Ensayo de salida de fosfolípidos específicos de lipoproteínas de alta densidad

Resumen

En este documento, describimos los protocolos para medir la cantidad de fosfolípidos fluorescentes eliminados específicamente de las partículas donantes de lípidos por la lipoproteína de alta densidad (HDL) presente en el plasma o suero humano completo. Hemos demostrado que esta métrica de la funcionalidad de HDL predice la enfermedad cardiovascular incidente.

Resumen

Los niveles plasmáticos de colesterol de lipoproteínas de alta densidad (HDL) (HDL-C) son actualmente una métrica clave para la evaluación clínica del riesgo de enfermedad cardiovascular (ECV). La eliminación mediada por HDL de los lípidos de la placa de las células y los depósitos extracelulares en la pared arterial es una de las varias funciones antiaterogénicas del HDL que pueden explicar su asociación inversa con el riesgo de ECV. La eliminación in vitro del colesterol celular mediada por HDL ha demostrado recientemente ser un predictor aún mejor del riesgo de ECV que el HDL-C.

El HDL está compuesto por una población heterogénea de partículas, que realizan diferentes funciones. Las partículas de HDL involucradas en la eliminación de los lípidos de la placa aterosclerótica contienen apolipoproteínas intercambiables, principalmente apolipoproteína A-I, que se disocian de la partícula y luego eliminan los lípidos de la placa. El HDL naciente se forma por la solubilización y eliminación de fosfolípidos y colesterol de los dominios de la membrana plasmática celular generados por ABCA1 por apolipoproteínas intercambiables derivadas de HDL. Este proceso juega un papel fundamental tanto en la prevención como en la regresión de la placa aterosclerótica.

En este documento, describimos el protocolo para el ensayo de salida de fosfolípidos específicos de HDL libres de células (HDL-SPE), que hemos demostrado anteriormente que puede predecir el riesgo de ECV incidente. Este ensayo mide específicamente la eliminación mediada por apolipoproteína HDL de un fosfolípido fluorescente no intercambiable de una partícula donante de lípidos. Nuestros estudios clínicos de casos y controles han establecido que el ensayo HDL-SPE funciona tan bien y potencialmente incluso mejor que el ensayo de capacidad de salida de colesterol basado en células "estándar de oro", un ensayo laborioso y técnicamente complejo que a menudo utiliza colesterol radiactivo.

El objetivo de este protocolo es permitir que los investigadores básicos y clínicos evalúen la funcionalidad de HDL en la movilización de lípidos, utilizando un ensayo simple, estandarizado, libre de células y de alto rendimiento. Este ensayo puede ser utilizado por investigadores básicos para obtener información sobre los mecanismos subyacentes a la salida de lípidos mediada por HDL y para detectar nuevos agentes terapéuticos que mejoran la funcionalidad de HDL. HDL-SPE también puede servir como ensayo de diagnóstico de laboratorio clínico para la evaluación del riesgo de ECV.

Introducción

El ensayo de salida de fosfolípidos específicos de lipoproteínas de alta densidad (HDL-SPE) mide la funcionalidad de HDL y está destinado a su uso en laboratorios de investigación biomédica y diagnóstico clínico para (i) obtener más información sobre los mecanismos subyacentes a la eliminación de lípidos mediada por HDL de las lesiones ateroscleróticas, (ii) servir como una nueva plataforma para mejorar la evaluación clínica del riesgo de ECV y, (iii) desarrollar nuevas terapias para tratar enfermedades cardiovasculares.

El colesterol HDL (HDL-C) es un determinante importante del riesgo de ECV¹, pero su utilidad se ve comprometida en la medida en que los niveles elevados de HDL-C (>80 mg/dL) se asocian con un mayor riesgo de ECV 2,3,4,5. Los niveles elevados de HDL-C pueden representar la acumulación de HDL disfuncional que tiene una capacidad reducida para eliminar los lípidos de la placa arterial⁶.

El ensayo de capacidad de salida de colesterol celular (CIC) fue el primer ensayo in vitro desarrollado para medir la funcionalidad de HDL. En este ensayo, los macrófagos cultivados (ratón o humano), típicamente marcados con ³H- o colesterol Bodipy fluorescente, se incuban con plasma o suero agotado en apoB. El % de salida de colesterol se calcula en función de la cantidad de fluorescencia/radiactividad asociada a las células y al medio ^7,8,9. Se ha demostrado que el ensayo CEC es un mejor predictor de ECV incidente que HDL-C⁷. El ensayo CEC no es susceptible de conversión a un ensayo de diagnóstico clínico de rutina, principalmente debido a sus requisitos de cultivo celular y su larga duración (p. ej., días). Además, el ensayo de CIC está limitado por su variabilidad inherente (p. ej., diferentes tipos de células, técnicas de marcado y agotamiento de PEG de β-lipoproteínas, lo que altera la composición de HDL¹⁰).

Varios grupos de investigación han desarrollado ensayos de salida de colesterol HDL libre de células para su uso como herramientas para obtener nuevos conocimientos sobre la función de HDL y para su posible traducción en un ensayo de diagnóstico clínico para evaluar mejor el riesgo de ECV^11,12. Estos ensayos de salida generalmente implican múltiples pasos y utilizan una partícula donante de lípidos marcada con un colesterol fluorescente y, al igual que el ensayo CEC, requieren el agotamiento de β-lipoproteínas o, alternativamente, la captura de partículas que contienen apoA-I utilizando anticuerpos anti-apoA-I, para medir el flujo de salida de colesterol HDL en plasma. Aunque se ha validado que estos ensayos alternativos están asociados en diversos grados con el riesgo de ECV, hasta la fecha, solo uno¹³, que evalúa el tipo de cambio de apoA-I, ha demostrado predecir el riesgo de ECV incidente¹⁴. Curiosamente, se ha demostrado que la cinética del intercambio de apoA-I dentro y fuera del HDL plasmático se asocia de forma independiente con CEC¹⁵ y se reduce notablemente en pacientes con síndrome coronario agudo¹⁶. Además, se ha demostrado que varias apolipoproteínas intercambiables de HDL median tanto el colesterol como el fosfolípido de las células que expresan ABCA1 in vitro¹⁷.

Hemos desarrollado un enfoque alternativo para evaluar la funcionalidad de HDL¹⁸. El ensayo simple, rápido y confiable descrito aquí requiere solo dos componentes, a saber, muestras completas de plasma o suero humano (o animal) (fresco o congelado-descongelado) y una partícula donante recubierta de lípidos fluorescentes. El ensayo mide la capacidad de la apoA-I y otras apolipoproteínas intercambiables asociadas a HDL en plasma/suero completo para eliminar una fosfatidiletanolamina fluorescente (PE) no intercambiable marcada con el grupo de cabeza de una partícula donante recubierta de lípidos¹⁸ (Figura 1).

Las partículas donantes en este ensayo consisten en cristales de hidrato de silicato de calcio (CSH) recubiertos con colesterol, fosfolípidos fosfatidilcolina (PC) y un PE fluorescente. Las apolipoproteínas intercambiables asociadas a HDL, en su mayoría apoA-I, liberadas por las partículas de HDL se unen a las partículas donantes y luego se disocian de ellas junto con los lípidos de las partículas donantes, incluida la PE fluorescente. De esta manera, el HDL, pero no las otras lipoproteínas presentes en el plasma/suero completo, adquiere específicamente PE fluorescente de las partículas donantes^18,19. El plasma/suero entero se incuba con las partículas donantes de hidrato de silicato de calcio recubierto de lípidos fluorescentes (LC-CSH) y solución salina a 37 °C, agitando durante 1 h. Dado que LC-CSH tiene aproximadamente el doble de densidad que el agua, las partículas donantes se separan fácilmente del plasma mediante centrifugación a baja velocidad.

El % de salida de PE medido en estudios clínicos se normaliza típicamente dividiendo por el valor de la fluorescencia de PE adquirida por HDL en el sobrenadante de la mezcla de reacción de una muestra clínica por el valor obtenido por HDL en un plasma humano de control de referencia. La normalización a un plasma de referencia se realiza para corregir las variaciones en la preparación del reactivo. Para aplicaciones de investigación, el % de salida de PE se puede determinar calculando la fluorescencia de PE sobrenadante dividida por la fluorescencia total (fluorescencia PE sobrenadante + fluorescencia LC-CSH). Los valores de medición fluorescente sobrenadante se pegan en una plantilla en archivos de hoja de cálculo para calcular el % de salida de PE (Tabla complementaria 1 para mediciones por triplicado y Tabla complementaria 2 para mediciones duplicadas). Las instrucciones para realizar estos cálculos en la hoja de cálculo se proporcionan como archivos complementarios (Archivo complementario 1, Archivo complementario 2, Archivo complementario 3, Archivo complementario 4, Archivo complementario 5, Archivo complementario 6, Archivo complementario 7 y Archivo complementario 8), y se proporciona un cálculo de ejemplo como Tabla complementaria 3.

Figura 1: Ensayo HDL-SPE. El flujo de salida de fosfolípidos específicos de HDL se analiza en placas de 96 pocillos. Los cristales de solución salina de hidrato de silicato de calcio (gris) recubiertos con lípidos (LC-CSH), incluida la fosfatidiletanolamina marcada con lisaminerodamina no intercambiable (LRh-PE; capas de membrana roja), y hasta 30 muestras completas de plasma/suero (amarillas; por triplicado) se cargan en placas de 96 pocillos. Después de mezclar durante 1 h a 37 °C en un termomezclador, las placas se centrifugan brevemente para granular las partículas donantes de LC-CSH. Las alícuotas de los sobrenadantes, que contienen HDL específicamente marcado con LRh-PE, se transfieren a una placa negra que contiene detergente (para solubilizar Lh-Rh-PE) y solución salina. Luego, la fluorescencia de PE se mide con un fluorímetro. Solución salina (control negativo; NC), para la corrección de fondo y plasma humano sano combinado (control positivo; PC) para la normalización de placas, se cargan en lugar de plasma / suero de muestra en el último conjunto de pocillos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

La extracción de sangre se realiza siguiendo las normas de la Declaración de Helsinki de 1975 (https://www.wma.net/what-we-do/medical-ethics/declaration-of-helsinki/), revisada en 2013, y debe ajustarse a las directrices institucionales en materia de consentimiento informado.

1. Preparación de partículas lipídicas donantes marcadas con fosfolípidos fluorescentes

1. Formación de película lipídica
   PRECAUCIÓN: Prepare y dispense soluciones madre en una campana química. Use una bata de laboratorio, guantes y gafas protectoras. Deseche las soluciones de cloroformo en los desechos químicos orgánicos, las soluciones Triton X-100 (sin plasma) en los desechos químicos y las soluciones que contienen plasma en los desechos médicos / de riesgo biológico.
   1. Compre soluciones de aceites lipídicos en cloroformo de un proveedor o hágalas en el laboratorio:
      25 mg/ml: 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC):
      10 mg/mL: Colesterol
      1 mg/ml: 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(lisaminerodamina B sulfonil) [LRh-PE]
      NOTA: Utilice tubos de vidrio herméticos con tapa de rosca. Sellar la tapa con cinta de teflón.
      Almacenar a -20 ^oC.
   2. Determine la cantidad de LC-CSH que se necesitará y prepare la cantidad adecuada de tubos de vidrio.
      En una campana extractora química, agregue lo siguiente a cada tubo de vidrio de borosilicato de 10 mm y 150 mm: 472 μL de solución madre de DMPC (17,7 μmol, 11,8 mg), 339 μL de solución madre de colesterol (8,8 μmol, 3,39 mg) y 305 μL de LRh-PE (200 nmol, 0,305 mg). Vórtice brevemente para mezclar.
   3. En una campana extractora química, seque la mezcla de lípidos en un tubo de vidrio bajo un chorro suave de N₂ durante 1 h, para formar una película lipídica seca en el fondo del tubo.
      NOTA: El flujo de N₂ solo debe causar una ligera ondulación en la superficie del fluido.
   4. Para ensayos que requieren varias placas de 96 pocillos durante días o semanas, haga un lote grande de LC-CSH que se pueda alícuotas en tubos o se pueda usar para hacer placas LC-CSH listas para usar, que se almacenan a -20 °C o -80 °C. Consulte los pasos 2.2.1-2.2.2 a continuación.
2. Recubrimiento de hidrato de silicato de calcio con película lipídica fluorescente
   PRECAUCIÓN: Use una bata de laboratorio, guantes, una máscara facial y gafas protectoras mientras manipula hidrato de silicato de calcio.
   1. Inserte un cono de papel de pesaje en el tubo de vidrio que contiene los lípidos secos. Agregue 80 mg de polvo de hidrato de silicato de calcio (CSH) (reactivo de eliminación de lípidos) al tubo de vidrio usando el cono de papel de pesaje para dirigir el polvo a la base del tubo. Agregue inmediatamente 2 ml de solución salina normal al tubo de vidrio que contiene los lípidos secos y CSH. Cubra la parte superior del tubo con parafilm.
   2. Agite con la mano para desalojar la mayor parte del lípido del fondo del tubo de vidrio. Inserte el tubo de vidrio en un orificio hecho en una plataforma de espuma de poliestireno unida a la parte superior de un vórtice. Asegure el tubo a la plataforma de vórtice con cinta reforzada.
      NOTA: Preajuste la velocidad del vórtice para permitir que la mezcla suba aproximadamente hasta la mitad del tubo de vidrio.
   3. Vórtice durante 10 min. Después del vórtice, confirme que no quede lípido en la pared del tubo. Si es necesario, haga un vórtice manual según sea necesario hasta que no quede lípido. Transfiera el volumen total del tubo de vidrio a un tubo cónico de plástico de 15 ml, utilizando una pipeta de 1 ml. Lave las paredes del tubo de vidrio con 3 ml de solución salina adicional y transfiéralo al mismo tubo de plástico cónico de 15 ml.
3. Lavado LC-CSH
   1. Centrifugar el tubo de plástico de 15 ml que contiene el CSH RECUBIERTO DE LÍPIDOS (LC-CSH) durante 2 min a 935 × g a 4 °C para granular las partículas donantes. Retire con cuidado el sobrenadante mediante aspiración endouterina con una punta de pipeta larga y muy fina.
   2. Comience en la parte superior del sobrenadante y mientras desliza lentamente la punta de la pipeta a lo largo del costado del tubo, incline el tubo a medida que se retira el sobrenadante. Deje una pequeña cantidad (≈ 200 μL) de solución salina para evitar la aspiración accidental de la LC-CSH del sedimento. Agregue suficiente solución salina para llevar el volumen total a 5 ml.
   3. Repita los pasos 1.3.1-1.3.2 cuatro veces. Después del lavado final, agregue suficiente solución salina para llevar el volumen final a 2,5 ml.
      NOTA: Almacenar en las preparaciones LC-CSH a 4 °C durante 2 semanas o a -20 °C o -80 °C durante un máximo de 6 meses.
4. Preparación de lotes grandes para placas LC-CSH listas para usar
   NOTA: Este enfoque permite la preparación de placas de medición con una composición uniforme de reactivos del mismo lote de LC-CSH, minimizando así la variabilidad de la medición entre placas.
   1. Prepare 12 tubos LC-CSH (2,5 ml x 12 tubos) como se describe en los pasos 1.1.1-1.3.2 anteriores. Combine todo el contenido de los 12 tubos en un tubo de plástico cónico de 50 ml (volumen total de 30 ml). Agite cuidadosamente para obtener una distribución homogénea de las partículas LC-CSH y dispense 6 ml en un tubo cónico de plástico de 15 ml. Repita cuatro veces para obtener un total de 5 tubos cónicos de plástico, cada uno con 6 ml de LC-CSH.
   2. Cada tubo proporcionará suficiente LC-CSH para fabricar 5 placas LC-CSH listas para usar (que contienen 50 μL por pocillo para los 96 pocillos en una sola placa). Consulte los pasos 2.2.1-2.2.2 a continuación.

2. Incubación de muestras de plasma/suero con partículas lipídicas de donantes marcadas con fosfolípidos fluorescentes (LC-CSH)

1. Placas individuales para uso inmediato.
   1. Pipetear 75 μL de solución salina en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de 0,3 mL utilizando tantos pocillos como sea necesario para el conjunto de muestras que se va a analizar. Pipetee 100 μL de solución salina en pocillos de control negativo (NC) por triplicado y 75 μL de solución salina en pocillos de control positivo (PC) duplicados (Figura 2). Utilice una pipeta de pocillos múltiples para dispensar.
   2. Antes de dispensar LC-CSH, agite el tubo de plástico de 15 ml 3 veces, 10 s cada una. Con una pipeta de un solo pocillo, dispense 50 μl de LC-CSH a lo largo del lado derecho de los pocillos que contienen solución salina. Dispense rápidamente 50 μL cada uno a solo 3 pocillos. Repita el protocolo de vórtice antes de dispensar LC-CSH en los siguientes 3 pocillos.
      NOTA: Este procedimiento es fundamental para garantizar que el LC-CSH pesado, que sedimenta espontáneamente, esté suspendido homogéneamente, lo que permite dispensar cantidades iguales a cada pocillo.
   3. Gire la placa de 96 pocillos 180° para que el lado izquierdo de los pocillos quede ahora hacia la derecha. Pipetear 25 μL de muestras de plasma/suero a lo largo del lado derecho del pocillo (Figura 2). Para los pocillos de PC, agregue 25 μL de plasma/suero normolipidémico humano estándar de referencia. El volumen total por pocillo para el ensayo es de 150 μL.
      NOTA: Este procedimiento evita la contaminación cruzada de plasma/suero con LC-CSH, ya que se dispensan a lo largo de lados opuestos de los pocillos.
   4. Selle herméticamente la placa con una película adhesiva. Incube la placa sellada de 96 pocillos en la oscuridad durante 1 h a 37 °C a 1200 rpm en un termomezclador. Una vez completada la incubación, retire la placa del termomezclador y póngala en hielo. Centrifugar la placa durante 2 min a 4 °C (para detener la reacción de transferencia) a 935 g para granular las partículas donantes.
2. Placas LC-CSH listas para usar
   1. Para su uso, descongele las placas congeladas listas para usar (consulte los pasos 1.4.1-1.4.2 para la preparación de la placa) en el frío (4 ° C a 10 ° C) durante 2 h (o durante la noche si es necesario). Centrifugar durante 2 min a 4 °C a 935 × g para recoger todo el material (125 μL) junto. Retire con cuidado la película adhesiva para no salpicar el contenido de los pocillos.
   2. Dispense 25 μL de muestras de plasma/suero, solución salina, y plasma humano de referencia, por triplicado, a los pocillos apropiados (Figura 1) de la placa lista para usar, en hielo, y selle con una película adhesiva. Incube el pocillo sellado de 96 pocillos en la oscuridad durante 1 h a 37 °C a 1200 rpm en un termomezclador. Retire el plato de la termobatidora y póngalo en hielo. Centrifugar la placa durante 2 min a 4 °C (para detener la reacción de transferencia) a 935 × g (para granular las partículas donantes).

Figura 2: Dispensación de reactivos en pocillos sin contaminación cruzada. Dispense plasma/suero y LC-CSH en las paredes opuestas de los pocillos. La contaminación cruzada se minimiza si la placa se gira 180° después de dispensar por primera vez LC-CSH. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Medición del flujo de salida de fosfolípidos fluorescentes a HDL plasmático/sérico

1. Transferencia a una placa negra y medición de fluorescencia
   1. Retire con cuidado la película adhesiva para no alterar el gránulo LC-CSH.
      NOTA: Si se produce una interrupción de los gránulos, centrifugue nuevamente.
   2. Transfiera 50 μL de sobrenadante de la placa de reacción de 96 pocillos a los pocillos de una placa de fondo plano de poliestireno negro de 96 pocillos para mediciones de fluorescencia. Utilice una pipeta de varios pocillos.
      NOTA: No aspire ningún LC-CSH. Si esto sucediera, inyecte nuevamente en el pozo y centrifugue nuevamente.
   3. Llene un depósito con solución salina normal. Añadir 50 μl de solución salina a cada pocillo con una pipeta multipocillo.
   4. Prepare TX-100 al 1% agregando 90 ml de agua destilada a 10 ml de solución madre Triton X-100 al 10% en un matraz Erlenmeyer de plástico de 125 ml. Llene un depósito con Triton-X 100 al 1%.
   5. Agregue 100 μL de Triton X-100 al 1% a temperatura ambiente a cada pocillo y mezcle pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces con una pipeta de pocillos múltiples. Evite formar burbujas. Revienta las burbujas con aire de una pipeta de transferencia de 3 ml.
   6. Mida la fluorescencia de la lisaminerodamina con fluorímetro (excitación de 540 nm / emisión de 600 nm).
2. Cálculo del % de salida de PE
   1. Cálculo del eflujo de PE
      1. % de salida de PE = ([Sobrenadante total en plasma o suero FLU - Supernadante NC FLU]/Total FLU)) × 100
         FLU = unidades de fluorescencia; NC = control negativo. Dado que solo se utilizan 50 μL de los 150 μL de la mezcla de reacción sobrenadante para medir la fluorescencia por pocillo, es necesario corregir de la siguiente manera:
      2. Sobrenadante total FLU/pocillo = FLU medido de 50 μL (placa negra) × 3
      3. FLU total por mezcla de reacción de 150 μL/pocillo = FLU total emitida por 50 μL de LC-CSH.
         NOTA: La fluorescencia de LC-CSH se calcula como se describe a continuación (paso 4.2.5).
   2. Cálculo normalizado del %PE de salida
      1. Utilice el %EF normalizado para corregir la variación entre ensayos realizados en diferentes condiciones (es decir, experimento realizado en diferentes días, diferencias de lotes).
      2. Utilice esta fórmula para calcular el %PE normalizado:
         %Salida de PE normalizada = Sobrenadante de la muestra %Valor de salida de PE (FLU)/sobrenadante de control de referencia positivo %Valor de salida de salida de PE FLU.
      3. Utilice plasma humano combinado idéntico de donantes sanos con un perfil lipídico normal como control de referencia. No es necesario calcular el sobrenadante total FLU/pocillo ya que este valor es el mismo tanto para la muestra como para la referencia.
      4. Para muestras por triplicado, pegue los datos sin procesar obtenidos en el paso 3.1.6 en la hoja de cálculo (Tabla complementaria 1). Para muestras duplicadas, pegue los datos sin procesar obtenidos en el paso 3.1.6 en la hoja de cálculo (Tabla complementaria 2).

4. Curva estándar LC-CSH

NOTA: La curva estándar LC-CSH se utiliza para calcular la cantidad de señal fluorescente PE presente en la alícuota de LC-CSH por pocillo. Normalmente, se utilizan 50 μL de LC-CSH/pocillo. Este valor se puede utilizar para calcular el % de salida de PE a HDL en una muestra normalizada al FLU total (ver paso 3.2.1) presente en la mezcla de reacción.

%PE de salida = ((unidades de fluorescencia de la muestra sobrenadante [FLU] - FLU salina sobrenadante)/(LC-CSH FLU total)) x 100.

1. Dilución en serie de LC-CSH
   1. Preparar diluciones de 10 y 100 veces de LC-CSH (como se preparó en los pasos 1.1.1-1.3.3):
      Dilución 10 veces: 100 μL de LC-CSH + 900 μL de Triton X-100 al 1%
      Dilución 100 veces: 100 μL de LC-CSH 10 veces diluido + 900 μL de Triton X-100 al 1%
   2. Dispense muestras triplicadas de LC-CSH diluidas 10 y 100 veces en una placa de incubación de 96 pocillos para la curva estándar (consulte la Figura 3).
   3. Agregue un volumen suficiente de Triton X-100 al 1% a los pocillos que contienen LC-CSH para llegar a un volumen final de 200 μL (consulte la Tabla 1).
2. Solubilización de LC-CSH para la medición de fluorescencia
   1. Sellar la placa con film adhesivo e incubar durante 1 h a 24 °C agitando a 1200 rpm. Placa de centrífuga durante 2 min a 4 °C a 935 × g. Retire con cuidado la película adhesiva.
   2. Con una pipeta multipocillos, mezcle las muestras pipeteando hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces. Transfiera 100 μl de LC-CSH por pocillo a una placa de fondo plano de poliestireno negro de 96 pocillos para mediciones de fluorescencia, utilizando una pipeta de pocillos múltiples.
   3. Agregue 100 μL por pocillo de Triton-X al 1% a temperatura ambiente a cada pocillo, utilizando una pipeta de pocillos múltiples. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces.
   4. Mida la fluorescencia con un fluorímetro (excitación de 540 nm/emisión de 600 nm).
   5. Pegue los valores de fluorescencia medidos con el fluorímetro en la plantilla de análisis de regresión lineal en la Tabla complementaria 1 como se describe en el Archivo complementario 3. Las concentraciones finales de LC-CSH en la placa de medición de la curva estándar se muestran en la Tabla 2.

Figura 3: Placa para la curva estándar LC-CSH. El LC-CSH marcado con LRh-PE diluido en serie se dispensa en una placa de 96 pocillos, como se muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Concentración final	10 veces diluido	100 veces diluido	1% Triton X-100	Total
LC-CSH	LC-CSH	LC-CSH	Detergente	Volumen
(μL/pocillo)	(μL)	(μL)	(μL)	(μL)
10	100	0	100	200
5	50	0	150	200
2.5	25	0	175	200
1	0	100	100	200
0.5	0	50	150	200
0.25	0	25	175	200

Tabla 1: Volúmenes de reactivos agregados a los pocillos de la placa de incubación para la curva estándar LC-CSH.

Solubilizado	Salino	Total	Añadido	Medido
LC-CSH	Volumen	Volumen	LC-CSH	LC-CSH
(μL)	(μL)	(μL)	(μL/pocillo)	(μL/pocillo)
100	100	200	10	5
100	100	200	5	2.5
100	100	200	2.5	1
100	100	200	1	0.5
100	100	200	0.5	0.25
100	100	200	0.25	0.125

Tabla 2: Volúmenes de reactivos agregados a los pocillos de la placa de medición para la curva estándar LC-CSH.

Resultados

Métodos analíticos

Como se señaló anteriormente, los análisis de muestras de HDL-SPE se pueden modificar para diferentes aplicaciones, como se demuestra a continuación. Antes de realizar estudios con muestras de investigación, primero se realizan ensayos de validación, reproducibilidad y concentración plasmática de la curva estándar LC-CSH para dominar las técnicas requeridas. Primero, realice el análisis de la curva estándar de LC-CSH para ev...

Discusión

El HDL-C es un determinante clave utilizado para evaluar clínicamente el riesgo de enfermedad cardiovascular (ECV) y, por lo tanto, la necesidad de reducir los lípidos u otros posibles tratamientos de tipo preventivo¹. Se ha demostrado que la función del HDL en el flujo de colesterol celular in vitro es un predictor aún mejor de enfermedad cardiovascular incidente que el HDL-C⁷. Desafortunadamente, este ensayo celular no es suscept...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina	Avanti Research	850345	Solución de cloroformo 14:0 PC (DMPC)
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(lisamina rodamina B sulfonilo) (sal de amonio)	Avanti Research	810150-C	Solución de cloroformo LRh-PE
Película adhesiva	Biosistemas Aplicados	4306311	MicroAmp Transparente Adhesivo Película
Cinta de teflón de alta densidad Bay Corporation 1/2 pulgada x 520	Soluciones de Pruebas Médicas	86732
Tubos de vidrio borosilicato de 20 mm y agudos; 150 mm	Fisher Scientific	14-961-33
Centrifugadora	Termo Científica	Serie Sorvall X Pro
Cloroformo	Sigma-Aldrich	366927	adecuado para HPLC, ≥ 99.8%
Polvo de colesterol	Sigma-Aldrich	C8667	3β-hidroxi-5-colesteno, 5-colesteno-3β-ol
Papel de pesaje de vidriina	Cole-Palmer	UX-01338-02	Para manejar LC-CSH
Placa de incubación	USA Scientific & nbsp;	1402-9700	Placas TempPlate 96 Pozo Semifalda de 0,2 mL PCR Placas
Agente eliminador de lípidos (LRA)	Supelco	13358-U	LC-CSH
Placa de medición	Greiner bio-one	655076	Microplaca, PS, 96 pozos, F-BOTTOM (POZO DE CHIMENEA), NEGRO; FLUOTRAC, UNIÓN DE MEDICAMENTOS
Microsoft Excel	Microsoft 365 MSO	Versión 2507
Puntas de pipete MultiFlex	Fisher Scientific	50-550-206	Para aspiración de sobrenadante durante lavados LC-CSH
Lector de placas multietiqueta	Perkin Elmer	1420-050	Contador multietiqueta Victor3 Wallac1420
Solución salina normal	Biológico de calidad	114-055-101	Para múltiples usos y nbsp;
Parafilm	Cole-Palmer	HS23452	Para cubrir la parte superior de tubos de vidrio durante el vórtice
Frascos Erlenmeyer policabonados	Fisher Scientific	10-041-8	Para una solución Triton-X al 10%
Plasma humano acumulado (derivado de la sangre) Li Heparina)	Innovative Research Inc	IPLAWBLIH	Plasma de referencia, control positivo (PC) y nbsp;
Surfact-Amps x 100	Termo Científica	28314	10% Triton X-100, diluir 10 veces con agua destilada
Termomezclador	Eppendorf	5382000023	Termomezclador C con termobloque de 96 pozos
Bloque inteligente termomezclador	Eppendorf	5306000006	SmartBlock de 96 pozos
Pipetas de transferencia (3 mL, Falcon)	Fisher Scientific	13-711-9CM	Para eliminar burbujas de la parte superior del pozo
Mezclador de vórtice	Daigger	3030A	Soporte para el tubo de cristal en la parte superior