Artículo de método

Detección de comportamiento propenso a la agregación en células mutantes de cáncer de mama P53 V157F utilizando fluorescencia multipunto de tioflavina T

DOI:

10.3791/68921

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30 de diciembre de 2025

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1School of Medicine, I-Shou University, 2School of Chinese Medicine for Post Baccalaureate, I-Shou University, 3Department of Medical Science and Biotechnology, I-Shou University, 4Department of Biomedical Engineering, I-Shou University, 5Department of Pathology, E-Da Hospital, 6Department of Physical Therapy, I-Shou University, 7Department of Occupational Therapy, I-Shou University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células de cáncer de mama Hs578T que albergan la mutación p53 V157F presentan una fluorescencia significativamente mayor de tioflavina T en comparación con las células MCF7, lo que indica una agregación proteica mejorada. Las mediciones de fluorescencia multipunto mejoran la precisión y fiabilidad de la detección para identificar agregados ricos en hojas β, subrayando la importancia de las mutaciones p53 propensas a la agregación en la investigación del cáncer y el desarrollo de estrategias terapéuticas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El supresor tumoral p53, codificado por el gen TP53 , desempeña un papel central en el mantenimiento de la estabilidad genómica. Las mutaciones de TP53 , especialmente las variantes de punto caliente, se encuentran en aproximadamente el 50% de los cánceres humanos y pueden provocar la pérdida de funciones supresoras tumorales o la adquisición de propiedades de ganancia de función, incluida la agregación en estructuras similares a priones.

En este estudio, evaluamos la tendencia de agregación de la mutación p53 V157F en células de cáncer de mama Hs578T en comparación con células MCF7 que expresan p53 tipo silvestre. La agregación de proteínas se evaluó mediante tinción con tioflavina T (ThT) seguida de cuantificación de fluorescencia en ensayos de placas de 96 pozos. Las células se teñieron con una solución de ThT/Hoechst, se lavaron y analizaron usando un lector de microplacas bajo parámetros definidos de excitación/emisión. El análisis cuantitativo utilizando lecturas de fluorescencia de punto único y cuatro puntos reveló que las células Hs578T mostraron un aumento de 3,20 a 4,26 veces en la intensidad de fluorescencia de ThT en relación con MCF7, lo que indica niveles significativamente elevados de agregados ricos en láminas de β o similares a amiloides. Las mediciones multipunto confirmaron la presencia generalizada y constante de agregados proteicos en toda la superficie del pozo. Estos hallazgos apoyan el uso de la lectura de placas multipunto para detectar con precisión la agregación de proteínas en ensayos celulares.

Introducción

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El gen TP53, que codifica la proteína supresora tumoral p53, está mutado en aproximadamente el 50% de los cánceres humanos 1,2. Estas mutaciones no solo eliminan las funciones supresoras de tumores de p53, sino que, en ciertas variantes de punto caliente, también promueven la formación de agregados similares apriones 3,4. Estas formas agregadas de p53 mutante adquieren frecuentemente propiedades de ganancia de función, incluyendo una mayor resistencia a terapiasanticancerígenas 5,6. Por lo tanto, identificar qué mutaciones de p53 son propensas a agregación es fundamental para guiar el desarrollo de estrategias de tratamiento efectivas en cánceres p53-mutantes 7,8.

En nuestros estudios previos, observamos que mutaciones específicas de p53 en carcinomas escamosos de cabeza y cuello (HNSCC) y líneas celulares de cáncer de mama presentan fuertes señales de tinción con tioflavina T (ThT), lo que indica la presencia de proteínas agregadas. ThT es un colorante benzotiazol que se une específicamente a estructuras amiloides ricas en β láminas, produciendo una fluorescencia aumentada al unirse9. Por ejemplo, la línea celular Detroit 562 HNSCC, que lleva la mutación p53 R175H, mostró señales de fluorescencia ThTfuertes 10. De manera similar, otras dos líneas celulares de HNSCC, TW01 y HONE-1, ambas con la mutación p53 R280T, también mostraron una marcada tinción deThT 11. En estos casos, las señales ThT colocalizadas con p53, soportando la presencia agregada de p53 10,11.

En las células de cáncer de mama, MDA-MB-231 (mutación p53 R280K) y T47D (mutación p53 L194F) también mostraron una fuerte tinción con ThT con clara colocalización p53/ThT 12. En cambio, las células MCF7, que expresan p53 tipo salvaje, y las células MDA-MB-468 (mutación p53 R273H) mostraron solo señales débiles deThT 12. De manera similar, las células OECM-1 HNSCC con la mutación p53 V173L mostraron bajos niveles de tinción conThT 10.

En comparación con otros métodos de detección por agregación de proteínas —como los ensayos de filtro, la microscopía electrónica de transmisión (TEM) o la inmunotinción con anticuerpos específicos de agregados— el análisis de fluorescencia ThT ofrece varias ventajas. Es no destructivo, rápido y aplicable tanto a células vivas como fijas sin un procesamiento extenso. Aunque los ensayos de filtro capturan eficazmente agregados insolubles, requieren una desnaturalización severa y no son adecuados para el uso de célulasvivas 13. TEM proporciona visualización directa de la morfología de las fibrillas, pero requiere mucho trabajo y tiene bajo rendimiento14. La inmunotinción específica de agregados permite la detección in situ usando anticuerpos dependientes de la conformación, aunque la disponibilidad y especificidad de anticuerpos puedenlimitar 15. En cambio, la fluorescencia ThT —especialmente cuando se combina con la lectura de placas multipunto— ofrece un enfoque sencillo, cuantitativo y espacialmente fiable para detectar estructuras ricas en hojas de β o similares a amiloides.

Las consideraciones prácticas también son clave para la reproducibilidad. La fluorescencia de ThT se correlaciona linealmente con la concentración de amiloide en un amplio rango de concentraciones (0,2-500 μM), y la señal máxima se alcanza típicamente entre 20 y 50 μM, dependiendo de la proteína, aunque la autofluorescencia de ThT puede emerger a ≥5 μM, y concentraciones más altas pueden afectar a la cinética deagregación 16. Por lo tanto, generalmente se recomienda una concentración de ThT de trabajo alrededor de 10-20 μM para equilibrar la sensibilidad minimizando los posibles efectos sobre los procesosde agregación 16. En nuestro protocolo, el stock de 1.000x ThT (12 mM) se diluye 1:1.000 para obtener una concentración operativa de aproximadamente 12. μM, que se encuentra dentro de este rango recomendado.

ThT se une preferentemente a estructuras amiloides ricas en β hojas, características de las fibrillas amiloides. Esta especificidad surge de la interacción del tinte con la arquitectura de β cruzada de las fibrillas amiloides, donde las superficies formadas por hebras de β proporcionan sitios de unión para ThT. En consecuencia, ThT puede no detectar eficazmente otros agregados mal plegados o no amiloides que no presenten esta estructura rica en βhojas 17. Por lo tanto, aunque ThT es una herramienta valiosa para identificar fibrillas amiloides, es recomendable emplear métodos complementarios de validación —como la colocalización con la inmunofluorescencia p53 o enfoques biofísicos— para verificar la identidad y especificidad de los agregadosdetectados 10,18.

Los estudios de predicción estructural sugieren que la mutación p53 V157F adopta una conformación más propensa a la agregación que la proteínasalvaje 19. En este estudio, comparamos señales de fluorescencia de ThT entre células de cáncer de mama Hs578T, que albergan la mutación p53 V157F, propensa a agregación, y células MCF7 que expresan el tipo silvestre p53. Utilizando un ensayo de tinción ThT basado en lector de placas multipunto, buscamos evaluar la propensión a la agregación de p53 V157F en relación con p53 de tipo salvaje.

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Protocolo

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1. Siembra de células

  1. Para evaluar la viabilidad celular, mezcle 10 μL de azul de tripán con 10 μL de células resuspendidas en 1 solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco en un tubo microcentrífuga y mezcle bien.
  2. Carga 10 μL de la mezcla sobre una lámina contadora y luego cuenta las celdas vivas usando un contador automático.
  3. Según el recuento de viabilidad, sembra 30.000 células viables por pozo en una placa de cultivo de 96 pozos, con un pozo designado como control no teñido y los tres pozos restantes usados para la tinción.

2. Incubación

  1. Coloque la placa de cultivo en una incubadora deCO2 e incube durante 12 horas a 37 °C.

3. Preparación de material de tinción ThT fresco (1.000x)

  1. Pesa 0,02 g (20 mg) de polvo ThT y disuelve en 5,0 mL de agua desionizada. Mezcla bien hasta que el polvo esté completamente disuelto.
    NOTA: Esta preparación produce una solución de stock de 1.000 veces ThT con una concentración final de 4 mg/mL, equivalente a 12,5 mM (el ThT tiene un peso molecular de ~318,85 g/mol). Una solución de 4 mg/mL equivale a 4 g/L. Dividiendo 4 g/L entre 318,85 g/mol se obtiene 0,0125 mol/L, o ~12,5 mM).

4. Preparación del tampón de tinción ThT con contratinción nuclear

  1. Prepara la solución de tinción añadiendo lo siguiente a 1 mL de 1x DPBS y mezcla suavemente para asegurar la homogeneidad.
    1. Añade 1 μL de caldo de ThT recién preparado, 1.000x, obteniendo una concentración final de ThT de 12,5 μM (1x).
    2. Añadir 1 μL de solución stock Hoechst 33342 de 1 mg/mL, obteniendo una concentración final de ~1 μg/mL (=1,6 μM).

5. Tinción

  1. Retira el medio de cultivo de cada pozo. Añade 100 μL del tampón de tinción ThT/Hoechst preparado a cada pozo de tinción. Añade 100 μL de 1x DPBS al control sin teñir.

6. Incubación

  1. Coloca el plato en un lugar oscuro a temperatura ambiente (25 °C) durante 30 minutos.

7. Lavar

  1. Aspira cuidadosamente o descarta la solución de tinción de cada pozo, teniendo cuidado de no alterar la monocapa celular.
  2. Añade 100 μL de 1× DPBS a cada pozo y permite un remojo suave opcional de 30 segundos.
  3. Aspira cuidadosamente o desecha la solución de lavado DPBS.
  4. Repite el lavado añadiendo 100 μL de 1x DPBS fresco a cada pozo, permitiendo nuevamente un remojo suave opcional de 30 segundos, y luego descarta la solución de lavado DPBS.
  5. Después del segundo lavado, añade 100 μL de 1x DPBS fresco a cada pozo.

8. Medición de fluorescencia

  1. Antes de leer la señal de fluorescencia, retira la tapa de la placa de 96 pozos. Mide la fluorescencia usando uno de dos métodos: lectura de un solo punto o lectura de cuatro puntos.
  2. Coloque la placa de 96 pozos en un lector de microplacas y mide la fluorescencia usando los siguientes ajustes: fluorescencia ThT: excitación a 450 nm, emisión a 490 nm; Fluorescencia de Hoechst 33342: Excitación a 360 nm, emisión a 460 nm; Configuración del lector: Temblar: 5 s antes de leer; Dirección de lectura: Lectura principal; Tiempo de integración: 140 ms; Altura de lectura: 1,00 mm; Puntos por well: 1 (extremo) o 4 (escaneo de pozo); Ajuste de escaneo del pozo: (Ajuste de densidad: 2; Espaciado de puntos: 2,5).

9. Análisis de datos

  1. Calcular la agregación de proteínas de la siguiente manera:
    figure-protocol-1
  2. Normaliza la intensidad de fluorescencia de ThT estableciendo la proporción en las células MCF7 como 1 (control basal).

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Resultados

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Para investigar la presencia de agregados proteicos ricos en láminas β en células de cáncer de mama, se sometieron líneas celulares MCF7 y Hs578T a tinción con ThT seguidas de cuantificación por fluorescencia. Como se muestra en la Figura 1, las células se sembraron en cuatro pozos de una placa de 96 pozos, con uno designado como control sin tinción. Los tres pozos restantes fueron teñidos con ThT según el protocolo estándar. La fluorescencia se midió median...

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Discusión

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Al sembrar células en placas de 96 pozos, a menudo es difícil lograr una distribución uniforme a lo largo de la superficie del pozo, ya que agitar o golpear suavemente la placa para dispersar las células no siempre es factible. Esta distribución desigual puede introducir variabilidad en la intensidad de la señal a lo largo del pozo. La lectura de fluorescencia multipunto reveló una variación significativa entre diferentes regiones dentro del mismo pozo, lo que pone de manifiesto este ses...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen con gratitud la asistencia técnica proporcionada por el Laboratorio Básico de Medicina Básica de la Facultad de Medicina de la Universidad I-Shou. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Hospital E-DA [EDAHJ114001 a C.-C.C.] y del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de Taiwán [NSTC 112-2813-C-214-032-B a B.-H. C]

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placa de cultivo de 96 pozosSimplementePC396-0100
ContradeslizamientoInvitrogenC10228
Contador Automatizado de Celdas Countess II FLThermo Fisher Scientific y nbsp;AMQAF1000
dPBSSimplementeCC704-0500
Tubo de EppendorfSimplementePC101-5000
Hoechst 33342AAT Bioquest17530
SpectraMax iD3Dispositivos moleculares735-0391 
Tioflavina TSigma-AldrichT3516
Trippan BlueInvitrogenT10282

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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