Este protocolo evalúa el papel protector de la sobreexpresión de klotho en los cardiomiocitos H9C2 bajo hipoxia-reoxigenación mediante ensayos moleculares y funcionales.
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Artículo de investigación
Este protocolo evalúa el papel protector de la sobreexpresión de klotho en los cardiomiocitos H9C2 bajo hipoxia-reoxigenación mediante ensayos moleculares y funcionales.
Este estudio tenía como objetivo investigar el papel protector del klotho en los cardiomiocitos sometidos a lesiones por hipoxia/reoxigenación (H/R). Se estableció un modelo H/R in vitro utilizando cardiomioblastos de rata H9C2, que fueron transfectados con vectores lentivirales que sobreexpresan klotho. Las células se dividieron en seis grupos experimentales: control, H/R, control negativo (NC), sobreexpresión de klotho, PDTC (un inhibidor de NF-κB) y un grupo combinado tratado con klotho y lipopolisacáridos (LPS). Los niveles de expresión de klotho se determinaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real y western bloting. La viabilidad celular se midió mediante el ensayo MTT, mientras que la apoptosis se evaluó mediante citometría de flujo. La expresión de proteínas implicadas en la vía de señalización NF-κB fue analizada mediante western bloting, y la expresión celular de citocinas proinflamatorias se evaluó mediante tinción por inmunofluorescencia. La sobreexpresión de klotho elevó significativamente los niveles de klotho en las células H9C2 y condujo a una mejora de la viabilidad celular, una reducción de la apoptosis y una disminución de la expresión celular de citocinas proinflamatorias en comparación con el grupo H/R. El análisis de Western blot reveló que la sobreexpresión de klotho, así como el tratamiento con PDTC, suprimieron la activación de la vía NF-κB, como indica una reducción de la relación p-P65/P65 y el aumento de los niveles de p-IκBα/IκBα. Estos efectos se revirtieron parcialmente tras el cotratamiento con LPS. Estos resultados sugieren que el klotho confiere cardioprotección frente a lesiones inducidas por H/R al modular la señalización de NF-κB, reducir la inflamación y promover la supervivencia celular. Este protocolo proporciona un método reproducible para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes a la lesión por isquemia-reperfusión miocárdica y el potencial terapéutico del klotho en la inflamación cardíaca.
El infarto agudo de miocardio (IAM) es causado principalmente por isquemia seguida de reperfusión, lo que ha motivado una investigación extensa sobre los mecanismos de la lesión de hipoxia/reoxigenación (H/R) miocárdica 1,2,3. Un aspecto fundamental de la lesión H/R miocárdica es la apoptosis celular, que contribuye significativamente a la progresión patológica de laAMI 4,5.
Estudios recientes han implicado la vía de señalización del factor nuclear kappa B (NF-κB) en la lesión H/R miocárdica mediante su modulación de las respuestas inflamatorias a estímulos como el lipopolisacárido (LPS)6,7,8. La activación de NF-κB ocurre mediante dos mecanismos distintos: las vías canónica y nocanónica 9. En la vía canónica, la activación depende de la degradación inducida por fosforilación del inhibidor de kappa B alfa (IκBα)10. Sin embargo, también se ha informado que la fosforilación de la subunidad NF-κB p65 puede provocar la apoptosis, potencialmente de forma independiente de la degradación de IκBα11. Klotho, una proteína transmembrana de paso único, regula el metabolismo del fosfato y el calcio e inhibe la señalización de insulina 12,13,14. La evidencia emergente indica que Klotho ejerce efectos inhibidores sobre la activación de NF-κB en diversos tejidos, incluyendo el riñón, el hipocampo y las células envejecidas, mitigando así la inflamación y el dañotisular 15,16,17. A pesar de estos avances, el papel del klotho en la AMI y su posible interacción con la vía NF-κB durante la lesión miocárdica H/R siguen siendo en gran medida inexplorados.
Desde una perspectiva metodológica, el modelo in vitro H/R que utiliza cardiomioblastos de rata H9C2 ofrece varias ventajas sobre los modelos animales, incluyendo tensión controlada de oxígeno, reproducibilidad y reducción de la variabilidad. Además, la sobreexpresión de Klotho mediada por lentivirales permite una modulación estable y eficiente de la expresión génica, facilitando la investigación directa de su impacto funcional. Estos enfoques hacen que el protocolo sea práctico, rentable y accesible para estudios mecanicistas, evitando al mismo tiempo los desafíos éticos y logísticos de la experimentación in vivo .
En términos prácticos, las células H9C2 se utilizan ampliamente en la investigación cardiovascular, ya que conservan muchas propiedades similares a las de los cardiomiocitos, aunque no imitan completamente el fenotipo de los cardiomiocitos maduros. La condición seleccionada H/R (hipoxia de 5 h seguida de reoxigenación de 1 h) se encuentra dentro de un rango comúnmente empleado para modelar lesiones de isquemia-reperfusión in vitro. De manera similar, la transducción lentiviral con multiplicidades de infección (MOI) alrededor de 100 es un enfoque estándar para lograr una sobreexpresión eficiente con citotoxicidad manejable. Aunque estas características aumentan la aplicabilidad del protocolo, deben reconocerse limitaciones como la recapitulación incompleta del entorno in vivo . Por ello, el presente estudio pretende explorar cómo Klotho protege las células miocárdicas de lesiones H/R y establecer un protocolo reproducible para evaluar su interacción con la señalización de NF-κB.
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Todos los procedimientos que involucraron la línea celular de cardiomioblastos de rata H9C2 (ATCC, CRL-1446) se realizaron en cumplimiento con las normativas institucionales de bioseguridad. Ningún animal o humano participó directamente en este estudio. La Figura 1 ilustra el flujo de trabajo gráfico del diseño experimental y la cadena de análisis. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Cultivo celular
La línea celular cardiomioblasta de rata H9C2 (ATCC, CRL-1446) fue criopreservada en nitrógeno líquido utilizando un medio congelante compuesto por el Medio Águila Modificado (DMEM, glucosa alta, 4,5 g/L) suplementado con suero fetal bovino al 10% (FBS) y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Para la recuperación, los viales congelados se descongelaban rápidamente en un baño maria a 37 °C durante 2-3 minutos y se transferían inmediatamente a DMEM precalentado. El medio de cultivo se preparó con 10% FBS, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 3,7 g/L de bicarbonato sódico y 1 mM de piruvato sódico. Las células se mantuvieron a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5% de CO₂. Se utilizaron células H9C2 entre los pasajes 6 y 20 para todos los experimentos. Los primeros pasajes (P20) no se utilizaron para evitar la deriva fenotípica relacionada con el pasaje.
2. Sobreexpresión lentiviral de Klotho en células H9C2
Se aplicó un vector lentiviral autoinactivante de tercera generación que codificaba el gen Klotho (Kl) de rata de longitud completa bajo el control del promotor EF1α para establecer una sobreexpresión estable en células H9C2. El constructo contenía un reportero P2A-EGFP para visualización, elementos reguladores posttranscripcionales del virus de la hepatitis, una marmota (WPRE) y elementos del tracto polipurino central (cPPT) para la estabilidad del transcrito, y un casete de resistencia a la puromicina impulsado por el promotor PGK para la selección. Las partículas lentivales se produjeron en células HEK293T mediante la co-transfección del plásmido de transferencia con plásmidos psPAX2 (gag/pol/rev) y pMD2.G (VSV-G) en una proporción de 4:3:1 utilizando polietileneimína (PEI; ADN: PEI = 1:3, p/p). Los supernadantes se cosecharon a 48 h y 72 h, se clarificaron por centrifugación a 3.000 × g durante 10 minutos, se filtraron a través de una membrana PES de 0,45 μm y se concentraron por ultracentrifugación a 25.000 × g durante 2 h a 4 °C. Los pellets virales se resuspendieron en PBS que contenía albúmina sérica bovina al 1% (BSA), y los títulos funcionales (TU/mL) se determinaron mediante la infección por dilución limitante de HEK293T células con lectura de EGFP a las 72 horas. Las células H9C2 se sembraron en placas de 6 pozos a 2 × 105 células por pozo, resultando en aproximadamente un 60% de confluencia en el momento de la transducción. Se añadieron partículas lentivirales a una multiplicidad de infección (MOI) de 100 en 1 mL de medio fresco de cultivo suplementado con polibreno (8 μg/mL) para mejorar la eficiencia de la infección. El inóculo se extrajo tras 12 horas y se reemplazó por 2 mL de medio completo. A las 72 horas tras la infección, la eficiencia de la transducción fue verificada por fluorescencia de EGFP bajo un microscopio de fluorescencia. Para el establecimiento de líneas celulares estables, se aplicó puromicina (2 μg/mL, pre-titulada) durante 3-5 días a partir de 48 horas después de la infección, con cambios de medio cada 48 horas. La sobreexpresión de Klotho fue confirmada mediante RT-qPCR e inmunobloting. Todos los procedimientos lentivirales se realizaron bajo contención de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2), y todos los residuos virales se inactivaron con lejía al 10% durante al menos 30 minutos antes de su eliminación.
3. Grupos experimentales
Las células H9C2 se sembraron en placas de 6 pozos (área de crecimiento 9,6 cm²) a 3 × 10⁵ células por pozo, lo que produjo aproximadamente una confluencia del 70%-80% tras 24 horas, la densidad requerida para el procesamiento de hipoxia/reoxigenación (H/R) y los ensayos posteriores. Tras la inserción nocturna, las células se asignaron en seis grupos experimentales: (1) grupo de control, que no recibió tratamiento adicional; (2) grupo H/R, que sufrió hipoxia/reoxigenación (H/R) en una cámara modular de hipoxia sellada, seguida de exposición a 5 horas de hipoxia (1% O₂, 94% N₂, 5% CO₂) y 1 hora de reperfusión (5% CO₂), como se describióanteriormente 18; (3) Grupo Control Negativo (NC), en el que las células fueron transfectadas con un vector vacío 24 horas antes del tratamiento H/R; (4) Grupo Klotho, en el que las células fueron transfectadas con vectores lentivirales que codifican Klotho 24 horas antes del tratamiento H/R; (5) Grupo de tratamiento con pirrolidina ditiocarbamato (PDTC), que se trató con 200 mg/L inhibidor de la vía NF-κB PDTC durante 24 horas antes del tratamiento H/R 19; (6) Grupo Klotho + LPS, en el que las células fueron transfectadas con vectores lentivirales que codifican Klotho y posteriormente tratadas con lipopolisacáridos a 1 mg/L durante 24 horas antes del tratamiento H/R 20.
4. qRT-PCR
Las células H9C2 se sembraron en placas de 6 pozos con una densidad de 1 × 10⁶ celdas por pozo. Tras el tratamiento, el ARN total se aisló mediante un protocolo de extracción de fenol-cloroformo. En resumen, se añadió 1 mL de reactivo por pozo, seguido de extracción de cloroformo, precipitación de isopropanol y lavado con etanol al 75%. El pellet de ARN se secó al aire y se disolvió en agua libre de RNasa. La concentración y pureza del ARN se determinaron espectrofotométricamente. Para la síntesis de ADNc, 1 μg de ARN total fue transcrito inversamente utilizando un kit comercial de transcripción inversa según el protocolo del fabricante, incluyendo la extracción de ADN genómico y el cebado aleatorio de hexámeros. La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó en un sistema de PCR en tiempo real con química SYBR Green bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95 °C durante 30 s, seguida de 40 ciclos de 95 °C durante 5 s y 60 °C durante 30 s. Las secuencias de cebadores fueron diseñadas usando Primer-BLAST (NCBI) y sintetizadas por un proveedor comercial: (1) Klotho: F 5′-TAAGGTTCAAGTATGGAGAC-3′, R 5′-GGGCGTTCACACTTATTATTÄT-3′; (2) β-actina (control interno): F 5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′, R 5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′. Los niveles relativos de expresión se calcularon utilizando el método 2^-ΔΔCT, y la especificidad de amplificación se confirmó mediante un único pico de curva de fusión.
5. Western blot
Las proteínas se extrajeron de las células H9C2 mediante un tampón de radioinmunoprecipitación (RIPA) (200 μL por pozo de una placa de 6 pozos) suplementado con un cóctel inhibidor de proteasas sobre hielo. Las concentraciones de proteínas se midieron mediante ensayo de ácido bicincónico (BCA), y se cargaron cantidades iguales de proteína (20-30 μg) por carril sobre un gel SDS-PAGE al 10% para la separación electroforética. Las proteínas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) utilizando un sistema de transferencia húmeda a 100 V durante 90 minutos a 4 °C. Las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5% preparada en TBST durante 1 hora a temperatura ambiente, y luego incubadas durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra Klotho (1:500), fosfo-p65 (1:500), p65 (1:500), fosfo-IκBα (1:500), IκBα (1:500) y β-actina (1:1000). Tras tres lavados con TBST, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) (1:1000) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas proteicas se visualizaron mediante un sistema mejorado de detección de quimiluminiscencia, y las intensidades de señal se cuantificaron con el software ImageJ usando ajustes de umbral idénticos.
6. Ensayo MTT
Las células H9C2 se sembraron en placas de 96 pozos con una densidad de 2 × 10³ por pozo en 100 μL de medio completo y se incubaron durante la noche para permitir la adherencia. Se añadió un volumen de 10 μL de solución de MTT (5 mg/mL en PBS) a cada pozo y se incubó durante 4 horas a 37 °C en condiciones humidificadas con un 5% de CO₂. Tras la incubación, se extrajo cuidadosamente el sobrenadante y se añadieron 100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) para disolver los cristales de formazan, seguido de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente con suaves agitaciones. La absorbancia se medía entonces a 490 nm usando un lector de microplacas. El resultado visual esperado fue la aparición de cristales de formazan púrpura en células viables antes de la adición de DMSO, y una solución púrpura homogénea tras la disolución.
7. Citometría de flujo
Las células se extrajeron 24 horas después del tratamiento mediante tripsinización y se recogieron por centrifugación a 1.500 × g durante 5 minutos a 4 °C. El pellet celular fue resuspendido en 100 μL de tampón de unión 1× (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl₂, pH 7,4). Se mezclaron V-APC de anexina y yoduro de propidio (PI) en una proporción 1:2 para preparar una solución de tinción de 15 μL, que se añadió a la suspensión celular. La mezcla se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Tras la incubación, se añadieron 400 μL del mismo tampón de unión y las muestras se analizaron inmediatamente usando un citómetro de flujo. Se recogieron un total de 10.000 eventos por muestra. Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo. Las celdas se configuraron primero en función de la dispersión directa (FSC) y la dispersión lateral (SSC) para excluir los residuos, seguidas por la filtración en cuadrantes de Annexin V vs. PI para distinguir las células viables (Annexin V-/PI-), las celdas apoptóticas tempranas (Annexin V+/PI-) y las celdas apoptóticas/necróticas tardías (Annexin V+/PI+). La tinción V-positiva/PI-negativa de Annexin indicó apoptosis temprana, mientras que la tinción doble positiva de Annexin V/PI indicó apoptosis o necrosis tardía.
8. Inmunofluorescencia
Las células H9C2 se sembraron en cubiertas de vidrio estériles en placas de 6 pozos con una densidad de 1 × 10⁵ células por pozo y se sometieron a tratamientos. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente, permeabilizaron con 0,1% de Triton X-100 en PBS durante 10 minutos, y se bloquearon con albúmina sérica bovina al 5% (BSA) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los coverslips se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra TNF-α (1:200), IL-1β (1:200) e IL-6 (1:100). Tras tres lavados en PBS, las células fueron incubadas con anticuerpos secundarios marcados con ficoeritrina (PE) (1:500) durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Los núcleos fueron contrateñidos con DAPI durante 5 minutos. Las cubiertas se montaban en portaobjetos de vidrio con medio de montaje antidesvanecimiento, y las señales de fluorescencia se visualizaban usando un microscopio de fluorescencia. Las imágenes se analizaron con ImageJ (versión 1.54). La fluorescencia roja indicaba expresión de citocinas, mientras que la fluorescencia azul marcaba núcleos.
9. Análisis estadístico
Todos los datos se analizaron utilizando el software SPSS. Los resultados se expresan como media ± desviación estándar (DS) de al menos tres experimentos independientes. Para comparaciones de múltiples grupos, se aplicó un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de la prueba post hoc de Tukey. Se consideró estadísticamente significativo un valor P < 0,05.
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La sobreexpresión del klotho mejora la supervivencia celular y atenua la lesión inflamatoria mediada por NF-κB
Para confirmar la eficiencia de la administración génica, se cuantificó la expresión de Klotho tanto a nivel de ARNm como de proteína. Las células con sobreexpresión de klotho mostraron un aumento robusto en comparación con los grupos control de hipoxia/reoxigenación (H/R) y negativos...
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En este estudio se investigó el papel protector de Klotho en los cardiomiocitos expuestos a lesión por hipoxia/reoxigenación (H/R), y se encontró que la sobreexpresión de Klotho mejora significativamente la viabilidad celular, reduce la apoptosis y suprime la expresión de citoquinas proinflamatorias. Estos efectos se acompañaron de una reducción de la fosforilación de p65 y una fosforilación aumentada de IκBα, lo que sugiere que la inhibición de la señalización de NF-κB contribuye al fen...
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Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 4% de paraformaldehído | Biosharp | XG1050 | |
| Solución de tinción Annexin V APC/PI | Elabscience | E-CK-A217 | |
| Kit de Síntesis de ADNcDNA | Qiagen | 205410 | |
| Solución DAPI | BioFroxx | 1155MG010 | |
| Dulbecco' s Eagle Medio Modificado (DMEM) | HyClone | SH30243.01B | |
| Kit de reactivos de detección ECL | Meilunbio | MA0186-1 | |
| Fuente de alimentación por electroforesis (POWER PAC 200) | Bio-Rad | POWER PAC 200 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | VivaCell | C04001-500, C04002-500 | |
| Citómetro de flujo (Gallios) | Beckman Coulter | Gallios | |
| Microscopio de fluorescencia (BK6000) | Chongqing Optec | BK6000 | |
| Disolvente formazan | Solarbio | M1020 | |
| Anticuerpo anti-IgG de Cabra conjugado con HRP | Bethyl | A120-101P | |
| LPS (NF-κ Agonista de la vía B) | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| Lector de microplacas (Modelo K3) | Termodinámica | K3 | |
| Cámara Incubadora Modular (Cámara de Hipóxia) | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
| Solución MTT | Caimán | 21795 | |
| PDTC (NF-& kappa; Inhibidor de la vía B) | Sigma-Aldrich | P8765 | |
| Anticuerpo IgG Anticonejo Conjugado con PE | Bioss | bs-0295G-PE | |
| Polibrena (bromuro de hexadimetrina) | Invitrogen | X2351 | |
| Membrana PVDF | Merck | ISEQ00010 | |
| Conejo Anti-Rata IL-1 y beta; Anticuerpo | Biorbyt | orb378927 | |
| Anticuerpo anti-rata del conejo | ZEN BIO | 384702 | |
| Conejo Anti-Rata Iκ Bα Anticuerpo | Biorbyt | orb223182 | |
| Anticuerpo anti-Klotho de Conejo | Biorbyt | orb333711 | |
| Anticuerpo anti-rata Rabbit p65 | Biorbyt | orb229138 | |
| Conejo Anti-Rata Phospho-Iκ Bα Anticuerpo | Biorbyt | orb223035 | |
| Phospho-NF-& kappa anti-ratas de conejo; Anticuerpo B p65 | Biorbyt | orb304662 | |
| Conejo Anti-Rata TNF-& alfa; Anticuerpo | Biorbyt | orb106548 | |
| Anticuerpo anti-rata & beta-actina del conejo | Huabio | ET1702 | |
| Sistema de PCR Cuantitativa en Tiempo Real (LightCycler 96) | Roche | Light Cycler96 | |
| Búfer de Lisis RIPA | Mreda | MO52447 | |
| Kit de preparación de gel SDS-PAGE | Elabscience | E-IR-R305 | |
| Kit de reactivos TRIzol | Tecnologías de la vida | 15596-018 |
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