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Artículo de método

Establecimiento y mantenimiento de organoides de cáncer de próstata derivados del paciente: un protocolo experimental detallado

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DOI:

10.3791/68912

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14 de noviembre de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, Jiangnan University Medical Center (Wuxi No. 2 People's Hospital), 2Wuxi School of Medicine, Jiangnan University

En este artículo

Resumen

La heterogeneidad del cáncer de próstata y la resistencia al tratamiento siguen siendo desafíos. Describimos un protocolo para generar organoides derivados de pacientes (PDO) que preservan las características clave del tumor parental. Este modelo estandarizado respalda la detección de medicamentos y los avances en medicina de precisión.

Resumen

El cáncer de próstata (CaP) es una neoplasia maligna muy heterogénea y una de las principales causas de mortalidad relacionada con el cáncer en los hombres, con importantes desafíos clínicos para abordar la resistencia al tratamiento y la progresión de la enfermedad. Los modelos preclínicos existentes, como las líneas celulares bidimensionales (2D) y los xenoinjertos derivados de pacientes (PDX), tienen limitaciones para recapitular fielmente la complejidad del CaP, incluida la heterogeneidad tumoral, la señalización dependiente del receptor de andrógenos (AR) y las interacciones microambientales. Para abordar esta brecha, este estudio presenta un protocolo sólido y reproducible para establecer organoides derivados de pacientes (PDO) que preservan las características genéticas, fenotípicas e histológicas de los tumores parentales. Este método permite el cultivo de organoides de CaP localizado y avanzado, proporcionando un modelo biológicamente relevante para estudiar los mecanismos de la enfermedad, la respuesta a los fármacos y el descubrimiento de biomarcadores. Los resultados demuestran la capacidad del protocolo para generar organoides a partir de una variedad de muestras clínicas, con aplicaciones en el cribado de fármacos de alto rendimiento y la medicina de precisión. Al ofrecer un flujo de trabajo estandarizado que aborda desafíos técnicos clave, este estudio destaca la importancia de las PDO como herramientas versátiles para avanzar en la investigación del cáncer de próstata y desarrollar estrategias terapéuticas más efectivas.

Introducción

El cáncer de próstata (CaP) sigue siendo una de las neoplasias malignas más prevalentes en los hombres en todo el mundo, solo superada por el cáncer de pulmón en mortalidad relacionada con el cáncer. Según estudios epidemiológicos recientes, la incidencia mundial de CaP ha aumentado constantemente, y se proyecta que el número de nuevos casos de cáncer de próstata anualmente aumentará de 1,4 millones en 2020 a 2,9 millones para 20401. A pesar de los avances en la detección temprana y el desarrollo de nuevas terapias, incluida la terapia de privación de andrógenos (ADT) y los agentes dirigidos, el cáncer de próstata sigue siendo un desafío clínico importante debido a su naturaleza heterogénea y al inevitable desarrollo de resistencia al tratamiento, particularmente en etapas avanzadas2. El cáncer de próstata resistente a la castración (CPRC), que emerge después del fracaso de la TPA, representa una forma letal de la enfermedad, caracterizada por malos resultados de supervivencia y opciones terapéuticas limitadas3. Por lo tanto, comprender los mecanismos moleculares que impulsan la progresión y la resistencia de la enfermedad es crucial para identificar nuevas dianas terapéuticas y mejorar los resultados de los pacientes.

El desarrollo de modelos preclínicos que imiten con precisión la complejidad del cáncer de próstata humano es fundamental para avanzar en la investigación en este campo. Los cultivos celulares 2D tradicionales, aunque ampliamente utilizados, no recapitulan la heterogeneidad celular, la arquitectura tumoral y el microambiente observados in vivo4. Como resultado, la utilidad traslacional de estos modelos es limitada, particularmente para estudiar la progresión tumoral, la resistencia a los medicamentos y las interacciones dinámicas entre las células cancerosas y el microambiente tumoral5. Por el contrario, los xenoinjertos derivados de pacientes (PDX) y los cultivos de organoides han surgido como herramientas más sofisticadas que cierran la brecha entre las líneas celulares convencionales y los tumores clínicos 4,5,6.

Los sistemas de cultivo de organoides han revolucionado el modelado del cáncer. Estas estructuras tridimensionales (3D) se derivan de los tejidos de los pacientes y pueden conservar las características histológicas, genómicas y fenotípicas del tumor original 7,8,9,10. Es importante destacar que los organoides del cáncer de próstata conservan características críticas de la heterogeneidad de la enfermedad, incluida la señalización de AR, la resistencia al tratamiento y la inestabilidad genómica, lo que los convierte en herramientas ideales para la investigación traslacional11. En comparación con los modelos PDX, los organoides son más rentables, escalables y susceptibles de manipulación genética, lo que facilita el cribado de fármacos de alto rendimiento, el descubrimiento de biomarcadores y los estudios funcionales. Las plataformas de organoides ya han mostrado resultados prometedores en otras neoplasias malignas, incluidos los cánceres colorrectales, de mama y de páncreas, lo que subraya su potencial para la oncología personalizada 4,12.

Sin embargo, establecer y mantener organoides de cáncer de próstata (PCO) presenta desafíos técnicos únicos. El epitelio prostático depende intrínsecamente de la señalización de andrógenos y del soporte de la matriz extracelular (MEC), lo que requiere condiciones de cultivo especializadas. Además, el cáncer de próstata exhibe una amplia gama de comportamientos clínicos, desde tumores localizados sensibles a las hormonas hasta CPRC altamente agresivos y refractarios al tratamiento, lo que complica aún más el desarrollo de sistemas organoides reproducibles11,12. Los protocolos exitosos para la generación de PCO deben abordar estas complejidades biológicas optimizando los pasos clave, incluido el procesamiento de tejidos, la digestión enzimática, la inclusión de ECM y la suplementación con factores de crecimiento críticos, hormonas y moléculas pequeñas. Dichos protocolos son esenciales para garantizar la fidelidad de los organoides a sus tumores parentales y facilitar su aplicación en análisis posteriores.

En este estudio, presentamos un protocolo detallado y reproducible para el establecimiento y mantenimiento a largo plazo de las DOP. Nuestro flujo de trabajo abarca todo el proceso, desde la adquisición de tejidos y el procesamiento de biopsias y muestras quirúrgicas hasta el paso de organoides, la criopreservación y la reanimación (Figura 1). Este protocolo se ha optimizado para preservar la integridad fenotípica y genómica de los tejidos del cáncer de próstata, lo que permite sistemas de cultivo 3D robustos adecuados para una amplia gama de aplicaciones, incluidos perfiles genómicos, pruebas de respuesta a fármacos y ensayos funcionales. En particular, nuestro método aborda obstáculos técnicos comunes, como bajas tasas de éxito en el cultivo de organoides, crecimiento subóptimo y dificultades en el paso posterior, y proporciona pautas estandarizadas, lo que facilita la reproducibilidad en todos los laboratorios.

El desarrollo de modelos confiables de organoides de cáncer de próstata tiene una inmensa importancia tanto para la investigación básica como para la traslacional13. Estos sistemas ofrecen una plataforma poderosa para descifrar los mecanismos de la enfermedad, identificar nuevos objetivos terapéuticos y avanzar en enfoques de medicina de precisión adaptados a pacientes individuales. Al abordar las brechas técnicas existentes y proporcionar un protocolo integral, nuestro trabajo tiene como objetivo acelerar la adopción de la tecnología de organoides en la investigación del cáncer de próstata y apoyar los esfuerzos globales para combatir esta desafiante enfermedad14.

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Protocolo

Este estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Ética Médica del Hospital Popular No. 2 de Wuxi (Número de aprobación: Y-38 (2023)). Todos los participantes proporcionaron formularios de consentimiento informado por escrito. Los datos de los pacientes se sometieron a la desidentificación para garantizar la protección de la privacidad de conformidad con los estándares éticos.

1. Recogida de muestras

  1. Adquisición de tejidos
    1. Preparación antes de la toma de muestras
      1. Criterios de inclusión: Asegúrese de que todos los participantes tengan un diagnóstico confirmado de cáncer de próstata, según lo determinado por un examen patológico o de imágenes. Obtener muestras tumorales de resección quirúrgica, biopsia u otros especímenes clínicos. Asegúrese de que todos los participantes tengan 18 años o más y no tengan ninguna otra neoplasia maligna, para excluir la posible interferencia de otros cánceres en el estudio del cáncer de próstata. De todos los participantes, recabar el consentimiento informado por escrito para participar en el estudio y permitir que sus muestras se utilicen para la investigación científica.
      2. Criterio de exclusión: Excluir a los pacientes cuyas muestras no contienen suficiente tejido tumoral para cultivo o análisis. Excluir a los pacientes que retiran el consentimiento o no pueden proporcionar las muestras requeridas durante el estudio.
    2. Muestras de biopsia con aguja gruesa de próstata: Use una aguja especial para obtener muestras del tejido prostático. Coloque inmediatamente el tejido en una solución de conservación (medio Advanced DMEM/F-12 (adDMEM/F-12) + solución inhibidora de rocas (dilución 1:2000)) y transpórtelo al laboratorio en hielo, asegurando la entrega en 24 h.
      NOTA: Apunte con precisión al tejido del cáncer de próstata y realice muestreos multisitio en diferentes regiones anatómicas. Realice 1-2 punciones por sitio, cada una de las cuales produce ≥ muestras de núcleo de 1 cm.
    3. Muestras de prostatectomía radical: Después de la recolección, coloque rápidamente las muestras en una solución de conservación (medio adDMEM/F-12 + solución inhibidora de rocas (dilución 1:2000)) y transporte en hielo, asegurando la entrega al laboratorio dentro de las 24 h.
      NOTA: Se pueden obtener más fragmentos de tejido mediante prostatectomía radical15.
      Recolecte muestras ≥ 1 g (≈ 5 mm de diámetro), minimizando la contaminación por tejido normal. Coordine preoperatoriamente con los médicos para especificar: 1) núcleo tumoral; 2) tejido peritumoral; 3) control normal. Priorice los fragmentos firmes con decoloración gris-amarilla. Si no existe, implemente un muestreo aleatorio sistemático. Consulte la Tabla 1 para obtener información sobre la recolección de muestras.
  2. Procesamiento de muestras
    1. Etiquetado y categorización: etiquete claramente las muestras de tejido recolectadas (incluido el nombre del paciente, el número de hospitalización, el nombre del tejido, el sitio del tejido y el tipo de tejido).
    2. Crioconservación: Procese las muestras de tejido inmediatamente (≤ 12 horas después de la recolección). Coloque las muestras en una solución de conservación preenfriada (4 °C) (medio adDMEM/F-12 + solución inhibidora de rocas (dilución 1:2000)) y guárdelas a 4 °C. Continúe con los pasos experimentales adicionales dentro de las 4-6 h para obtener resultados óptimos.
  3. Transporte y almacenamiento
    1. Transporte de la cadena de frío: Transportar las muestras de tejido al laboratorio en condiciones de baja temperatura.
    2. Registro de muestras: Al llegar al laboratorio, verifique y registre la información de la muestra en detalle, incluida la información personal básica del paciente, el tipo de tejido, el nombre y el sitio de muestreo.
  4. Recepción e inspección de laboratorio:
    1. Inspección de muestras: Abra las muestras en un gabinete de bioseguridad e inspeccione si hay pérdidas, contaminación o anomalías visibles.
    2. Disección de muestras: Extraiga la muestra y colóquela en una placa de cultivo. Use tijeras de tejido o un bisturí para dividir la muestra en trozos pequeños (aproximadamente 1-3 mm³) para su uso en experimentos posteriores.

2. Procedimientos experimentales

  1. Preparación de suspensiones celulares de tejido primario
    1. Preservación: Coloque los bloques de tejido recolectados en tubos de centrífuga cónicos estériles de 50 ml, asegurándose de que los tejidos se clasifiquen por tipo. Etiquete cada tubo adecuadamente. Agregue solución de preservación (medio adDMEM / F-12 + solución inhibidora de roca (dilución 1: 2000)) a cada tubo hasta que el tejido esté completamente sumergido. Almacene las muestras a 4 °C hasta su posterior procesamiento.
      NOTA: Los tipos de tejido deben incluir tejidos tumorales y no tumorales. Las etiquetas de muestra generalmente deben incluir el número de registro médico.
    2. Separación de tejidos: Con pinzas esterilizadas, transfiera las muestras de tejido del cáncer de próstata a una placa de cultivo de tamaño mediano. Lave el tejido 2-3 veces con 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (D-PBS) de Dulbecco para eliminar la sangre y los desechos. Retire con cuidado el tejido adiposo, el músculo y otros componentes no epiteliales con pinzas de punta fina, conservando solo las regiones epiteliales. Posteriormente, pique el tejido limpio en pequeños fragmentos de aproximadamente 1-3 mm³ de tamaño con unas tijeras.
      NOTA: La eliminación completa de los componentes no epiteliales es fundamental para las aplicaciones posteriores, ya que la contaminación del tejido estromal o adiposo puede reducir la eficiencia y la especificidad del aislamiento celular. Mantenga condiciones estériles durante todo el procedimiento para minimizar el riesgo de contaminación microbiana.
    3. Digestión de tejidos: Transfiera las piezas de tejido preparadas a tubos de procesamiento de tejidos. Agregue la solución de digestión del tejido tumoral (Tabla 2) a cada tubo. Active el dispositivo de digestión (aparato de preparación de suspensión unicelular) utilizando el Programa de Disociación de Tejidos de Dureza Media para la disociación enzimático-mecánica.
      NOTA: El protocolo de digestión es el siguiente: rotación hacia adelante a 200 rpm durante 3 s, rotación inversa a 200 rpm durante 3 s, rotación hacia adelante a 300 rpm durante 4 s, rotación inversa a 300 rpm durante 4 s, rotación hacia adelante a 600 rpm durante 5 s, rotación inversa a 600 rpm durante 5 s, rotación hacia adelante a 400 rpm durante 3 s, rotación hacia adelante a 400 rpm durante 3 s, Rotación inversa a 400 rpm durante 3 s. Esta secuencia constituye un ciclo, que debe repetirse tres veces. Después de completar los dos primeros ciclos, continúe con rotación lenta a 20 rpm durante aproximadamente 25 min. La duración puede ajustarse en función de las condiciones experimentales. Digerir los tejidos a 37 °C durante 40 min a 1 h.
    4. Terminación de la digestión: Agregue un volumen igual o doble de medio adDMEM/F-12 suplementado con FBS a la suspensión celular para terminar la actividad enzimática.
      NOTA: Si queda residuo no digerido, recoja el sobrenadante, agregue enzimas digestivas frescas al residuo y continúe la digestión a 37 ° C durante 15-20 min adicionales. Supervise el proceso periódicamente y combine las suspensiones celulares de ambos pasos de digestión.
    5. Filtración: humedezca previamente un filtro celular de 100 μm con 1 ml de medio adDMEM / F-12, luego filtre la suspensión celular. Enjuague el tubo de procesamiento de tejidos y el colador celular dos veces con 5 ml de medio adDMEM/F-12 suplementado con solución inhibidora de rocas (dilución 1:2000). Recoja el filtrado en un tubo de centrífuga cónico estéril de 50 ml. Pase la suspensión a través de un filtro de 70 μm y recoja todas las suspensiones celulares en un nuevo tubo de 50 ml.
      NOTA: El número de pasos de filtración y el tamaño de los poros de los filtros pueden ajustarse de acuerdo con las características de la muestra.
    6. Lisis de glóbulos rojos: Centrifugar la suspensión celular recogida a 200 × g durante 5 min a 25 °C. Deseche con cuidado el sobrenadante, luego vuelva a suspender el sedimento celular en 2 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos. Incube la suspensión en hielo durante 2-3 min.
      NOTA: El tiempo de incubación para la lisis de glóbulos rojos puede ajustarse en función de la eficiencia de la lisis. La incubación prolongada puede provocar un aumento de la muerte celular. Se recomienda monitorear la muestra bajo un microscopio para asegurar la lisis completa de los glóbulos rojos sin daño excesivo a otros tipos de células.
    7. Terminar la lisis: Agregue 6 ml de medio adDMEM / F-12 suplementado con solución inhibidora de roca (dilución 1: 2000) a la suspensión celular. Transfiera la mezcla a un tubo de centrífuga cónico estéril de 15 ml y centrifugue a 200 x g durante 5 min a 25 °C. Deseche el sobrenadante. Lave el gránulo celular 1-2 veces con el mismo medio suplementado y transfiera la suspensión celular final a un tubo Eppendorf de 1,5 ml.
    8. Evaluación de la viabilidad: Mezcle 10 μL de la suspensión celular con un volumen igual de solución azul de tripano y observe la viabilidad celular bajo un microscopio.
      NOTA: Si se observan cantidades significativas de células muertas o residuos, realice una centrifugación a baja velocidad a 50 x g durante 5 min a 25 °C para eliminarlos antes de continuar con el recuento.
    9. Recuento de células: Vuelva a suspender el sedimento en 1 ml de medio adDMEM / F-12, diluya la suspensión según sea necesario (generalmente en una dilución de 1:20) y coloque 6 μL de la suspensión diluida en un hemocitómetro para contar células bajo un microscopio.
    10. Recogida de pellets celulares: Centrifugar a 200 x g, 25 °C, durante 5 min. Recoja el sedimento de la célula final en un tubo Eppendorf de 1,5 ml.

3. Establecimiento de organoides a partir de suspensiones celulares primarias

  1. Siembra: Determine el volumen requerido de gel de matriz en función del recuento de células. Con puntas de pipeta preenfriadas (almacenadas a -20 °C), transfiera cuidadosamente el volumen adecuado de gel de matriz al gránulo celular. Mezcle suavemente la mezcla de gel celular en hielo, evitando la formación de burbujas de aire para garantizar una siembra uniforme y una integridad óptima del gel de matriz.
    NOTA: Descongele el gel de matriz a 4 °C durante la noche antes de su uso. Asegúrese de que todas las herramientas de manipulación, incluidas las puntas de pipeta y los tubos, estén preenfriadas para evitar la gelificación prematura.
  2. Recubrimiento: Dispense la mezcla de gel de matriz celular en una placa de cultivo de 24 pocillos de baja adherencia, aplicando aproximadamente 30 μL por gota. Asegúrese de que cada gota contenga más de 10,000 células para respaldar la formación efectiva de estructuras tridimensionales (3D).
    NOTA: Evite la dilución excesiva del gel de matriz. Para mantener la integridad estructural y apoyar la formación de cultivos 3D, el gel de matriz debe constituir más del 70% del volumen total de la mezcla. Los organoides derivados de muestras de biopsia humana y prostatectomía son de naturaleza equivalente, difiriendo principalmente en el rendimiento de células viables, y en este protocolo se aplicaron densidades de siembra idénticas.
  3. Incubación: Coloque la placa de cultivo en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO2 durante 5 min, permitiendo que el gel de matriz se solidifique preliminarmente. Invierta la placa y déjela reposar durante 20 minutos para mantener el gel de matriz en forma 3D. Agregue 800-1000 μL de medio de cultivo (Tabla 3) a cada pocillo. Reemplace el medio de cultivo cada 2-3 días.
    NOTA: Asegúrese de que el gel de la matriz no se altere durante el paso de inversión para mantener la estructura 3D.

4. Paso de organoides

  1. Recolección y preparación de organoides: Usando una punta de pipeta preenfriada, interrumpa mecánicamente el gel de la matriz para fragmentar los grupos de organoides. Enjuague cada pocillo 1-2 veces con adDMEM/F-12 medio + solución inhibidora de roca (dilución 1:2000). Transfiera los racimos fragmentados junto con el medio de cultivo a un tubo de centrífuga cónico estéril de 15 ml. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 25 °C y desechar el sobrenadante.
    NOTA: Cuando los organoides alcanzan un diámetro de 100 μm (típicamente en el día 14 de cultivo). Si un volumen medio excesivo interfiere con la interrupción mecánica, aspire parte del medio antes de romper los racimos. Para el gel de matriz residual que se adhiere a la superficie de la placa, raspe suavemente con una punta de pipeta y enjuague 2-3 veces con adDMEM/F-12 medio + solución inhibidora de roca (dilución 1:2000). Todos los enjuagues deben combinarse con la recolección inicial para obtener el máximo rendimiento.
  2. Disociación de organoides: Vuelva a suspender el sedimento resultante en 2 ml de solución enzimática similar a la tripsina recombinante precalentada. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para iniciar la disociación, luego incubar a 37 °C durante 15-30 min. Monitoree la disociación bajo el microscopio cada 5 minutos hasta que los grupos de células pequeñas (aproximadamente 5-6 células por grupo) dominen el campo, luego continúe con el siguiente paso.
    NOTA: La terminación oportuna de la digestión es crucial para evitar la disociación excesiva y preservar la viabilidad celular. La observación microscópica frecuente asegura que la digestión se detenga en el momento óptimo para la formación de racimos.
  3. Terminar la digestión: Terminar la digestión añadiendo un volumen igual o doble de medio adDMEM/F-12 suplementado con suero fetal bovino (FBS) para apagar la actividad enzimática. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 25 °C y desechar el sobrenadante.
  4. Eliminación del gel de matriz: Vuelva a suspender el gránulo en 2 ml de solución de recuperación celular e incube a 4 °C durante 20-40 min para disolver el gel de matriz residual. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y repetir el lavado dos veces con medio adDMEM/F-12 para eliminar los componentes residuales de la matriz. Transfiera el pellet final a un tubo Eppendorf estéril de 1,5 ml para su posterior procesamiento.
    NOTA: La incubación a baja temperatura es fundamental para una despolimerización eficaz del gel de matriz al tiempo que preserva la integridad celular. Minimice el tiempo fuera del ambiente frío para evitar la regelificación prematura.
  5. Siembra y cultivo: Proceda a la resiembra de los grupos de organoides disociados siguiendo los procedimientos descritos en los pasos 3.1-3.3. Garantice la densidad celular y la relación de gel de la matriz adecuadas para una reformación óptima de la estructura 3D.
    NOTA: Los protocolos detallados para la criopreservación, descongelación, reinclusión y procesamiento histológico de organoides están disponibles a pedido.

5. Criopreservación de organoides

  1. Recogida de organoides: Retire la placa de cultivo de la incubadora y disocie mecánicamente los agregados de hidrogel organoides utilizando una punta de pipeta preenfriada. Transfiera los agregados disociados junto con el medio de cultivo a un tubo de centrífuga cónico de 15 ml. Enjuague los pocillos 2-3 veces con adDMEM / F-12 medio, combinando los lavados con la suspensión primaria. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 25 °C y desechar el sobrenadante.
    NOTA: Para garantizar el máximo rendimiento, interrumpa suavemente los agregados organoides sin causar daños excesivos. Todos los lavados deben combinarse con la recolección primaria para reducir la pérdida de organoides durante el proceso de recolección.
  2. Disociación enzimática: Agregue 2-4 ml de solución enzimática similar a la tripsina recombinante precalentada al gránulo organoide en un tubo cónico y mezcle suavemente la suspensión. Incubar la suspensión a 37 °C durante 15-20 min. Supervise el proceso de disociación microscópicamente cada 5 minutos.
    NOTA: Si es necesario, pipetee suavemente para ayudar a dividir los grupos más grandes en agregados más pequeños (aproximadamente 5-6 células por grupo). Se requieren tiempos de digestión más cortos para la criopreservación para evitar la disociación excesiva y la pérdida de viabilidad celular. La observación frecuente asegura que la digestión termine en la etapa apropiada para preservar la integridad de los organoides.
  3. Terminación de la digestión: Agregue un volumen igual o mayor de medio adDMEM/F-12 suplementado con FBS para detener la actividad enzimática. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
    NOTA: Si el gránulo está libre de gel de matriz residual, continúe con el paso 5.5 para la criopreservación. Si persiste la contaminación del gel de la matriz, continúe con el paso 5.4.
  4. Eliminación del gel de matriz (opcional): Siga el procedimiento descrito en el paso 4.4 para eliminar el gel de matriz. Vuelva a suspender el pellet en 2 ml de solución de recuperación celular e incube a 4 °C durante 20-40 min. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4°C, desechar el sobrenadante y repetir el proceso de lavado 1-2 veces para asegurar la eliminación completa del gel de matriz.
    NOTA: La eliminación del gel de matriz residual es fundamental para garantizar que solo se criopreserven las células disociadas. La eliminación incompleta del gel puede afectar la viabilidad y la integridad estructural de los organoides al descongelarse.
  5. Crioconservación: Vuelva a suspender el sedimento celular en 1,5 ml de medio de congelación de organoides mediante un pipeteo suave para garantizar una suspensión uniforme. Transfiera la suspensión a un criovial y guárdela a -80 °C para su conservación a corto plazo. Después de 24 h, transfiera los viales a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
    NOTA: Asegúrese de que el medio de criopreservación esté bien mezclado con las células para evitar una congelación desigual, que puede provocar daños celulares. Los viales deben transferirse a nitrógeno líquido inmediatamente después del período de almacenamiento a corto plazo para garantizar la conservación a largo plazo y evitar la degradación celular.

6. Recuperación de organoides

  1. Descongelación de organoides criopreservados: Retire los crioviales que contienen organoides del nitrógeno líquido o del almacenamiento a -80 °C. Sumerja inmediatamente el vial en un baño de agua a 37 °C y agite suavemente hasta que el contenido esté completamente descongelado. Tan pronto como se complete la descongelación, transfiera la suspensión de organoides a un tubo de centrífuga cónico de 15 ml utilizando una punta de pipeta preenfriada (-20 °C).
    NOTA: La descongelación rápida y uniforme es fundamental para minimizar el daño celular inducido por crioterapia. Utilice puntas de pipeta preenfriadas para evitar el calentamiento prematuro y la reformación del gel de matriz durante la transferencia.
  2. Eliminación del crioprotector: Agregue con cuidado 1-2 ml de medio adDMEM / F-12 a lo largo de la pared del tubo cónico para diluir el crioprotector gradualmente. Mezclar suavemente por inversión. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
    NOTA: Evite el pipeteo vigoroso o el vórtice en esta etapa, ya que los cambios osmóticos repentinos y el estrés mecánico pueden comprometer la viabilidad de los organoides. Un enfoque de dilución lenta minimiza el shock celular.
  3. Lavado y resuspender: Agregue 1 ml de medio adDMEM / F-12 fresco al gránulo. Vuelva a suspender las células suavemente con una punta de pipeta preenfriada (-20 °C) para evitar la adhesión prematura del gel de la matriz. Transfiera la suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    NOTA: Mantener una temperatura baja durante el lavado es esencial para evitar el reensamblaje inducido térmicamente de los componentes del gel de matriz, lo que podría dificultar la reformación posterior de los organoides.
  4. Recolección: Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante. Repita el paso de lavado 2-3 veces para garantizar la eliminación completa del crioprotector residual y los contaminantes.
  5. Siembra y cultivo: Volver a suspender el pellet celular final en medio de cultivo organoide preparado según las necesidades experimentales. Proceda con la siembra siguiendo el protocolo descrito en los pasos 3.1-3.3, asegurando la proporción adecuada de gel de matriz y la densidad celular para apoyar el restablecimiento de la estructura 3D.
    NOTA: La viabilidad y recuperación de las células después de la descongelación dependen en gran medida de un manejo suave, una dilución adecuada de los crioprotectores y el restablecimiento inmediato de un entorno de gel de matriz 3D de apoyo.

7. Procesamiento previo al análisis para la caracterización de organoides

  1. Recolección de organoides: Disociar mecánicamente los agregados cuando los diámetros de los organoides alcanzan los 70-100 μm y transferirlos a un tubo cónico de 15 mL que contiene medio para su posterior cultivo. Enjuague los pocillos 2-3 veces con medio adDMEM/F-12 y combine los lavados con la suspensión de organoides. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 25 °C y desechar el sobrenadante.
    NOTA: Para colecciones a pequeña escala (por ejemplo, 1-2 pocillos), use un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para garantizar un manejo eficiente y reducir la pérdida de muestras. Tenga cuidado para evitar alterar las estructuras de los organoides durante la disociación.
  2. Resuspensión: Vuelva a suspender el sedimento en 1 ml de medio adDMEM / F-12 y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 25°C y desechar el sobrenadante.
    NOTA: Asegúrese de que el pellet se vuelva a suspender completamente antes de la centrifugación para evitar la formación de grumos y facilitar un procesamiento uniforme en los pasos posteriores.
  3. Lavado y fijación: Añadir 1 ml de D-PBS al pellet y mezclar suavemente mediante pipeteo o inversión. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 25 °C, desechar el sobrenadante y repetir el paso de lavado 1-2 veces. Fije el gránulo con 1-2 ml de paraformaldehído (PFA) al 4% e incube durante la noche a 4 °C.
    NOTA: Realice cuidadosamente los pasos de lavado para garantizar la eliminación completa del medio residual y otros contaminantes. La fijación en paraformaldehído es crucial para preservar la morfología de los organoides para su posterior análisis.
  4. Lavado posterior a la fijación: Centrifugar las muestras a 200 × g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante. Lave las muestras fijas 2-3 veces con D-PBS, mezclando suavemente con los dedos o invirtiendo suavemente para garantizar una distribución adecuada del tampón de lavado y evitar la pérdida de organoides.
    NOTA: El lavado adecuado posterior a la fijación es esencial para eliminar el exceso de paraformaldehído y reducir la tinción de fondo en aplicaciones posteriores, como la inmunohistoquímica.
  5. Refijación de etanol: Vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de mezcla de etanol al 70% suavemente con los dedos e incube a temperatura ambiente durante 20 min. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
    NOTA: La fijación de etanol en esta etapa ayuda a preservar la integridad de los organoides y preparar las muestras para su inclusión o procesamiento posterior. Asegure una suspensión uniforme en etanol para evitar una fijación desigual.
  6. Eliminación de gel de matriz (opcional): Si queda gel de matriz residual en el gránulo, siga el protocolo descrito en el paso 4.4 para eliminarlo. Este paso consiste en volver a suspender el gránulo en una solución de recuperación celular e incubar a 4 °C durante 20-40 min, seguido de centrifugación y múltiples lavados para garantizar la eliminación completa del gel.
    NOTA: La eliminación del gel de matriz es particularmente importante para el análisis histológico o las imágenes posteriores, ya que el gel residual puede interferir con el corte y el análisis del tejido.
  7. Inclusión de agarosa: Prepare aproximadamente 6 ml de agarosa al 2% fundiendo a 96 ° C durante la fijación de etanol organoide. Mezcle 100 μL de agarosa fundida con el gránulo de organoide, asegurando una formación mínima de burbujas de aire. Transfiera la mezcla a un molde, solidifique a 4 ° C y luego procese para la inclusión de parafina.
    NOTA: Caliente previamente las puntas de la pipeta (con los extremos recortados) para evitar obstrucciones. La inclusión de agarosa facilita la preservación de la estructura de los organoides al tiempo que permite un fácil manejo y seccionamiento. Evite la formación de burbujas durante la mezcla para garantizar una inclusión uniforme y un corte óptimo del tejido.

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Resultados

Características morfológicas y dinámicas de crecimiento de organoides de cáncer de próstata derivados de pacientes
Los organoides de cáncer de próstata derivados del paciente se establecieron con éxito a partir de tejidos tumorales frescos recolectados durante procedimientos clínicos. La formación inicial de organoides se observó típicamente dentro de los 5-7 días posteriores al cultivo (Figura 2). Bajo microscopía de campo claro, los org...

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Discusión

El establecimiento de PDO para PCa representa un avance crítico en el modelado preclínico, que ofrece ventajas significativas sobre los cultivos celulares 2D convencionales y PDX16. El método presentado en este estudio permite la generación de organoides que recapitulan fielmente las características histológicas, genéticas y fenotípicas del tumor original. Al preservar la heterogeneidad tumoral, incluida la señalización de AR y la arquitectura celular, los organoi...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención No. 82172831) y el Proyecto de Investigación Clave de la Comisión Provincial de Salud y Planificación Familiar de Jiangsu (Subvención No. X20240121).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
A 83-01TOCRIS2939
adMEM/F12Gibco12634010
Gabinete de bioseguridadJinan Xinbeixi Biotechnology Co., Ltd
Solución de Recuperación CelularCorning354253
CentrífugaShenzhen Ruiwode Life Technology Co., LtdM1416R
Tubos centrífugasNankín iResearch Biotechnology Co., Ltd
Cultrex PathClear BMR& D3533-010-02
Cultrex Factor de Crecimiento Reducido BME, Tipo 2R& D3533-005-02
Recipientes de cultivo (placas de baja adhesión de 24 pozos)TermodinámicaNunc-174930-ZX
DHTISOREAG521-18-6
Balance electrónicoNankín iResearch Biotechnology Co., Ltd
Suero fetal bovinoGibco10099141
GlutaminePlus-200mMR& DB90210
HEPESR& D1254/10
Incubadora de cultivo celular humidificado (37&ºC; C, 5% CO2)Shanghai Hetian Scientific Instrument Co., LtdHY-160SY
Caja de hieloNankín iResearch Biotechnology Co., Ltd
platos de cultura de tamaño medioAbsentaabs7005
Suplemento de medios N21-MAX (50X)R& DAR008
N-acetilcisteínaSigmaA9165-5G
NicotinamidaR& D3533-010-02
NormocinInvivogenANT-NR-2
Dispositivo de pipeteo con pipeteo tipo pipeteoNankín Hotspot Scientific Instrument Co., Ltd
PipetasNankín Hotspot Scientific Instrument Co., Ltd
PrimocinInvivogenANT-PM-2
rhEGFR& D236-EG-01M
rhFGFR& D233-FB-025
rhFGF-10R& D345-FG-025
rhNogginR& D6057-NG-100
rhR-Spondin 1R& D4656-RS-100
SB 202190TOCRIS1264
Aparato de preparación de suspensión de célula únicaRWDDSC-400
Tijeras de tejido/bisturíNankín iResearch Biotechnology Co., Ltd
TryplE ExpressGibco126A04013
Kit de Disociación Tumoral, HumanoMiltenyi Biotec130-095-929
PinzasNankín iResearch Biotechnology Co., Ltd
Baños de aguaChangzhou Zhongjie Experimental Instrument Manufacturing Co., LtdHH-600
Y-27632 dihidrocloruroR& D1254/10

Referencias

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