Este protocolo evalúa el papel protector de la sobreexpresión de klotho en los cardiomiocitos H9C2 bajo hipoxia-reoxigenación mediante ensayos moleculares y funcionales.
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Artículo de investigación
Este protocolo evalúa el papel protector de la sobreexpresión de klotho en los cardiomiocitos H9C2 bajo hipoxia-reoxigenación mediante ensayos moleculares y funcionales.
Este estudio tenía como objetivo investigar el papel protector del klotho en los cardiomiocitos sometidos a lesiones por hipoxia/reoxigenación (H/R). Se estableció un modelo H/R in vitro utilizando cardiomioblastos de rata H9C2, que fueron transfectados con vectores lentivirales que sobreexpresan klotho. Las células se dividieron en seis grupos experimentales: control, H/R, control negativo (NC), sobreexpresión de klotho, PDTC (un inhibidor de NF-κB) y un grupo combinado tratado con klotho y lipopolisacáridos (LPS). Los niveles de expresión de klotho se determinaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real y western bloting. La viabilidad celular se midió mediante el ensayo MTT, mientras que la apoptosis se evaluó mediante citometría de flujo. La expresión de proteínas implicadas en la vía de señalización NF-κB fue analizada mediante western bloting, y la expresión celular de citocinas proinflamatorias se evaluó mediante tinción por inmunofluorescencia. La sobreexpresión de klotho elevó significativamente los niveles de klotho en las células H9C2 y condujo a una mejora de la viabilidad celular, una reducción de la apoptosis y una disminución de la expresión celular de citocinas proinflamatorias en comparación con el grupo H/R. El análisis de Western blot reveló que la sobreexpresión de klotho, así como el tratamiento con PDTC, suprimieron la activación de la vía NF-κB, como indica una reducción de la relación p-P65/P65 y el aumento de los niveles de p-IκBα/IκBα. Estos efectos se revirtieron parcialmente tras el cotratamiento con LPS. Estos resultados sugieren que el klotho confiere cardioprotección frente a lesiones inducidas por H/R al modular la señalización de NF-κB, reducir la inflamación y promover la supervivencia celular. Este protocolo proporciona un método reproducible para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes a la lesión por isquemia-reperfusión miocárdica y el potencial terapéutico del klotho en la inflamación cardíaca.
El infarto agudo de miocardio (IAM) es causado principalmente por isquemia seguida de reperfusión, lo que ha motivado una investigación extensa sobre los mecanismos de la lesión de hipoxia/reoxigenación (H/R) miocárdica 1,2,3. Un aspecto fundamental de la lesión H/R miocárdica es la apoptosis celular, que contribuye significativamente a la progresión patológica de laAMI 4,5.
Estudios recientes han implicado la vía de señalización del factor nuclear kappa B ....
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Todos los procedimientos que involucraron la línea celular de cardiomioblastos de rata H9C2 (ATCC, CRL-1446) se realizaron en cumplimiento con las normativas institucionales de bioseguridad. Ningún animal o humano participó directamente en este estudio. La Figura 1 ilustra el flujo de trabajo gráfico del diseño experimental y la cadena de análisis. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Cultivo celular
La línea celular cardiomioblasta de rata H9C2 (ATCC, CRL-1446) fue criopreservada en nitrógeno l....
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La sobreexpresión del klotho mejora la supervivencia celular y atenua la lesión inflamatoria mediada por NF-κB
Para confirmar la eficiencia de la administración génica, se cuantificó la expresión de Klotho tanto a nivel de ARNm como de proteína. Las células con sobreexpresión de klotho mostraron un aumento robusto en comparación con los grupos control de hipoxia/reoxigenación (H/R) y negativos.......
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En este estudio se investigó el papel protector de Klotho en los cardiomiocitos expuestos a lesión por hipoxia/reoxigenación (H/R), y se encontró que la sobreexpresión de Klotho mejora significativamente la viabilidad celular, reduce la apoptosis y suprime la expresión de citoquinas proinflamatorias. Estos efectos se acompañaron de una reducción de la fosforilación de p65 y una fosforilación aumentada de IκBα, lo que sugiere que la inhibición de la señalización de NF-κB contribuye al fen.......
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Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 4% de paraformaldehído | Biosharp | XG1050 | |
| Solución de tinción Annexin V APC/PI | Elabscience | E-CK-A217 | |
| Kit de Síntesis de ADNcDNA | Qiagen | 205410 | |
| Solución DAPI | BioFroxx | 1155MG010 | |
| Dulbecco' s Eagle Medio Modificado (DMEM) | HyClone | SH30243.01B | |
| Kit de reactivos de detección ECL | Meilunbio | MA0186-1 | |
| Fuente de alimentación por electroforesis (POWER PAC 200) | Bio-Rad | POWER PAC 200 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | VivaCell | C04001-500, C04002-500 | |
| Citómetro de flujo (Gallios) | Beckman Coulter | Gallios | |
| Microscopio de fluorescencia (BK6000) | Chongqing Optec | BK6000 | |
| Disolvente formazan | Solarbio | M1020 | |
| Anticuerpo anti-IgG de Cabra conjugado con HRP | Bethyl | A120-101P | |
| LPS (NF-κ Agonista de la vía B) | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| Lector de microplacas (Modelo K3) | Termodinámica | K3 | |
| Cámara Incubadora Modular (Cámara de Hipóxia) | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
| Solución MTT | Caimán | 21795 | |
| PDTC (NF-& kappa; Inhibidor de la vía B) | Sigma-Aldrich | P8765 | |
| Anticuerpo IgG Anticonejo Conjugado con PE | Bioss | bs-0295G-PE | |
| Polibrena (bromuro de hexadimetrina) | Invitrogen | X2351 | |
| Membrana PVDF | Merck | ISEQ00010 | |
| Conejo Anti-Rata IL-1 y beta; Anticuerpo | Biorbyt | orb378927 | |
| Anticuerpo anti-rata del conejo | ZEN BIO | 384702 | |
| Conejo Anti-Rata Iκ Bα Anticuerpo | Biorbyt | orb223182 | |
| Anticuerpo anti-Klotho de Conejo | Biorbyt | orb333711 | |
| Anticuerpo anti-rata Rabbit p65 | Biorbyt | orb229138 | |
| Conejo Anti-Rata Phospho-Iκ Bα Anticuerpo | Biorbyt | orb223035 | |
| Phospho-NF-& kappa anti-ratas de conejo; Anticuerpo B p65 | Biorbyt | orb304662 | |
| Conejo Anti-Rata TNF-& alfa; Anticuerpo | Biorbyt | orb106548 | |
| Anticuerpo anti-rata & beta-actina del conejo | Huabio | ET1702 | |
| Sistema de PCR Cuantitativa en Tiempo Real (LightCycler 96) | Roche | Light Cycler96 | |
| Búfer de Lisis RIPA | Mreda | MO52447 | |
| Kit de preparación de gel SDS-PAGE | Elabscience | E-IR-R305 | |
| Kit de reactivos TRIzol | Tecnologías de la vida | 15596-018 |
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