas horas hasta una semana en la configuración general.
    2. Fuente de una señal eléctrica en el modo de pinza de corriente. Para 3 dispositivos con la misma resistencia de canal, con un grupo de control (sin corriente eléctrica, clip de tubería sujeto), una condición de corriente apical a basal (AtB) y una condición de corriente basal a apical (BtA) (Figura 1D), suministre una corriente total de 20 μA con un medidor de fuente. Esto conduce a 10 μA suministrados para cada dispositivo con una densidad de corriente estimada ~ 10 μA / cm2 que es fisiológicamente relevante (más detalles en discusión).
      NOTA: El voltaje total es de alrededor de decenas de milivoltios, dependiendo de la longitud de la tubería Tygon. Dicha corriente eléctrica se puede suministrar continuamente durante unos días hasta una semana. El indicador rojo de fenol cambiará de color en las cámaras de electrodos (más ácido en la cámara con el electrodo positivo), pero no en la incubadora de la parte superior de la etapa, que está bien calibrada. Las células permanecerán sanas mientras las condiciones de las células vivas se mantengan bien. Los investigadores pueden cambiar el medio en la incubadora de la parte superior del escenario una vez cada dos días, y el medio en las cámaras de electrodos una vez cada pocos días. Sujete los clips de los tubos al cambiar las cámaras de electrodos para evitar el desbordamiento del medio. Como se mencionó en el paso 3.1.1, recuerde tener un dispositivo vacío para cubrir el espacio del soporte. Esto asegura que la cámara de células vivas esté en las condiciones adecuadas.

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Resultados

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Todos los resultados presentados aquí están adaptados de la publicación anterior4; Para obtener más detalles, consulte esta publicación.

Este protocolo permite la aplicación de una corriente iónica externa o campo eléctrico perpendicular al plano de las células o tejidos. Esta estimulación eléctrica perturba la diferencia de potencial eléctrico transepitelial endógeno (TEPD) y permite estudiar el papel de TEPD en el gobierno del comportamiento tisular. Siguiendo el prot...

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Discusión

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Este protocolo proporciona pasos detallados y lógica de diseño para fabricar un nuevo dispositivo microfluídico para realizar experimentos de perturbación de potencial eléctrico transepitelial y estudiar los efectos bioeléctricos a través de métodos de imágenes de células vivas y mecanobiología. La importancia de este método es obvia cuando se compara con otros métodos relacionados. Por ejemplo, un método relacionado utiliza un chip microfluídico simple con un diseño de un solo canal que...

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Divulgaciones

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Asegúrese de que todos los autores hayan revelado todos y cada uno de los conflictos de intereses.

Agradecimientos

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XJ, PX, FF y TBS agradecen las útiles conversaciones con el Dr. Xumei Gao, Xinru Yu y otros miembros del grupo del Laboratorio de Biofísica de Tejidos. Agradecemos al Centro de Servicios de Tecnología Personalizada (CTSF) de la Universidad de Westlake por ayudar con nuestro dibujo esquemático. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Educación de Westlake, el Laboratorio de Ciencias de la Vida y Biomedicina de Westlake y el Centro de Investigación para Industrias del Futuro (RCIF) de la Universidad de Westlake.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1x DPBSGibco14190144
Metacrilato de 3-(trimetoxisilil)propilo, TPMSigma2530850Almacenar bajo nitrógeno después de abrir.
Tubo Falcon de 50 mlCorning430829Perfore 4 orificios en la tapa del tubo falcon de 50 ml, para permitir que el electrodo y el tubo pasen a través de la tapa y se sumerjan en el medio. Para un conjunto de dispositivos microfluídicos, se necesitan al menos 2 tapas.
Ácido acéticoSinopharm10000208
Solución de acrilamida, 40%Sigma79061Nocivo
Bomba de aireLaboratorio OKOOKO-APComponente de la incubadora de la platina del microscopio
Persulfato de amonio, APSAladdinA112447
Cartucho--El cartucho está hecho a medida y el diseño se refiere a material complementario. La materia prima es PC Makrolon 2858 de grado médico, y aquí puede encontrar más detalles: https://solutions.covestro.com/zh/products/makrolon/2858_000000000000508397?SelectedCountry=US
Clips--Robert Clip, para tubing  de 4,5 mm de diámetro exterior. https://item.taobao.com/item.htm?id=18717491819&pisk=gAsj0ailDjcjqv-tCE2rVYReT5-1h8rFWA9OKOnqBnKv6A1RBjpxDchRepvBWczD0Ft1wQS2gt-v6c1NQi5NBGJOfnjPucR4ih6OThNUTkrFntYBXWPETzI4tHpikchwH3nJbds8Mz2dntxMXYlT8aBmCOO1qfp968tJCdc9XKnte89wBdK9MFh-ypdJXhdvkYpJBpn9HCnYF3pDKKhv6qK-edJXXCC9X86JZdt96bH_3dwJgtw2FbzzkyxCHQitXiEMlB_i7ci1TKLfXtd5zaSWhEOpWac1uiCPBiSDrzgJjT7C1NCLaqRARp1W8ZNIc61DB6tV4jeJXFQP8E_7McOP0dTpXUMtXTtPPFsWvkhWEaBVWifjCcpc0M86tUwtjF-RYeQdGA2henpOsejatmAAB9jh8HZjtK_Rd3syxDRBL50sFem6FBy7FV0GhSGPYc782SYvEK__F8GxLEpkFBy7FV0MkLvf18wSMv5..&spm=a21xtw.29978518.0.0&skuId=3344063585144
Colágeno ICorning354236
Agua DI Milli-QMilli-Q-
Medio de cultivo Eagle's Medium modificado de Dulbecco, DMEM (glucosa alta)Gibco11965092DMEM++ es DMEM con un 10% adicional FBS (Sigma-Aldrich) y 100  unidades/ml de penicilina-estreptomicina (Gibco).
Jaula negra de la cajaLaboratorio OKOH201Componente de la incubadora de la platina del microscopio
Microscopio invertido de epifluorescenciaOlimpoIX83
Absoluto de etanolSinopharm10009218
Suero fetal bovinoSigmaF8318
Perlas fluorescentes, 0.1 μ L, rojo (580/605)TermoF8801
Cámara de gasLaboratorio OKOH201-PRIOR-SP200/400/600Componente de la incubadora de la platina del microscopio
Mezclador manual de gasLaboratorio OKO2GF-MEZCLADORComponente de la incubadora de la platina del microscopio
GeneticinaGibco10131027GFP– actina y H1– GFP MDCK se mantuvieron utilizando medios suplementados con 0.5  mg/ml de geneticina (Gibco) para mantener su expresión génica
HEPESSigma736459
IsopropanolSinopharm80109218
Toallitas KimwipesKimberly-Clark ProfesionalLH-70155Limpiador de laboratorio
Tornillo más largo--Tornillo de precisión de precisión cruzada de cabeza redonda niquelado, M3 x 10 mm. https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n
Conector microfluídico--Accesorio de unión recta de polipropileno, 1/16"-10-32UNF. https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=16&detail_redpacket_pop=true&id=555839592609<k2=1752310108435i7ldxj7ekdgu9qhnphlmj&ns=1&priceTId=2150470617523101021033708e1a4b&query=10-32unf%E8%9E%BA%E7%BA%B9%E7%9B%B4%E9%80%9A%E6%8E%A5%E5%A4%B4%20%E5%A1%91%E6%96%99%E5%A4%96%E8%9E%BA%E7%BA%B9%E6%8E%A5%E5%A4%B4&skuId=3600497427939&spm=a21n57.1.hoverItem.1&utparam=%7B%22aplus_abtest%22%3A%2245243a364caf5527e8392ded0656451a%22%7D&xxc=taobaoSearch
Soporte de placas multipocillosLaboratorio OKOH201-MW-HOLDER-NZ500Componente de la incubadora de la platina del microscopio
N',N'-metilenbisacrilamida, 2%Sigma110269Nocivo
NOA 73Productos Norland17-345Adhesivo curable por UV
Penicilina-estreptomicina, PS (10,000 U/mL)Gibco15140122
Placa de Petri (150 mm y aguda; 25 mm)Corning430599Resiste hasta al menos 80 ° C durante 2 h
Herramienta Pico PlasmaDiener Electronic GmbH + Co. KGPico PlasmaPara el tratamiento con plasma O2
Limpiador de plasmaHarrick PlasmaPDC-002Para tratamiento con plasma de aire
Plato de plástico (diámetro 60 mm, altura 15 mm)Nido705001
Electrodos de platinoTianjin Aida HengshengParte 005Diámetro 0,5 mm, longitud 37 mm 
Rain-X Original Vidrio Repelente al AguaProductos químicos ITW800002242
Cubreobjetos rectangularesMarienfeld0107222  1.5H, 24 &agudo; 50 mm2, 170 μ m de espesor
Cubreobjetos de vidrio redondoMarienfeld0111500  1.5H, redondo de 10 mm de diámetro
Tornillo más corto--Tornillo de precisión de precisión cruzada de cabeza redonda niquelado, M3 x 4 mm. https://item.taobao.com/item.htm?id=604899872494&pisk=gbX7s64OI40STNJKAQqqhx58y8d9NoyapDtdjMHrvLpJOvIP5HkeT7xIdEsTqUP3Zw1fJZAyyeRedH_wogkUqgrQdMI9yp5yzHQVRZcPz98FuJsG5QkPv9oliNStUTPkLv9kKpUa7RyZqgvHpfPM7c0okhx_LYdKpLvx7Uiz6RyNqiiy2lSYQ9Sp5stS9vQpwIpvqEhKe3QpMKKBkYKKeH3YcEYv24HKwxnvvh0K9wKdDnKkV03KeBKYHhYvJppdJiEXYELK1OzXm7TRVu-iUlqUdgsJlvHdeJAv5LhELvJw2Q6d2EsV0ttWNFRjAbyCeZSdUTA09X9h01_C9NUqaUC6fZONNPM55axdAHQ7IcTAFM6XZsoZBisfv1Rf3leMFLLRTLjEfzSfFaSlhMoKML9PGC6WBR0J8sS1dH63--_1vGfpG9g54UMw5pb-OMiidnTacoGntEWrjhPgtYw2wnxVQoZjPXAJmn1UcoGntQKDm2rbc4Gh.&spm=tbpc.boughtlist.suborder_itemtitle.1.494a2e8d0lg31n
Sulfo-SANPAH, sin pesoTermoA35395Solución madre de SS: 20 mg/mL en DMSO anhidro, 2 μ L para cada uno; Solución de trabajo de SS: 0,5 mg/mL de SS en HEPES (0,1 M, pH 7,4).
Kit de elastómero de silicona SYLGARD 184Dow CorningH052KCM147El producto final es polidimetilsiloxano, PDMS. Este kit incluye resina PDMS base y agente de reticulación.
Unidad de temperaturaLaboratorio OKOH201-UNIDAD T-BLComponente de la incubadora de la platina del microscopio
Tetrametiletilendiamina, TEMEDSigma110189Nocivo
Pantalla táctilLaboratorio OKOOKO-TOUCHComponente de la incubadora de la platina del microscopio
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctil-1-triclorosilanoSigma78560459
Tripsina-EDTA (0,25%)Gibco25200072
Tubos TygonTygonAJK00002Diámetro exterior (OD) = 3,2 mm, Diámetro interior (ID) = 1,6 mm
Limpiador ultrasónicoSupmileKD-300DE
Máquina de curado LED UVGHUVGHS-MFLGFuente de luz UV-LED, rango de emisión: 363– 370 nm, densidad de potencia máxima: 230 mW/cm2
Módulo humidificador sin vibracionesLaboratorio OKOHM-VFComponente de la incubadora de la platina del microscopio
VisiónVisitron Systems GmbH-Imagen de artículos más blandos
Capa de obleas1Universidad Nacional de Singapur, Instituto de Mecanobiología Instalación de microfabricación-La oblea está hecha a medida y el diseño se refiere a material complementario.
Capa de obleas2Universidad Nacional de Singapur, Instituto de Mecanobiología Instalación de microfabricación-La oblea está hecha a medida y el diseño se refiere a material complementario.

Referencias

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