Artículo de método

Disección de tejidos craneofaciales de pez cebra al teñirlos con azul alcián

DOI:

10.3791/68900

⸱

12 de septiembre de 2025

 , 
1Tata Institute of Fundamental Research

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo descrito aquí presenta un procedimiento simple y fácil de seguir para teñir y diseccionar cartílagos craneofaciales en una larva de pez cebra de 5 días de edad. Se puede utilizar para estudiar la anatomía, la forma y el tamaño de estas estructuras en diversas condiciones de desarrollo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El pez cebra, dada su transparencia óptica, es un excelente modelo de vertebrados para estudiar los mecanismos por los que se forman los cartílagos craneofaciales en el embrión. Los cartílagos craneofaciales se pueden clasificar ampliamente en dos grupos, el neurocráneo y el viscerocráneo, que a su vez se pueden subdividir en numerosos grupos de cartílagos necesarios para sostener el cerebro y constituir el aparato alimentario y respiratorio, entre otros. Este protocolo describirá primero un procedimiento de tinción simple y establecido en pez cebra para visualizar estos grupos de cartílago, seguido de una metodología para diseccionar y separar el neuro y el viscerocráneo. A partir de estas disecciones, se pueden obtener fácilmente métricas simples de forma y tamaño, y en este protocolo, esto se demuestra para el paladar, que es parte del neurocráneo anterior, un tejido a menudo afectado en la mayoría de los trastornos craneofaciales en humanos. El protocolo se puede replicar de manera sencilla incluso en entornos de recursos limitados, lo que proporciona una valiosa herramienta educativa para que los estudiantes de pregrado se introduzcan en la morfología craneofacial.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El cartílago craneofacial en vertebrados emerge de una población celular multipotente llamada células de la cresta neural craneal1. Estas células se especifican primero en los márgenes dorsales de la placa neural en embriones tempranos, que luego migran grandes distancias para llegar a la región craneofacial y los arcos faríngeos antes de diferenciarse 2,3. Los mecanismos de señalización que impulsan esta migración y diferenciación se conservan en gran medida entre los vertebrados 4,5. A pesar de esto, la organización, el tamaño y la forma de los elementos individuales del cartílago son distintos entre especies, lo que da lugar a diversas morfologías craneofaciales6. El pez cebra, en particular, se ha convertido en un poderoso sistema modelo para estudiar la morfogénesis craneofacial, dada la naturaleza transparente de los embriones hasta las etapas larvarias. Utilizando procedimientos simples de tinción para marcar el cartílago, la morfología de muchas estructuras craneofaciales en el pez cebra se ha caracterizado bajo diferentes perturbaciones en las vías de señalización 7,8,9, así como cuando los embriones o larvas están expuestos a contaminantes comunes presentes en el medio ambiente10. La tinción con azul alcián descrita aquí para marcar el cartílago implica el uso de condiciones no ácidas estandarizadas por Walker y Kimmel11, que ha sido utilizada posteriormente por muchos laboratorios de peces cebra que trabajan en el desarrollo craneofacial 5,12,13,14,15,16,17,18,19 , incluida la descripción del uso en entornos de escuela secundaria20. La tinción sin ácido conserva intactas las estructuras óseas, lo que permite teñir el cartílago y los huesos juntos con azul alcián y rojo de alizarina, respectivamente. Sin embargo, falta un protocolo detallado para la tinción, así como para realizar una disección precisa de los cartílagos craneofaciales, especialmente para ayudar a que dichos estudios se realicen en entornos con recursos limitados.

Aunque la estructura esquelética facial en el pez cebra adulto es bastante compleja, consta de 43 huesos derivados del cartílago21, el cartílago craneofacial en una larva a los 5 días después de la fertilización (dpf), que acaba de adquirir la capacidad de alimentarse, es relativamente simple y se puede dividir ampliamente en un neurocráneo dorsal y un viscerocráneo ventral4. Estas estructuras sostienen el cerebro, contribuyen al aparato de alimentación y dan lugar a cartílagos de soporte para los tejidos branquiales. El protocolo descrito aquí permitirá teñir los cartílagos de pez cebra con azul alcián, seguido de un procedimiento detallado para diseccionar el neuro y el viscerocráneo en estructuras separadas, lo que finalmente permitirá una caracterización cuidadosa de la forma y el tamaño de varios cartílagos en estas estructuras. Como ejemplo, medimos las dimensiones de la región anterior del paladar (techo de la boca) llamada placa etmoidal, que es una parte del neurocráneo.

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Protocolo

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Los procedimientos experimentales y de mantenimiento del pez cebra utilizados en este estudio fueron aprobados por el comité institucional de ética animal, véase la referencia TIFR/IAEC/2023-1.

1. Preparación de reactivos

  1. Medios del E3:
    1. Preparar 50x caldo 1 mezclando 3,25 g de fosfato de sodio dibásico (0,458 mM Na2HPO4), 0,29 g de dihidrogenofosfato de potasio (0,042 mM KH2PO4), 11,93 g de cloruro de sodio (4,084 mM de NaCl) y 0,48 g de cloruro de potasio (0,128 mM KCl) en 1 L de agua destilada.
    2. Preparar 50x caldo 2 mezclando 2,43 g de cloruro de calcio (0,33 mM CaCl2) y 4,07 g de sulfato de magnesio (0,33 mM MgSO4) en 1 L de agua destilada.
    3. Para preparar 500 ml de 1 medio E3 y 480 ml de agua destilada, agregue 10 ml de cada uno de los aceites 1 y 2 (pH = 7,4).
      NOTA: Use guantes durante la preparación de estas soluciones.
  2. Paraformaldehído (PFA) al 4% en 1x PBS (solución salina tamponada con fosfato):
    1. Precalentar 100 ml de 1x PBS a 68 °C. Añadir 4 g de PFA e incubar la solución a 68 °C con mezcla periódica hasta que el PFA se disuelva por completo.
      NOTA: Use guantes y una máscara mientras prepara este reactivo, preferiblemente debajo de una campana extractora, ya que el PFA es altamente tóxico.
  3. Solución de MS-222 al 0,05% (comúnmente conocida como tricaína):
    1. Hacer un 4% de caldo de tricaína en E3 y almacenar a 4 °C. Para hacer 10 ml de caldo de tricaína, agregue 0,40 g de MS-222 en 7 ml de E3. Agite suavemente el tubo que contiene la solución para mezclar y aumentar el volumen a 10 ml. Para hacer 50 ml de solución de tricaína al 0,05%, agregue 625 μl del caldo al 4% a 49,375 ml de E3.
      NOTA: Use guantes y una máscara mientras prepara este reactivo.
  4. Solución madre de azul alcián al 0,4% en etanol al 70%
    1. Para preparar 2 ml de la solución madre, disuelva 8 mg de azul alcián en 1 ml de etanol al 50%. Calentar la solución a 37 °C durante 15-20 min con mezcla periódica para disolver. Una vez que la mancha se disuelva, prepare la solución a etanol al 70% agregando 900 μL de etanol al 100% y 100 μL de agua destilada.
      NOTA: La solución madre se puede almacenar a temperatura ambiente hasta por 2 semanas.
  5. Solución de tinción: 0,02 % de azul alcián, 200 mM de cloruro de magnesio (MgCl2) y 70 % de etanol
    1. Para preparar 5 ml de solución de tinción de azul de Alcian, agregue 1 ml de 1 M MgCl2, 3,5 ml de etanol al 100% y 250 μL de caldo de azul de Alcian al 0,4% (8 mg de azul de Alcian en 2 ml de etanol al 70%) a 250 μL de agua y mezcle bien.
      NOTA: Prepare la solución de tinción fresca para obtener los mejores resultados de tinción.
  6. Solución de lejía:
    1. Mezcle volúmenes iguales de peróxido de hidrógeno al 3% (H2O2) e hidróxido de potasio al 2% (KOH). Para hacer 2 ml de solución de lejía, mezcle 1 ml de peróxido de hidrógeno al 3% y 1 ml de hidróxido de potasio al 2%.
      NOTA: Prepare esta solución de nuevo antes de comenzar este paso. Dado que H2O2 es sensible a la luz, protéjalo de la exposición a la luz tanto como sea posible. Use guantes mientras manipula H2, O2 y KOH.
  7. Solución I: 20% glicerol + 0,25% KOH
    NOTA: Como el glicerol es muy viscoso, pipetee con cuidado. Use guantes mientras prepara estas soluciones.
    1. Para preparar 5 ml de solución I, agregue 2 ml de glicerol al 50% y 625 μl de KOH al 2% a 2.375 ml de agua y mezcle bien.
  8. Solución II: 50% glicerol + 0,25% KOH
    1. Para preparar 5 ml de solución II, agregue 3.570 ml de glicerol al 70% y 625 μl de KOH al 2% a 805 μl de agua y mezcle bien.
  9. Solución de almacenamiento: 50% glicerol + 0,1% KOH
    1. Para preparar 5 ml de solución de almacenamiento, agregue 3.570 ml de glicerol al 70% y 250 μl de KOH al 2% a 1.180 ml de agua y mezcle bien.
  10. 3% de agarosa
    1. Disuelva 3 g de agarosa en 100 ml de agua destilada. Calienta en el microondas hasta que la solución se vuelva clara.
  11. 0,1% PBST (0,1% Tween 20 en 1x PBS)
    1. Para hacer 1 L de 1x PBS, agregue 8 g de NaCl, 0.20 g de KCl, 1.44 g de Na2HPO4 y 0.24 g de KH2PO4 en 1,000 mL de agua destilada. Mezcle la solución y ajuste el pH a 7.4. Para hacer 500 ml de PBST al 0,1%, agregue 5 ml de 10% entre 20 y 495 ml de 1x PBS.
  12. Solución DAPI de 0,50 μg/ml
    1. Hacer 10 mg/ml de caldo DAPI en 1x PBS. Para hacer 10 ml de solución DAPI de 0,50 μg/ml, agregue 0,50 μl del caldo a 10 ml de 1x PBS y agite vigorosamente para asegurarse de que DAPI se disuelva por completo.
      NOTA: Use guantes mientras prepara estas soluciones. Proteja DAPI de la luz, ya que es sensible a la luz. El stock DAPI se puede almacenar a 4 °C durante más de un año.

2. Recogida de embriones

  1. Coloque parejas de peces cebra machos y hembras en tanques de cría la noche antes de que se requieran embriones, con los peces macho y hembra separados por barreras.
  2. Retire las barreras a la mañana siguiente y recoja los embriones dentro de los 15-20 minutos posteriores a la eliminación de las barreras.
    NOTA: El momento de la eliminación de la barrera es útil en la estadificación de embriones y larvas de pez cebra.
  3. Elevar los embriones a 28,5 °C hasta alcanzar los 5 dpf.
    NOTA: Asegúrese de reemplazar el medio E3 con un nuevo lote de E3 precalentado a 28,5 ° C una vez cada 2 días.

3. Tinción azul alcián

NOTA: Use guantes mientras realiza este experimento

  1. Anestesiar 20-25 larvas de pez cebra de 5 días de edad usando tricaína al 0,05% en un tubo de microcentrífuga (MCT) de 2 ml.
  2. Después de que las larvas dejen de moverse, lo que generalmente toma ~ 4-5 min, retire el anestésico y fíjelas en 1,5 ml de PFA al 4% a temperatura ambiente (RT) en un balancín a 60 rpm durante 2 h.
  3. Retire la mayor cantidad posible de fijador con una pipeta y agregue 1,5 ml de etanol al 50% a la muestra. Incubar durante 10 min mientras se balancea a 60 rpm a temperatura ambiente.
  4. Elimine la mayor cantidad posible de etanol con una pipeta y agregue 1,5 ml de la solución de tinción azul alcián.
  5. Incubar las larvas fijadas en la solución de tinción durante 18-20 h en un balancín a 60 rpm a temperatura ambiente.
    NOTA: La incubación durante un período de tiempo más corto o más largo puede hacer que ciertas regiones del cartílago se tiñan o se tiñan demasiado, respectivamente. Aquí, 18-20 h de tinción parecieron funcionar mejor para visualizar claramente el neuro y el viscerocráneo de una larva de 5 días.
  6. Retire la solución de mancha, agregue 1,5 ml de agua destilada e incube durante 1-2 minutos en un balancín a temperatura ambiente.
    NOTA: La tinción se puede detener en este paso para visualizar los límites celulares en los cartílagos disecados. Sin embargo, una desventaja de detener el protocolo de tinción en este paso sin realizar pasos de limpieza posteriores es que los límites del neuro y el viscerocráneo aún permanecerán ligeramente borrosos, y se vuelve más difícil realizar las disecciones con precisión.
  7. Agregue 1 ml de la solución de lejía a la muestra e incube durante 20 min a temperatura ambiente a temperatura ambiente al aire libre sin ninguna tapa sobre la placa o los pocillos.
    NOTA: No cubra los MCT durante este paso, ya que la reacción entre el peróxido de hidrógeno y el hidróxido de potasio produce oxígeno gaseoso, lo que podría hacer que la cubierta se desprenda si se cierra.
  8. Retire la solución blanqueadora y realice los siguientes pasos para limpiar los tejidos.
    1. Agregue 1,5 ml de solución I a la muestra y manténgala en un balancín a 60 rpm durante 40 min a temperatura ambiente.
    2. Retire la solución I y agregue 1,5 ml de solución II a la muestra y manténgala en un balancín a 60 rpm durante 2 h a temperatura ambiente.
      NOTA: Los pasos de limpieza ayudan a eliminar el exceso de mancha, mejorando la claridad óptica de las muestras y, por lo tanto, ayudando a realizar las disecciones de manera eficiente. Manipule las muestras con cuidado mientras cambia las soluciones, ya que cualquier daño puede afectar el análisis futuro de su morfología.
  9. Retire la solución II y agregue 1,5-2 ml de la solución de almacenamiento. Debido a la presencia de glicerol, las muestras teñidas se hunden gradualmente hasta el fondo en 10 minutos.
    NOTA: Las muestras teñidas se pueden almacenar a 4 °C durante más de un año.

4. Disección del esqueleto craneofacial

  1. Derrita la solución de agarosa al 3% en un microondas hasta que la solución se vuelva transparente.
    NOTA: No sobrecaliente ya que la solución puede salir burbujeando del matraz. Mantenga una verificación cuidadosa de la solución mientras realiza este paso.
  2. Cubra una placa de Petri de 90 mm con agarosa al 3% vertiendo la agarosa fundida hasta cubrir un tercio de la profundidad de la placa de Petri y permitir que se solidifique. Las disecciones se realizarán en esta placa de Petri.
    NOTA: Las placas de Petri con recubrimiento de agarosa se pueden preparar con una semana de anticipación y almacenar a 4 ° C. El recubrimiento de agarosa proporciona un sustrato más suave sobre el que se pueden realizar las disecciones sin dañar las pinzas.
  3. Limpie las pinzas que se utilizarán con etanol al 70% y límpielas con un trozo limpio de papel de seda de laboratorio estándar.
  4. Con una pipeta Pasteur, transfiera 3-4 larvas teñidas junto con 0,5 ml de solución de almacenamiento a la placa de Petri recubierta de agarosa.
    NOTA: La solución de almacenamiento garantiza una mayor claridad óptica para realizar las disecciones en comparación con hacer lo mismo en E3.
  5. Oriente una larva teñida en su lado lateral (Figura 1A) y raspe con cuidado la yema del cuerpo de la larva con las pinzas
    NOTA: La Figura 1B muestra un embrión donde se ha extraído la yema. Es una buena práctica transferir el embrión raspado de yema a una nueva placa de Petri antes de continuar con los pasos de disección adicionales para que la masa de yema pegajosa que flota no interfiera con la disección.
  6. Después de quitar la yema, sostenga la larva por la región de la cola con una pinza y use la otra para quitar los ojos con cuidado.
    NOTA: La Figura 1C muestra un embrión con la yema y los ojos extraídos. Los ojos deben extraerse con precaución ya que su proximidad al esqueleto craneofacial puede interferir con su disección.
  7. Con las pinzas, tire y pellizque con cuidado el cerebro y otros tejidos dorsales del neurocráneo. Mantenga la larva quieta con un par de fórceps y use el otro par de fórceps para hacer una incisión en el medio (Figura 1C, flecha roja), seguido de pellizcar los tejidos (Figura 1D).
    NOTA: Mientras realiza este paso, tenga cuidado al eliminar los tejidos más cercanos a las regiones más anteriores del neurocráneo, ya que el cartílago podría desprenderse con ellos.
  8. Separe la cabeza de la larva del resto del cuerpo. La región de la cabeza después de este paso contiene principalmente el neurocráneo y el viscerocráneo unidos entre sí en dos puntos, en los extremos anterior y posterior, junto con algunos pequeños tejidos no teñidos unidos a estas estructuras craneofaciales (Figura 1E).
    NOTA: Es difícil eliminar por completo los tejidos no teñidos directamente unidos al neurocráneo y al viscerocráneo. Aunque algunos tejidos residuales estarán presentes, su presencia no afectará ningún análisis posterior de forma o tamaño, ya que no están teñidos.
  9. Corta con cuidado las dos conexiones entre el neurocráneo y el viscerocráneo para separarlos (Figura 1F, líneas discontinuas rojas). Consulte la Figura 2 para obtener imágenes del neurocráneo y el viscerocráneo, tanto en embriones intactos como disecados.
  10. En un portaobjetos de vidrio limpio, agregue una o dos gotas de glicerol al 100%. Con la ayuda de fórceps, transfiera con cuidado el neurocráneo o viscerocráneo diseccionado a este portaobjetos. Use fórceps para colocar suavemente un cubreobjetos sobre estos pañuelos, asegurándose de que no se formen burbujas, y selle el cubreobjetos en todos los portaobjetos con esmalte de uñas.
    NOTA: Estos portaobjetos se pueden almacenar a 4 °C durante más de un año sin perder la mancha.

5. Cuantificación de las dimensiones de la placa etmoidal

  1. Adquiera imágenes del paladar usando una cámara conectada al microscopio estereoscópico (Figura 2D). En ausencia de una cámara de grado científico, conecte un teléfono inteligente estándar al microscopio estereoscópico para adquirir imágenes.
  2. Para la cuantificación, cargue la imagen de un paladar en FIJI22 y luego, use la herramienta de línea para medir el ancho y la altura de la placa etmoidal en micras (ver Figura 3A-C) y determine las dimensiones usando la resolución de píxeles de la cámara.
  3. Dibuje un contorno alrededor de la placa etmoidal y haga clic en Analizar | Establecer medidas | área para obtener el área de la placa etmoidal (Figura 3D, E).

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Resultados

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El esqueleto craneofacial del pez cebra es completamente cartilaginoso a los 5 días después de la fertilización (dpf) y, por lo tanto, puede ser teñido con azul alcián, que es un colorante básico capaz de unirse a glicosaminoglicanos presentes abundantemente en los cartílagos23. Esto da como resultado que el cartílago se tiña de azul (Figura 1) para que pueda distinguirse de otros tejidos presentes en la larva utilizando un microscopio estereoscópico estándar disponib...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las malformaciones craneofaciales constituyen la mayoría de todos los defectos de nacimiento en humanos, lo que a menudo conduce a la mortalidad infantil. Sin embargo, la etiología subyacente en la mayoría de las anomalías craneofaciales aún no se ha dilucidado25. Las estructuras craneofaciales son complejas en cualquier vertebrado y, desde la perspectiva de un entorno de pregrado, el primer requisito es, por lo tanto, tener una herramienta educativa que brinde a ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen intereses contrapuestos que declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos al Dr. Kalidas Kohale y a su equipo por el mantenimiento de las instalaciones pesqueras. SRN agradece el apoyo financiero del Departamento de Energía Atómica (DAE), Gobierno de la India (Identificación del Proyecto no. RTI4003, DAE OM no. 1303/2/2019/R\&D-II/DAE/2079 de fecha 11.02.2020), el programa Max Planck Society Partner Group (M.PG. A MOZG0010) y la subvención de investigación inicial del Consejo de Investigación de Ciencia e Ingeniería (SRG/2023/001716). Agradecemos a la Dra. Shweta Verma del laboratorio por sus perspicaces comentarios. Agradecemos a Swetha Nagarajan y Upal Chatterjee por su ayuda para hacer figuras para el manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AgarosaBiociencia de Lonza50004Para recubrir placas de Petri
Azul alcián 8G Sigma-AldrichReferencia A3157Para teñir cartílagos
Cloruro de calcio dihidratoSigma-Aldrich12022Para hacer búferes
CámaraOlimpoDP28Para la adquisición de imágenes
DAPIRoche Ciencias de la Vida10236276001Para el etiquetado de núcleos
EtanolHoneywell32221Disolvente para tinción azul alcián
FIJIVersión: ImageJ 1.54f
FórcepsDumontDumontPara realizar disecciones
GlicerolMP biomédica193996Para realizar lavados y montar muestras 
Peróxido de hidrógenoMP biomédica194057Para hacer una solución de lejía
Cloruro de magnesio hexahidratadoADRS BiocienciasSBRC0217Para hacer búferes
Sulfato de magnesio heptahidratadoSigma-AldrichM2773Para hacer búferes
MS-222 (Tricaína)Sigma-AldrichA5040Para anestesiar larvas
Cloruro de potasioSigma-AldrichP9541Para hacer búferes
Hidróxido de potasioSigma-Aldrich484016Para hacer búferes
Fosfato de potasio monobásicoSigma-AldrichP0662Para hacer búferes
Cloruro de sodioSigma-AldrichS3014Para hacer búferes
Fosfato de sodio dibásicoSigma-Aldrich71640Para hacer búferes
EstereoscopioOlimpoSZX61Para realizar disecciones
Interpolación-20HIMEDIATC287Detergente, utilizado para permeabilizar las células

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Establishing neural crest identity: a gene regulatory recipe. Development. 142 (2), 242-257 (2015).
  2. Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Dev Dyn. 249 (1), 88-111 (2020).
  3. Hammond, N. L., Dixon, M. J. Revisiting the embryogenesis of lip and palate development. Oral Dis. 28 (5), 1306-1326 (2022).
  4. Mork, L., Crump, G. Zebrafish craniofacial development: a window into early patterning. Craniofacial development. Yang, C. , Academic Press. 235-269 (2015).
  5. Swartz, M. E., SheehanRooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).
  6. Selleri, L., Rijli, F. M. Shaping faces: genetic and epigenetic control of craniofacial morphogenesis. Nat Rev Genet. 24 (9), 610-626 (2023).
  7. Beaty, T. H., et al. Evidence for geneenvironment interaction in a genome wide study of nonsyndromic cleft palate. Genet Epidemiol. 35 (6), 469-478 (2011).
  8. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nat Rev Genet. 12 (3), 167-178 (2011).
  9. Reynolds, K., Kumari, P., Sepulveda Rincon, L., Gu, R., Ji, Y., Kumar, S., Zhou, C. J. Wnt signaling in orofacial clefts: crosstalk, pathogenesis and models. Dis Model Mech. 12 (2), dmm037051(2019).
  10. Raterman, S. T., Metz, J. R., Wagener, F. A. D. T. G., Von den Hoff, J. W. Zebrafish models of craniofacial malformations: interactions of environmental factors. Front Cell Dev Biol. 8, 600926(2020).
  11. Walker, M., Kimmel, C. A twocolor acidfree cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotechnic Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).
  12. Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nat Genet. 40 (3), 290-298 (2008).
  13. Melvin, V. S., Feng, W., HernandezLagunas, L., Artinger, K. B., Williams, T. A morpholinobased screen to identify novel genes involved in craniofacial morphogenesis. Dev Dyn. 242 (7), 817-831 (2013).
  14. Spoorendonk, K. M., Hammond, C. L., Huitema, L. F. A., Vanoevelen, J., SchulteMerker, S. Zebrafish as a unique model system in bone research: the power of genetics and in vivo imaging. J Appl Ichthyol. 26, 219-224 (2010).
  15. Farmer, D. T., et al. A comprehensive series of Irx cluster mutants reveals diverse roles in facial cartilage development. Development. 148 (16), dev197244(2021).
  16. Rochard, L., Monica, S. D., Ling, I. T. C., Kong, Y., Roberson, S., Harland, R., Halpern, M., Liao, E. C. Roles of Wnt pathway genes wls, wnt9a, wnt5b, frzb and gpc4 in regulating convergentextension during palate morphogenesis. Development. 143 (14), 2541-2547 (2016).
  17. Liu, S., Narumi, R., Ikeda, N., Morita, O., Tasaki, J. Chemicalinduced craniofacial anomalies caused by disruption of neural crest cell development in a zebrafish model. Dev Dyn. 249 (7), 794-815 (2020).
  18. Zinck, N., FranzOdendaal, T. A. Accurate wholemount bone and cartilage staining requires acidfree conditions. Anat Rec. 304 (5), 958-960 (2021).
  19. Stenzel, A., et al. Distinct and redundant roles for zebrafish her genes during mineralization and craniofacial patterning. Front Endocrinol. 13, 1033843(2022).
  20. Tomasiewicz, H. G., Hesselbach, R., Carvan, M. J., Goldberg, B., Berg, C. A., Petering, D. H. Zebrafish as a model system for environmental health studies in the grad classroom. Zebrafish. 11 (4), 384-395 (2014).
  21. Cubbage, C. C., Mabee, P. M. Development of the cranium and paired fins in the zebrafish Danio rerio (Ostariophysi, Cyprinidae). J Morphol. 229 (2), 121-160 (1996).
  22. Schindelin, J. Fiji: an opensource platform for biologicalimage analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Tuckett, F., MorrissKay, G. Alcian Blue staining of glycosaminoglycans in embryonic material: effect of different fixatives. Histochem J. 20 (3), 174-182 (1988).
  24. Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140 (1), 76-81 (2013).
  25. Goodwin, A. F., et al. From bench to bedside and back: improving diagnosis and treatment of craniofacial malformations utilizing animal models. Craniofacial development. Yang, C. , Academic Press. 459-492 (2015).
  26. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196(2012).
  27. Ding, J., et al. Using alizarin Red staining to detect chemically induced bone loss in zebrafish larvae. J Vis Exp. (178), e63251(2021).
  28. Klingenberg, C. P., Barluenga, M., Meyer, A. Shape analysis of symmetric structures: quantifying variation among individuals and asymmetry. Evolution. 56 (10), 1909-1920 (2002).

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