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Mutagénesis basada en CRISPR-Cas9 en el nematodo entomopatógeno Steinernema hermaphroditum y el mantenimiento de líneas mutantes

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DOI:

10.3791/68932

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30 de diciembre de 2025

 , 
1Division of Biosphere Sciences and Engineering, Carnegie Institution for Science

En este artículo

Resumen

Este artículo demuestra la ingeniería genómica mediada por CRISPR-Cas9 en Steinernema hermaphroditum, un nematodo entomopatógeno (EPN: insectoparasito) y un modelo genético emergente. La tecnología descrita es útil para crear mutantes, permitiendo la elucidación de funciones génicas en la biología de los nematodos relevantes para la simbiosis mutualista y parasitaria.

Resumen

Los nematodos entomopatógenos (EPNs) del género Steinernema y Heterorhabditis mantienen interacciones mutualistas con bacterias simbióticas Xenorhabdus y Photorhabdus , respectivamente. Juntos, estos pares nematodo-bacteria infectan y matan insectos hospedadores que son principalmente larvas de los órdenes de Lepidópteros y Coleópteros, formando un sistema tripartito manejable para diseccionar la base molecular del mutualismo y el parasitismo. Un paso clave para aprovechar plenamente este modelo es el desarrollo de herramientas genéticas estables y transgeneracionales en las NEP. Aquí demostramos una plataforma fiable de edición genómica CRISPR–Cas9 en el modelo emergente Steinernema hermaphroditum, una especie que se mantiene fácilmente in vivo e in vitro, y que es altamente susceptible de microinyección gonadal. Es importante destacar que su reproducción hermafrodita agiliza enormemente la generación y el mantenimiento de líneas mutantes homocigotas. Proporcionamos un protocolo detallado para la alteración génica eficiente y dirigida utilizando la administración basada en microinyección de complejos ribonucleoproteicoicos Cas9. Como prueba de concepto, modificamos el gen conservado asociado al músculo unc-22, generando un fenotipo característico de espasmos que valida la mutagénesis dirigida en este sistema. Esta plataforma CRISPR–Cas9 abre la puerta a la manipulación genética estable en S. hermaphroditum, como la expresión de transgénicos, y proporciona un marco que puede extenderse a especies adicionales de EPN de importancia agrícola y ecológica.

Introducción

Los nematodos entomopatógenos (EPN) son parásitos matadores de insectos que forman asociaciones mutualistas específicas de cada especie con sus simbiontesbacterianos 1. Las EPN constan de dos familias: Steinermatidae y Heterorhabditidae, que se asocian con bacterias Gramnegativas Photorhabdus y Xenorhabdus spp, respectivamente 2,3. Durante la etapa juvenil infecciosa de vida libre (IJ) de los nematodos Steinernema, las bacterias Xenorhabdus se alojan en un bolsillo intestinal del nematodo conocido como receptáculo, y al penetrar el insecto huésped en el hemocelo, las bacterias se liberan, tras lo cual se multiplican y matan al insecto por septicemia 3,4. En esta relación mutualista, las bacterias producen compuestos antimicrobianos e insecticidas que protegen contra la respuesta inmunitaria del huésped y proporcionan soporte nutricional al nematodo5. A cambio, las bacterias se benefician de la protección proporcionada por el hospedador nematodo frente a microbios ambientales y se les facilita su dispersión a nuevas presasinsectos 6,7.

En las últimas décadas, la asociación Steinernema-Xenorhabdus se ha establecido como un potente sistema experimental para estudiar diversos aspectos de las interacciones parasitarias y mutualistas, como los comportamientos de búsqueda de insectoshospedadores 3, la colonización bacteriana en el hospedador nematodo8 y los comportamientos adaptativos de bacterias simbióticas que facilitan sus transiciones entre nematodos y animales hospedadores deinsectos 9. Los EPN también son especies importantes para la sostenibilidad del suelo y se utilizan como agentes orgánicos de control de plagas para promover la productividadagrícola 10,11.

A pesar del rápido desarrollo de herramientas genéticas en las bacterias simbióticas Xenorhabdus y Photorhabdus12, las herramientas genéticas consistentes en las EPN han sido escasas. La microinyección gonadal se ha establecido con éxito tanto en nematodos Heterorhabditis como enSteinernema 13,14. Anteriormente, la microinyección gonadal en Heterorhabditis bacteriophora se ha utilizado para suministrar consistentemente ARN de doble cadena para la destrucción génica entre la primera generación de descendientes13,15. Recientemente, se ha desarrollado la edición genómica CRISPR-Cas9 en Steinernema, administrada mediante microinyección gonadal, y ha dado lugar a mutaciones precisas, estables yheredables 14.

Una especie de Steinernema, S. hermaphroditum, ha demostrado ser altamente manejable y con gran potencial como organismo modelo genéticoemergente 4,14. Originalmente aislado del suelo en Indonesia16 y vuelto a aislar en India17, S. hermaphroditum es consistentemente hermafrodita, con un pequeño número de machos en cada generación, dos características que facilitan la adaptación de herramientas genéticas del nematodo modelo clásico C. elegans4. Además, el genoma de S. hermafroditum ha sido secuenciado y ensamblado en cromosomas, simplificando la tarea de identificar posibles sitios objetivo de Cas9 y diseñarcebadores 18.

Durante la microinyección de EPN, se administra al nematodo sincitial mediante una aguja extraída de un capilar de cuarzo sincicial que contiene reactivos apropiados, como dsRNAs, proteínas Cas9 o ARN guía. El volumen y la presión adecuados de inyección resultan en un 'flujo' visible de líquido a lo largo del brazo gonadial. Dado que estos nematodos tienen un par de gónadas sincitiales compuestas por núcleos de línea germinal que comparten el mismocitosol 19, este enfoque de microinyección permite que múltiples células germinales estén disponibles para su edición, antes de que ocurra la citocinesis, separando así los núcleos germinales en ovocitosen desarrollo 20. Aunque la microinyección gonadal sirve como una técnica consistente para la modulación genética en varias especies de nematodos no modelo 14,21,22,23,24,25, es crucial adaptar las técnicas de inyección a las estructuras gonadales adecuadas, al estado vital y a las condiciones fisiológicas de cada especie para asegurar el éxito y una alta eficiencia en la administración. Las técnicas de recuperación tras la inyección y el mantenimiento de las líneas mutantes son importantes para garantizar que esta técnica sea rentable.

Este estudio demuestra un protocolo de edición genómica CRISPR-Cas9 en Steinernema hermaphroditum. La microinyección gonadal se describe en el adulto joven, una etapa resistente a la microinyección a alta presión y receptiva a la edición genética14. Además, se proporcionan métodos detallados que describen el mantenimiento de líneas hereditarias y estables de mutantes, tanto mediante criopreservación como mediante propagación a través de insectos.

Protocolo

Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación del nematodo antes de la microinyección

  1. Preparar placas de Medio de Crecimiento Nematodo (NGM) sembradas con bacterias Xenorhabdus griffiniae y Comamonas aquaticus.
    NOTA: Cultivar nematodos de S. hermaphroditum en su bacteria simbiótica nativa Xenorhabdus griffiniae antes de la microinyección para maximizar el crecimiento de los nematodos y recuperar animales inyectados en la bacteria Comamonas aquaticus para aumentar la supervivencia tras la inyección14.
    1. Streake la bacteria X. griffiniae en placas de agar de piruvato LB (2,5 g de extracto de levadura, 5 g de triptona, 2,5 g de cloruro sódico, 0,5 g de piruvato sódico, 7,5 g de agar en 500 mL de agua) e incuba durante la noche a 30 °C.
    2. Raya la bacteria C. aquaticus en placas de agar LB e incuba durante la noche a 37 °C.
    3. Elige una sola colonia de bacterias para inocular medios líquidos oscuros de LB (5 g de extracto de levadura, 10 g de triptona, 5 g de cloruro de sodio en 1 litro de agua). Cultivar cultivos bacterianos durante la noche (máximo 16 horas) con aireación (X. griffiniae a 30 °C y C. aquaticus a 37 °C).
    4. Preparar agar NGM: (3 g de NaCl, 2,5 g de peptona y 20 g de agar añadidos a 975 mL de agua, con 1 mL de colesterol, 1 mL 1 MCaCl 2, 1 mL 1 M MgSO4, 25 mL 1 MKPO 4 añadidos tras autoclave) 10 mL por placa de Petri de 60 mm x 15 mm.
    5. Bacterias semilla: Añade unas gotas del cultivo bacteriano de la noche a cada placa de agar NGM, agita suavemente para esparcir las gotas bacterianas en un parche.
    6. Incubar placas NGM sembradas por bacterias a temperatura ambiente para permitir que el agar se seque y las bacterias crezcan.
      NOTA: Las placas con semillas de X. griffiniae deben usarse lo antes posible; Las placas de C. aquaticus pueden almacenarse a temperatura ambiente durante 1-2 semanas.
  2. Etapa del nematodo
    NOTA: Elige la etapa J3 del hermafrodita la noche antes de la inyección y los adultos jóvenes el día de la inyección.
    1. Selecciona o trozoa los nematodos de S. hermafroditum sobre las placas NGM preparadas sembradas con X. griffiniae. Incubar a una temperatura de 25-28 °C para un crecimiento óptimo.
    2. La noche antes de la microinyección, selecciona la etapa J3 de hermafroditas sobre agar NGM sembrado con X. griffiniae. Como se muestra en la Figura 1A, la etapa J3 se estima por el tamaño del nematodo y la morfología de las gónadas y la vulva.
    3. El día de la microinyección, elige hermafroditas jóvenes adultos (Figura 1B).

2. Preparación CRISPR-Cas9 para microinyección

  1. Selección de los crRNAs CRISPR y almacenamiento de reactivos
    1. Extrae la secuencia génica objetivo del genoma de referencia Steinernema hermaphroditum usando BlastP, PRJNA982879.
    2. Selecciona una secuencia de exones codificante temprano, si es posible, preferiblemente el primer exón, e introduce la secuencia en CRISPRScan usando la configuraciónpor defecto 26 para generar una lista de posibles ARN CRISPR (crRNAs).
    3. Haz explosión de los crRNAs superiores contra el genoma de S. hermafroditum para asegurarte de que solo se seleccionen crRNAs únicos.
      NOTA: Opcional: Confirmar la secuencia de la región objetivo del genoma mediante amplificación por PCR y secuenciación Sanger antes del diseño de crRNA, para asegurar la unión eficiente de los crRNAs.
    4. Almacena los ARN CRISPR (CRRNAs) y los ARN CRISPR transactivadores universales (tracrRNAs) a 100 μM cada uno en un buffer dúplex a -80 °C.
    5. Almacena la proteína Cas9 a 10 mg/mL a -20 °C o -80 °C. Guarda 1 M KCl a 4 °C.
  2. Elaboración de la almohadilla de agarosa al 2% para la inyección (adaptado de Berkowitz et al.27)
    1. Derrite el 2% de agarosa en agua usando un microondas.
    2. Transfiere 50 μL de agarosa fundida a un vaso de cubierta (48 x 60 mm nº1). Cubre inmediatamente la gota de agarosa con otro vaso de cobertura.
    3. Deja que la agarosa seque a temperatura ambiente durante 20 minutos. Quita el cristal superior de la tapa. Etiqueta la parte frontal de la almohadilla de agarose.
      NOTA: Opcional: Hornear la almohadilla de agarosa a 37 °C durante la noche para secar aún más la almohadilla.
    4. Guarda las compresas de agarosa al 2% a temperatura ambiente durante meses o años.
  3. Preparación de la aguja
    1. Fabricar agujas de cuarzo utilizando los siguientes parámetros en un extractor de filamento láser. Con el extractor de agujas utilizado en este estudio, el programa sugerido es el siguiente: Calor: 700, Filamento: 4, Velocidad: 60, Retardo: 145, Tirón: 175.
    2. Saca las agujas de cuarzo (diámetro exterior: 1,0 mm, diámetro interior: 0,7 mm) justo antes de la inyección o con antelación, y guárdalas en una caja de almacenamiento de pipetas.
      NOTA: Alternativamente, también hemos tenido éxito inyectando con agujas de borosilicato (OD: 1,2 mm, DI: 0,68 mm). Ten en cuenta que diferentes tamaños de agujas coinciden con distintos tamaños de portaagujas.

3. Microinyección CRISPR-Cas9 y recuperación de los nematodos tras microinyección

  1. Preparar la mezcla de microinyección CRISPR-Cas9 (adaptada de Wang et al.28)
    1. Prepara dúplexes de ARN guía frescos mezclando los crRNAs elegidos y el trazrARN universal en una proporción 1:1, es decir, CRRNA total a trazrARN en un tubo PCR:
      ARNc #1 (100 μM) - 1,5 μL
      ARNc #2 (100 μM) - 1,5 μL
      TrazrRNA (100 μM) - 3,0 μL
      NOTA: Si se utiliza co-CRISPR, el crRNA #1 está dirigido al gen marcador unc-22 , mientras que el crRNA #2 puede ser reemplazado por otra secuencia que apunte a un segundo gen de interés.
    2. Incuba el tubo de PCR en un termociclador a 94 °C durante 2 minutos y luego enfría hasta temperatura ambiente.
    3. Monta la mezcla de inyección combinando lo siguiente, luego incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente:
      Cas9 (10 mg/mL) - 2 μL
      1M KCl - 0,58 μL
      Dúplexes de gRNA (del paso 3.1.1) - 2,7 μL
    4. Mezcla tres veces haciendo un chasquido del tubo de PCR, seguido de un breve giro (10-15 s) en una mini centrifugadora para recoger el contenido del tubo. Después de la mezcla final, baja el centrifugado durante más tiempo, hasta 1 minuto.
  2. Carga y rompe la aguja
    1. Carga la aguja con 1-2 μL de mezcla de inyección usando una punta microcargadora.
    2. Monta la aguja al soporte de la pipeta, luego abre la punta arrastrando la aguja por un trozo de cinta adhesiva de doble cara cubierto de aceite de halocarbono. Prueba la apertura de la aguja usando la función CLEAN del microinyector.
  3. Microinyección en las gónadas sinciciales de un nematodo adulto joven
    1. Transfiere una pequeña gota de aceite de halocarbono a una almohadilla de agarosa al 2%.
    2. Bajo el estereoscopio de disección, utiliza un fino alambre de platino (blando) para recoger un nematodo hermafrodita adulto joven y lavarlo en un buffer M9 (por litro: 3 gKH 2PO4, 11,3 g Na2HPO 4, 5 g de NaCl, con 1 ml 1 MMgSO 4 añadido tras el autoclave) para eliminar bacterias (véase nematodo adulto joven en la Figura 1).
    3. Transfiere el nematodo lavado a una almohadilla de agarosa y colócalo en la gota de aceite de halocarbono. Utiliza un alambre de platino suave para cepillar suavemente el nematodo hasta que el animal quede inmovilizado.
    4. Coloca cuidadosamente la almohadilla de agarosa en la etapa de microinyección. La orientación del sincicio gonadadal debe apuntar hacia la aguja en un ángulo de aproximadamente 45°. Empieza con aumento de 5x, luego cambia a 20x y 40x para las inyecciones.
    5. Asegúrate de que la aguja penetre en el sincicio, luego utiliza la función CLEAN del microinyector para introducir la mezcla de inyección a aproximadamente 99 psi hasta que se observe un flujo gonadal claro de líquido inyectado para asegurar que los reactivos accedan a las células germinales en el sincicio gonadal.
    6. Si el segundo brazo gonadal está accesible, mueve el escenario para posicionar la aguja y inyectar en el segundo brazo.
  4. Recuperación del nematodo tras la inyección
    1. Inmediatamente después de la inyección, resuspende al animal inyectado en 1-2 μL de buffer M9 sobre la almohadilla de agarosa.
    2. Usando un hilo fino de platino, recoge el nematodo inyectado de la almohadilla de agarosa y enjuagua el aceite usando un tampón M9.
    3. Recuperar los nematodos en placas NGM con un césped de bacterias C. aquatica (preparación de placas NGM: véase el paso 1.1), lo que aumenta la tasa de supervivencia de los nematodos tras la inyección14. Incuba a 25 °C durante la noche.
    4. Al día siguiente, aísla cada nematodo inyectado (P0) en una placa individual de NMN sembrada con X. griffiniae. Deja que los animales P0 produzcan descendencia F1 durante la noche (ya sea poniendo huevos o embolsando) para fenotipado y genotipado (véase el paso 4).

4. Cribado para confirmar nocauts mediados por CRISPR-Cas9

  1. Cribado basado en nicotina (PRECAUCIÓN) de F1 para detectar fenotipo de espasmos al usar unc-22 como marcador co-CRISPR
    1. Transfiere la descendencia F1 de animales inyectados con P0 a una solución de nicotina al 2%.
    2. Elige un animal individual con espasmos del punto de nicotina y recupera inmediatamente al animal con agar NGM con semillas de X. griffiniae. Aisla cada F1 tembloroso en una placa individual y deja que produzca animales F2 para el genotipado (véase el paso 4.2).
  2. Genotipado
    1. Elige ocho descendientes F2 o F3 de cada línea de espasmos F1 para el genotipado. Estos animales probablemente incluyen tanto heterocigotos +/mut como homocigotos mut/ mut.
    2. Preparar un tampón de extracción de ADN fresco añadiendo 20 μL de Proteinasa K (10 mg/mL) a un tampón de lisis de gusanos de 180 μL (50 mM KCl, 10 mM Tris pH 8,0, 2,5 mMMgCl 2, 0,45% NP-40, 0,45% Tween 20, 0,01% gelatina).
    3. Añadir nematodos a 10 μL del buffer de extracción de ADN en tubos PCR. Incubar a 65 °C durante 10 minutos, luego 95 °C durante 15 minutos para extraer ADN genómico.
    4. Genotipa los nematodos amplificando por PCR la región objetivo de Cas9 siguiendo las instrucciones del fabricante, utilizando 1-2 μL de lisato del paso 4.2.2. Es importante permitir un espacio amplio, si es posible (al menos 300 pb), entre los sitios de corte Cas9 y los sitios de unión del cebador en caso de que ocurran eliminaciones grandes.
      NOTA: La electroforesis en gel de agarosa puede utilizarse para confirmar la amplificación exitosa antes de la secuenciación.
    5. Limpia el producto de PCR siguiendo las instrucciones del fabricante para asegurar un análisis preciso de trazas de secuenciación de Sanger.
    6. Secuenciar los amplicones de PCR generados en el paso 4.2.4 usando secuenciación Sanger y analizar los cromatogramas usando el programaICE 29.
    7. Si se confirman alelos mutantes en el paso 4.2.6, vuelve a la placa de espasmos F1 original y aísla al menos ocho hermafroditas en placas individuales. Permite que cada nematodo produzca descendencia y luego masifica el genotipo de la descendencia para confirmar la homocigosidad. Las líneas homocigotas pueden mantenerse en laboratorio como se describe en el paso 5.

5. Mantenimiento de la línea CRISPR

NOTA: Existen tres métodos principales de mantenimiento de la línea. Estos incluyen criopreservación basada en trehalosa y DMSO (paso 5.1), paso in vivo a través de gusanos de cera (paso 5.2) y mantenimiento in vitro en placas NGM (paso 5.3).

  1. Criopreservación de líneas salvajes y mutantes por trehalosa-DMSO
    NOTA: Utilizando un método de criopreservación de trehalosa-DMSO4, S. hermafroditum puede almacenarse de forma estable a largo plazo a -80 °C y recuperarse en un medio NGM. Los nematodos se congelan en frascos criogénicos de 2 mL. La congelación óptima se logra mediante un enfriamiento gradual utilizando un recipiente de espuma de poliestireno.
    1. Cultivar S. hermafroditis en NGM sembrada con X. griffiniae (véase el paso 1.1) hasta que la mayoría de la población sea J1 o hermafroditas en bolsa.
      NOTA: Evita las fases juveniles infecciosas (IJ) ya que no se congelan bien con este método.
    2. Lava los gusanos nematodos de las placas de agar NGM en el buffer M9 y recóllense en tubos cónicos de 15 mL hasta la marca de 5 mL. Concentra por centrifugación (1372 x g durante 1-2:30 min es suficiente).
    3. Retirar el sobrenadante y lavar una vez en un tampón de congelación Trehalosa-DMSO a temperatura ambiente de 5 mL mediante centrifugación siguiendo los parámetros proporcionados en el paso 5.1.2.
    4. Resuspende los gusanos en un tampón congelante Trehalosa-DMSO a temperatura ambiente de 5 mL. Incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos con el tubo de lado. Esto aumenta la tasa de supervivencia.
    5. Dispensar 1 mL por tubo en 4 viales criogénicos.
    6. Coloca los frascos en cajas de espuma de poliestireno en el congelador a -80 °C.
    7. Una semana después, haz una prueba de descongelación de uno de los viales.
    8. Transfiere el resto de los viales a cajas congeladoras a -80°C y guárdalas de forma permanente.
    9. La prueba de deshielo o recuperación de S. hermafroditum de poblaciones congeladas
      1. Saca un vial del congelador y déjalo descongelarse completamente a temperatura ambiente.
      2. Vierte el contenido líquido sobre un plato nuevo de NGM. Tenga en cuenta que la adición de una bacteria simbiótica no es necesaria, ya que el stock congelado suele contener suficientes bacterias simbióticas. Los gusanos deberían empezar a recuperarse en cuestión de minutos a horas.
      3. Observa el movimiento y la reproducción del nematodo. Después de uno o dos días, transfiere varios nematodos a nuevas placas NGM sembradas con X. griffiniae.
  2. Mantenimiento in vivo mediante Galleria mellonella
    NOTA: Para el crecimiento in vivo , propagar líneas mutantes de S. hermafroditum a través de larvas de Galleria mellonella (gusano de cera) en elquinto estadio. Este método es especialmente útil para líneas que no son viables tras la criopreservación. Un protocolo detallado y similar de propagación natural de nematodos entomopatógenos a través de insectos y otros medios para el crecimiento de EPN puede encontrarse en (McMullen et al.30). En resumen:
    1. Permitir que los nematodos mueran de hambre y se conviertan en IJs en placas NGM.
    2. Utiliza el buffer M9 para eliminar los IJs de las placas NGM.
    3. Transfiere IJs para infectar insectos Galleria usando la trampa blanca.
  3. Para el mantenimiento in vitro de placas NGM, sigue los pasos:
    1. Las placas de NGM de semilla con aproximadamente 100 μL de cultivo líquido fresco del simbionte S. hermafroditum , X. griffiniae.
    2. Deja que el parche bacteriano se seque completamente antes de transferir los nematodos a la placa.
    3. Guarda los platos a 25 °C y transfiere los nematodos a platos recién sembrados aproximadamente una vez al mes.

Resultados

Se diseñaron dos ARN CRISPR (identificados por el número de sitio Pam - Pam 3 y Pam 5) dirigidos al homólogo de S. hermafroditum de unc-22 en los sitiosPam 14 previamente publicados (Figura 2A). Cada crRNA se complejó con trazarRNA para formar un único ARN guía (sgRNA) y fue incorporado a Cas9 para formar la ribonucleoproteína descrita en el paso 3.1. En este protocolo, se diseñaron dos crRNAs para dirigirse al mismo gen; sin embargo, si se utiliza el método co-CRISPR desarrollado para su uso en C. elegans31, el crRNA #2 puede ser reemplazado por el gen de interés crRNA. Alternativamente, el crRNA unc-22 puede añadirse a los dos que apuntan al gen de interés, asegurándose de preservar la proporción 1:1 entre el crRNA total y el trazrARN.

El día anterior a las microinyecciones, se recogieron nematodos J3 tempranos bien alimentados con brazos gónadas visibles (Figura 1A) en una placa fresca sembrada con la bacteria simbiótica Xenorhabdus griffiniae y se dejó crecer hasta convertirse en adultos jóvenes durante la noche a temperatura ambiente (Figura 1B). El día de las inyecciones, los jóvenes adultos (Figura 1B) que portaban pocos o ningún embrión fecundado fueron aislados en una nueva placa de Petri para su inyección. Según la observación, los nematodos más jóvenes tenían una cutícula relativamente más penetrable; sin embargo, tenían menos probabilidades de recuperarse tras la inyección. La aguja se fabricó (véase el paso 2.3), se cargó con la mezcla de inyección y se rompió como se describe en el paso 3.2. El nematodo fue lavado en tampón M9 e inmovilizado en una gota de aceite de halocarbono sobre la almohadilla de agarosa (paso 2.2). En el lugar de inyección (Figura 1C), se utilizó la presión externa del microinyector para crear un flujo líquido visible en la sincitia gonadal, asegurando que los núcleos germinales quedaran bañados en la mezcla de inyección (paso 3.3). Cuando fue posible, ambas gónadas se inyectaron para aumentar la probabilidad de obtener descendencia editada de F1.

El nematodo inyectado (P0) se recuperó rápidamente lavándolo en el tampón M9 e incubado durante la noche en placas NGM sembradas con bacterias Comamonas aquaticus para una recuperación nocturna (paso 3.4). Aproximadamente entre el 40% y el 90% de los animales inyectados con P0 se recuperaron poco después de la inyección, y entre el 20% y el 90% de los nematodos P0 inyectados sobrevivieron durante la noche con C. aquatica. (Tabla 1). Los animales individuos P0 que sobrevivieron fueron luego aislados en placas de Petri NGM sembradas con X. griffiniae con una tasa de transferencia del 20% al 90%. Se realizó un cribado de nicotina para el fenotipo de deleción de UNC-22 en animales F1, F2 y F3 para determinar la heredabilidad de la deleción (paso 4.1). Los nematodos de S. hermafroditum con la deleción genética UNC-22 se contraen cuando están expuestos al 2% de nicotina, mientras que los nematodos salvajes quedan paralizados, lo que permite el cribado y selección de animales con supuestasdeleciones 28. En este experimento, hasta el 64% de los nematodos F1 aislados de P0 inyectados producen una descendencia F2 con espasmos constantes (Tabla 1). Para facilitar el cribado de inyecciones de co-CRISPR, se puede monitorizar y cuantificar nematodos individuales con espasmos mediante sistemas de imagen y seguimiento, con un ejemplo mostrado en la Figura 2B.

Para confirmar el genotipo de la progenie que espasma, se extrajo ADN genómico de nematodos F3 para genotipar el locus unc-22 (paso 4.2). Mediante amplificación por PCR de la región genómica que rodea los sitios objetivo, se observaron múltiples bandas tenues, que indican inserciones y deleciones (indels) pequeñas y grandes (Figura 2C,D), algunas de las cuales fueron confirmadas mediante análisis de secuenciación (Figura 2E). Estos datos sugieren que CRISPR-Cas9 creó rupturas de doble cadena en los sitios genómicos objetivo, que fueron reparadas mediante la unión de extremos no homóloga (NHEJ). Para confirmar la modificación específica del genoma a nivel de nucleótidos, se analizaron productos amplificados por PCR de los sitios objetivo mediante secuenciación de Sanger: la alineación de los cromatogramas tanto de los nematodos en espasmos como de tipo salvaje permitió identificar inserciones o deleciones en los sitios objetivo (Figura 2E). Una vez confirmadas mediante fenotipado y genotipado, las líneas mutantes CRISPR pueden mantenerse en laboratorio pasando por el insecto Galleria mellonella (gusano de cera) o preservarse mediante criopreservación (paso 5). Si se utiliza unc-22 como marcador de co-CRISPR, véase la Figura 3 para una ilustración de una estrategia sugerida para aislar mutaciones portadoras de F2 y F3 en el gen objetivo.

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Figura 1: Desarrollo de S. hermafroditum en un entorno de laboratorio. (A) Etapas estimadas del desarrollo de hermafroditas cultivadas en agar NGM alimentándose de su bacteria simbiótica X. griffiniae. Barra de la báscula = 50 μM. v = vulva; g = gónada. (B) Un hermafrodita adulto joven en la etapa adecuada de desarrollo para la microinyección gonadal. Caja azul: ubicación de la inyección gonadal. (C) La gónada sincitial del hermafrodita destinada a microinyección. Las dos gónadas están coloreadas en diferentes tonos de amarillo para facilitar la visualización. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 2: Resultados representativos de la edición genómica de CRISPR-Cas9 en S. hermaphroditum. (A) La estructura génica del homólogo unc-22 de S. hermaphroditum . Caja azul: el exón objetivo. Estrella negra: Pam 3 objetivo objetivo. Estrella roja: Pam 5 objetivo objetivo. (B) Análisis fenotípico de una prole representativa con espasmos basados en movimientos bruscos cuando se trata con nicotina al 2%. Blue: un adulto inquieto de una línea mutante de la UNC-22 . Naranja: un adulto de tipo salvaje paralizado por un 2% de nicotina. (C,D) Genotipado de nueve líneas independientes de contracciones F3 (1-9) de dos animales inyectados con P0. Cada muestra contiene cuatro descendientes F3 de la misma línea F1. Se usaron cebadores para amplificar la región genómica alrededor de Pam 3 (C) y Pam 5 (D). '+': control de tipo salvaje; "-": un control negativo sin ADN cargado. Cajas azules: ejemplo de amplicón de muestra heterocigoto confirmado en un gel de agarosa. Flecha negra en (C), el amplicón analizado en (E). (E) Análisis ICE del mutante unc-22 en Pam 3. La muestra PCR 5 de (C) (flecha negra) fue secuenciada y analizada usando ICE, mostrando que el 50% de los alelos eran de tipo salvaje, mientras que se detectaron varias mutaciones de deleción (que iban desde 20 pb hasta 31 pb) en el ADN genómico. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 3: Flujo de trabajo de cribado de Co-CRISPR para aislar mutantes en el gen objetivo. Al usar unc-22 como marcador de co-CRISPR, los nematodos F1 se examinan con un 2% de nicotina, y los F1 con espasmos se aíslan en placas NGM separadas sembradas con la bacteria simbiótica X. griffiniae. A continuación, se examina la descendencia de F2 de F1 que se contrae, y los F2 que no tienen espasmos se aíslan en placas individuales. Tras permitir que los F2 produzcan descendencia, se genotipan a los F3 para determinar si el gen objetivo ha sido eliminado. Los hermanos no nerviosos de los nematodos que tienen espasmos también pueden portar indels en el gen de interés y deben incluirse en el genotipado. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

ReplicarNo. P0 inyectadoNo. P0 que sobrevivió a las inyecciones*No. P0 que sobrevivió durante la nocheNo. P0 transferido a parches de X. griffiniaeNo. P0 con espasmos en F2% inyectado P0 que produjo espasmos de F2
1844300
29444333.33
311101010763.64
49422222.22

Tabla 1: Resultados representativos de la modificación del homólogo unc-22 de S. hermaphroditum mediante microinyección y tasa de éxito evidenciada por espasmos de la progenie. *La supervivencia se determinó por el movimiento de la bomba faríngea aproximadamente 30 minutos después de la microinyección.

Discusión

Los sistemas animales modelo genético no convencionales ofrecen valiosas oportunidades para estudiar la función génica eucariota dentro de los contextos ecológicos y fisiológicos en los que esos rasgos ocurren de forma natural, por ejemplo, en presencia de un huésped parásito o del microbioma nativo de un organismo. En nematodos entomopatógenos (EPNs), la manipulación genética se ha basado en algunos casos de enfoques basados en ARN13,32. Aunque el ARNi permite estudios genéticos funcionales en algunas especies, está limitado por la naturaleza transitoria del dsRNA, y el silenciamiento génico puede no ser heredable de forma fiable. Estas limitaciones subrayan la necesidad de herramientas genéticas estables ytransgeneracionales 33,34. El presente trabajo describe el primer protocolo para la edición precisa del genoma en Steinernematidos, una de las dos familias de EPN dentro del orden Rhabditida, como se demuestra en Cao (2023)14.

El éxito de la mutagénesis CRISPR–Cas9 mediante este protocolo depende del manejo cuidadoso de los nematodos. Las personas mal alimentadas suelen presentar gónadas colapsadas que son difíciles de penetrar con la aguja de inyección. El volumen de inyección debe ajustarse, ya sea agrandando ligeramente la abertura de la aguja o ajustando finamente la presión de inyección para asegurar que la gónada se enjuague correctamente con la mezcla de inyección. La transferencia rápida de los animales inyectados desde la almohadilla de agarosa a la placa de recuperación de C. aquatica es esencial para la supervivencia tras la inyección, y la velocidad de ejecución mejora sustancialmente con la experiencia. Después de la inyección, es importante que los nematodos heridos no estén expuestos a su bacteria simbiótica, ya que la recuperación en X. griffiniae es bajade 14.

El atasco de aguja es un desafío técnico común durante la microinyección. A veces se pueden eliminar los atascos arrastrando suavemente la aguja sobre cinta adhesiva de doble cara sumergida en aceite de halocarbono. Enjuagar bien los nematodos en M9 antes de la microinyección también evita que las bacterias simbióticas entren y obstruyan la aguja. Si persiste la obstrucción, agrandar cuidadosamente la abertura de la punta de la aguja puede restaurar el flujo, aunque hacerlo en exceso puede resultar en una expulsión incontrolada de la mezcla de inyección. La transición delborosilicato 14 a capilares de cuarzo para la fabricación de agujas mejoró notablemente el rendimiento de inyección. Las agujas de cuarzo producen puntas más afiladas, lo que facilita inyecciones exitosas en adultos algo mayores con cutículas más gruesas, aumentando así las tasas de supervivencia.

Una limitación actual de este protocolo es que la inserción de transgenes basada en CRISPR sigue siendo un reto y requiere una optimización adicional. La reparación dirigida por homología (HDR) de rupturas de doble cadena inducidas por Cas9 ha sido difícil de lograr en S. hermaphroditum utilizando donantes cortos de ssDNA14,35. La inserción precisa de transgenes es una capacidad clave en cualquier modelo genético, permitiendo modificaciones de alta fidelidad como sustituciones individuales de aminoácidos o reporterostranscripcionales 36. Por tanto, desarrollar un protocolo de knock-in mediado por CRISPR-Cas9 fiable avanzaría significativamente el conjunto de herramientas genéticas para las EPN y beneficiaría a las comunidades investigadoras más amplias en parasitología, simbiosis microbiana y más allá.

Divulgaciones

Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos a Margaret McFall-Ngai y Edward Ruby el uso de su microscopio confocal. Agradecemos a Alexis (Cody) Hargadon y Grischa Chen por su formación en microscopía confocal, y a Carly R. Myers por su ayuda para obtener las imágenes y el análisis de los vídeos de espasmos. También agradecemos a Stephanie Hampton por asignar fondos para la compra del sistema de microinyección. La Institución Carnegie para la Ciencia apoyó este trabajo.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Agar (malla 80-100)Fisher ScientificBP26411También se utiliza en placas de piruvato LB
AgaroseFisher Scientific16500500También se utiliza en genotipado
Alt-R CRISPR-Cas9 trazrRNAIDT1072532
Alt-R S.p. Cas9 Nucleasa V3IDT1081058
Agujas borosilicatasInstrumento de Precisión Mundial1B120F-4
Cloruro de calcio (CaCl2)Sigma AldrichC4901
Colesterol y piz;VWR4335 mg/mL en etanol
Comamonas aquatica (DA1877)
Tapa de vidrio para la almohadilla de agarosaLaboratorios de investigación cerebral#4860-1DEspesor No1 de 48 x 60 mm
CRISPRScanhttps://www.crisprscan.org/
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-Aldrich4723010,5 M
Limpieza y concentrador de ADN-5 Zymo ResearchD4014
Microinyector FemtoJet 4x con cabeza de agarre, portaagujas tamaño 4 0Eppendorf/Calibre5253000017
Larvas de 5º estadio de Galleria melonellaGrubCohttps://www.grubco.com/index.cfm
Sistema de imagen en gelAzure400AZI400-01
Tinte de carga en gelThermo Fisher ScientificB72
Gelatina (2%)Sigma AldrichG1393
GelRedBiotium#41003
Cebadores de genotipado: DNA oligo, 25 nmolIDTN/A
Gibco Bacto PeptoneFisher ScientificDF0118-17-0
Gibco Bacto TriptonaFisher ScientificDF0123-17-3También se usa en placas de piruvato LB oscuro y piruvato LB;
Extracto de levadura Gibco BactoFisher ScientificDF0127-17-9También se usa en placas de piruvato LB oscuro y piruvato LB;
Set de cabezas de empuñadura, soporte aguja tamaño 1CalibreEPE-5196083008(emparejado con aguja de borosilicato 1B120F-4)
Aceite de halocarbono 700Sigma AldrichH8898
Palilla de husillo de alambre platino duro para el mantenimiento diarioInvestigación TritechPT-9901
Inferencia de ediciones CRISPR (ICE)SynthegoN/ASoftware utilizado para analizar secuencias de Sanger e identificar indels
KClSigma AldrichP9541
Extractor láser P-2000SutterP-2000G
Cloruro de magnesio (MgCl2)Sigma AldrichM8266
Sulfato de magnesio (MgSO4)Sigma AldrichM7506Para el buffer M9, también se usa en NGM
Punta de microcargador 2x96STCalibre930001007
Adaptador de montaje para micromanipulador para Zeiss Axio Observer y Axiovert 200Investigación TritechNZ-19-2
MicroscopioTritechSMT1
NicotinaSigma AldrichN3876
NP-40Thermo Fisher Scientific85124
Buffer dúplex libre de nucleasasIDT11-01-03-01
OneTaq MasterMixNEBM0486
Caja de almacenamiento de pipetasInstrumentos SutterBX10
Cloruro de potasio (KCl)Sigma Aldrich793590
Fosfato de potasio, dibásico (K2HPO4)Sigma AldrichP3786KOH por NGM
Fosfato de potasio, monobásico (KH2PO4)Sigma AldrichP5655Para el buffer M9, también se usa en NGM
Proteinasa KSigma AldrichP6556
Agujas de cuarzoInstrumentos SutterQF100-70-10
S. hermaphroditium genomaNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_030435675.1/
crRNAs sh-unc-22 Alt-R CRISPR-Cas9IDTN/A
Cloruro de sodio (NaCl)VWRSS0430También se usa en placas de piruvato M9, Dark LB, LB
Fosfato de sodio, dibásico (Na2HPO4.7H20)Sigma AldrichS9390Para el buffer M9
Piruvato de sodioSigma AldrichP2256También se usa en placas de piruvato LB y en la sección de Pescadores;
Palilla de hilo de platino blando para microinyecciónQuemetales Surepure6824Platino 90%, Alambre de aleación de iridio 10%, 0,002 pulgadas de diámetro x 5 pies de largo
Portaagujas estándarInvestigación TritechHI-7
Steinernema hermaphroditum
Microscopio estereoscópicoLeicaInveta 3
TrehalosaCole-ParmerEW-88195-990,08 M
Tris Fisher ScientificAM9855GpH 8,0
Preadolescentes 20Sigma AldrichP1379
Adaptador de montaje de micromanipulador verticalInvestigación TritechNR2
Xenorhabdus griffiniae (HGB2511)

Referencias

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