Un modelo de ratón basado en cinta de correr para investigar sofocos con monitoreo continuo de la temperatura de la piel

Resumen

Este estudio establece un modelo de ratón de sofocos menopáusicos mediante la combinación de la ovariectomía con la termogénesis inducida por el ejercicio y el monitoreo continuo de la temperatura de la piel de la cola de alta resolución.

Resumen

Los sofocos afectan significativamente la calidad de vida en las mujeres menopáusicas, sin embargo, los mecanismos neuronales subyacentes y las terapias efectivas siguen siendo poco conocidos. Un desafío importante en este campo ha sido la falta de modelos animales confiables y métodos no invasivos para el monitoreo continuo de la temperatura de la piel. Aquí, se desarrolló un modelo de ratón que combina la ovariectomía con la termogénesis inducida por el ejercicio para estudiar los sofocos. Usando un registrador telemétrico asegurado por una funda de cola impresa en 3D, la temperatura de la piel de la cola se monitoreó continuamente en un estado libre de estrés. Además, las cámaras infrarrojas proporcionaron un método complementario para monitorear la producción y disipación de calor, lo que permitió una evaluación más completa de la temperatura corporal. Usando este modelo, se encontró que los ratones ovariectomizados exhibían mayores aumentos de temperatura de la piel y menor temperatura corporal central, imitando efectivamente el fenotipo de sofocos observado en la menopausia. Este enfoque establece un modelo preciso para el monitoreo de sofocos y será valioso para los investigadores en estudios de termorregulación, neurociencia y menopausia clínica.

Introducción

Los sofocos se encuentran entre los síntomas más prevalentes y perturbadores de la menopausia, lo que afecta significativamente la calidad de vida¹. Estos episodios se caracterizan por un aumento repentino de la temperatura de la piel seguido de una caída transitoria de la temperatura corporal central², a menudo acompañada de aumento de la frecuencia cardíaca, ansiedad y mareos³. A pesar de su profundo impacto, los tratamientos efectivos siguen siendo limitados⁴, lo que subraya la necesidad de una comprensión más profunda de sus mecanismos subyacentes.

Un paso crítico en el estudio de los sofocos es el desarrollo de modelos animales confiables que repliquen con precisión la disfunción termorreguladora. Actualmente, el abordaje primario involucra la ovariectomía (OVX), que induce alteraciones de la temperatura corporal de la piel y del núcleo⁵. Sin embargo, estos cambios suelen ser inconsistentes, ya que pueden confundirse con el estrés o las fluctuaciones de la temperatura ambiente⁶. Además, la captura de eventos esporádicos similares a los sofocos sigue siendo un desafío. Los métodos alternativos emplean agentes farmacológicos (p. ej., senctida, capsaicina, tamoxifeno o naloxona) para desencadenar la vasodilatación cutánea aguda en roedores ^7,8,9. Si bien estos compuestos producen aumentos rápidos y medibles de la temperatura de la piel, su administración invasiva y sus efectos dependientes de la dosis complican la interpretación de las respuestas termorreguladoras. Además, no está claro si la vasodilatación inducida por fármacos recapitula completamente las condiciones fisiológicas de los sofocos naturales. Por lo tanto, se necesita urgentemente un modelo animal más refinado y confiable.

El ejercicio es un modulador bien conocido de la temperatura corporal y se ha relacionado con la inducción de sofocos en humanos¹⁰. Algunos estudios han aprovechado el ejercicio forzado en ratones para imitar patrones de disipación de calor que se asemejan a los sofocos 11,12,13. Aunque este enfoque proporciona un medio no invasivo para provocar fluctuaciones de temperatura, monitorear la temperatura de la piel en ratones activos, particularmente a través de termografía infrarroja, es técnicamente un desafío. Además, una evaluación integral de los síntomas similares a los sofocos requiere un registro continuo y a largo plazo de la temperatura corporal central y de la cola.

Para superar estas limitaciones, se desarrolló un modelo de ratón optimizado que combina la ovariectomía con el ejercicio inducido por la cinta rodante para evocar de manera confiable respuestas termorreguladoras similares a los sofocos. En el experimento, los ratones C57BL/6J de 8 a 10 semanas se alojaron en condiciones estándar (ciclo claro-oscuro 12:12, 22 °C ±1 °C, 50% ± 10% de humedad). Además, se diseñó un registrador de temperatura telemétrico asegurado por un manguito de cola impreso en 3D para permitir un monitoreo continuo y sin estrés de la temperatura de la cola en ratones que se mueven libremente. También se incorporó la termografía infrarroja para proporcionar datos complementarios sobre la producción y disipación de calor. Este modelo servirá como una herramienta valiosa para investigar los mecanismos de los sofocos y evaluar posibles intervenciones terapéuticas.

Protocolo

Estos métodos fueron diseñados para modelos de ratón. Los estudios con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Fudan (2021JS0040). Antes de la implementación del protocolo, los animales se alojaban de conformidad con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio. En este estudio, se alojaron ratones hembra C57BL/6J de 8 a 10 semanas de edad, con un peso de 20-23 g, en condiciones estándar (ciclo claro-oscuro de 12:12 h, 22 °C ± 1 °C, 50% ± 10% de humedad). Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Preparación experimental

1. Prepare diez ratones hembra de 8-10 semanas alojados en condiciones estándar (ciclo claro-oscuro 12:12, 22 °C ±1 °C, 50% ± 10% de humedad) con comida y agua ad libitum .
2. Asigne aleatoriamente ratones en grupos OVX y simulados (n = 5 / grupo). Casa agrupada para ayudar con la sincronización de los ciclos estrales.
3. Configuración del protocolo de la cinta de correr
   1. Abra el software de control de la cinta de correr "TSE TreadMill (USB) 5.1.7_2" en la computadora conectada (Figura complementaria 1).
   2. Inicialice un nuevo archivo experimental seleccionando Archivo > Inicializar un nuevo archivo en la barra de menús.
   3. Programe el protocolo de ejecución:
      1. Establezca el primer segmento: aceleración de 0-20 s de 0-0,17 m/s.
      2. Ajuste el segundo segmento: 20-150 s de velocidad constante a 0,17 m/s.
      3. Establezca el tercer segmento: aceleración de 150-170 s de 0,17-0,25 m/s.
      4. Ajuste el segmento final: 170-600 s a velocidad constante a 0,25 m/s^10,12.
         NOTA: No utilice estimulación eléctrica en este experimento para evitar estrés adicional.

2. Monitoreo del ciclo estral

1. Frote los hisopos vaginales en un portaobjetos de tinción diariamente a la misma hora todos los días durante 8 días consecutivos enjuagando con 100 μL de PBS estéril con una pipeta.
2. Seque las muestras al aire en portaobjetos durante 24 h en una campana extractora.
3. Sumerja brevemente las muestras en metanol al 100% a temperatura ambiente.
   PRECAUCIÓN: El metanol es tóxico por inhalación, ingestión o contacto con la piel. Úselo en una campana extractora bien ventilada, use guantes de nitrilo y evite chispas / llamas.
4. Diluya el tinte comercial 20× Giemsa al 1× usando PBS.
5. Tiñir los portaobjetos fijados de metanol con 1× Giemsa en la oscuridad durante 1-2 h.
6. Examinar la citología vaginal para determinar los estadios estrales con base en estos estudios^14,15.
7. Proceda con los experimentos cuando los ratones estén en proestro (Figura 2B).
   NOTA: Manipule los ratones con cuidado para evitar la interrupción del ciclo inducida por el estrés. Evite la inserción profunda de las puntas de pipeta para prevenir el pseudoembarazo.

3. Cirugía de ovariectomía

1. Registre el peso de los ratones y anestesitéelos con isoflurano. Use una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal del animal durante la operación.
2. Afeitar el pelo de la región dorsolateral bilateralmente antes de las patas traseras y desinfectar con etanol al 70% y yodo alternativamente 3 veces.
3. Haga una incisión paravertebral de 1 cm de largo en la piel y use un instrumento de punta roma para separar la piel del tejido muscular subyacente. Luego, haga la incisión en la pared muscular. Exponga las almohadillas de grasa ovárica con palitos de algodón.
4. Lite los vasos sanguíneos ováricos con suturas. Extirpar los ovarios con tijera quirúrgica¹⁶.
5. Cierre la incisión en capas, músculo y piel con suturas no absorbibles. Limpie la piel alrededor del sitio quirúrgico suavemente con solución salina para eliminar la sangre seca o el exfoliante antiséptico residual.
6. Para controles simulados, corte un trozo de la almohadilla de grasa sin tocar los ovarios.
7. Controle la salud de los ratones diariamente durante 7 días después de la operación.
   NOTA: Asegúrese de que los ratones se mantengan en una almohadilla térmica a unos 35 °C durante todo el proceso de anestesia.

4. Implantación del registrador de temperatura central

1. Programación e inicialización del registrador (Figura complementaria 2).
   1. Inserte el registrador de temperatura verticalmente en la estación de acoplamiento.
   2. Haga clic en Grabadora > Conectar en la barra de menú del software.
   3. Seleccione Editar > nueva definición de medición en la barra de menús.
   4. Elija Múltiples intervalos de grabación en las opciones del modo de grabación.
   5. Ajuste de parámetros: Fecha de inicio: [AAAA-MM-DD HH:MM], Fecha de finalización: [AAAA-MM-DD HH:MM], Intervalo de grabación: 5 min.
   6. Agregue la configuración de intervalos a la secuencia.
   7. Haga clic en Grabadora > iniciar nueva secuencia de medición.
2. Bajo anestesia, afeite y desinfecte la piel del abdomen.
   NOTA: Este procedimiento de implantación de registrador de temperatura abdominal se puede realizar junto con la cirugía OVX para evitar múltiples cirugías.
3. Hacer una incisión cutánea de 2 cm en la línea media aproximadamente 1 cm por debajo del diafragma.
4. Extienda la incisión a lo largo de la línea alba para abrir la cavidad peritoneal.
5. Inserte suavemente el registrador de temperatura central en la cavidad abdominal a lo largo del plano sagital.
   NOTA: La colocación adecuada es fundamental para obtener lecturas de temperatura precisas. Evite la posición superficial cerca de la piel, ya que la temperatura ambiente puede interferir con las mediciones.
6. Sutura la incisión abdominal con suturas 5-0 no absorbibles.
7. Desinfecte el abdomen con solución yodada.
   NOTA: Supervise de cerca al animal durante la recuperación. Mantenga un ambiente cálido con una almohadilla térmica hasta que los ratones estén completamente despiertos.

5. Accesorio de registrador de temperatura montado en la cola

1. Programación e inicialización del registrador (consulte el procedimiento del paso 4.1, modificando el intervalo de grabación a 2 min).
2. Limpia la cola con un golpe de etanol. Desinfecte el manguito 3D con etanol al 70% y sujete el registrador de temperatura dentro del manguito.
3. Aplique adhesivo de curado rápido a la manga. Coloque el registrador a 1 cm de la base de la cola (Figura 1A). Asegúrese de que la cara de detección del registrador esté en estrecho contacto con la piel. Asegúrese de que el registrador esté fijo en el lado ventral de la cola para minimizar la carga de movimiento.
4. Manténgalo en su lugar con presión durante 2 min. Use anestesia breve si es necesario para una colocación precisa.
   NOTA: Controle diariamente la hinchazón de la cola o el desprendimiento del registrador después de la colocación. Un dispositivo correctamente conectado podría permanecer bien durante al menos 3 días.

6. Carrera en cinta de correr y recopilación de datos

1. Aclimatar a los ratones a la cinta de correr durante la fase de luz durante 3 días utilizando el protocolo del paso 1.3.
   1. Coloque los ratones individualmente en la cinta de correr estacionaria. Deje 10 minutos para la exploración y habituación ambiental.
   2. Ejecute el protocolo:
      1. Haga clic en el botón Medir . Haga clic en Iniciar para inicializar la cinta de correr.
      2. Seleccione Iniciar perfil para comenzar el protocolo de ejecución programado.
2. Coloque el registrador de temperatura de cola 24 h antes de los experimentos para una buena habituación (consulte el paso 5).
3. Cinta de correr corriendo en la fase ligera del día experimental:
   1. Registre la temperatura de referencia durante 30 s con una cámara infrarroja 10 minutos antes del ejercicio. La temperatura central se registra simultáneamente utilizando el registrador de temperatura abdominal implantado.
   2. Ejecute ratones en la cinta de correr según el protocolo del paso 1.3.
      NOTA: Asegúrese de que los ratones funcionen continuamente durante 600 s. Si los ratones dejan de correr, fomente suavemente el movimiento continuo con un cepillo para el cabello.
   3. Después de correr en la cinta de correr, transfiera los ratones a jaulas limpias. Mida la temperatura de la cola mediante termografía infrarroja a los 0 min, 5 min, 10 min y 15 min después del ejercicio.

7. Análisis de datos

1. Para datos infrarrojos y de temperatura central:
   1. Calcule la línea de base como la temperatura promedio antes del ejercicio.
   2. Grafique ΔT (línea de base de temperatura posterior al ejercicio) para cada punto de tiempo.
2. Para los datos del registrador de temperatura de cola:
   1. Use el promedio de 10 minutos antes del ejercicio como línea de base.
   2. Calcule ΔT a intervalos de 2 minutos durante 15 minutos después del ejercicio.

Resultados

Desarrollo de un sistema de monitorización termorreguladora fiable

Para establecer un modelo confiable para medir la temperatura central y de la piel, se diseñó una funda de cola impresa en 3D personalizada para sujetar de forma segura un registrador de temperatura a 1 cm de la base de la cola (Figura 1A), lo que permite una medición continua y precisa de la disipación de calor dura...

Discusión

Este estudio establece un modelo de ratón práctico y cuantitativo para investigar los sofocos menopáusicos, abordando una brecha crítica en el campo. La integración de la ovariectomía con la termogénesis inducida por el ejercicio recapitula con éxito las características centrales de los sofocos humanos, a saber, un rápido aumento de la temperatura de la piel de la cola seguido de una disminución de la temperatura corporal central¹⁸. Este modelo combina y amplía la...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Registrador de temperatura implantable para animales	Star-Oddi	DST nano-T
Ratones C57BL/6J	GemPharmatech	N000013
Giemsa Solución de tinción	Tiempo de beyo.	C0133
Imágenes térmicas infrarrojas	VarioCAM	Cabezal VC HD 980
Sistemas de cinta de correr	TSE	Treadmill_6M