Análisis de datos de microscopía multidimensional utilizando Cell-ACDC

Summary

El análisis preciso de datos de microscopía multidimensional requiere flujos de trabajo complejos. Este artículo muestra cómo usar el software Cell-ACDC. Aprovecha los modelos impulsados por IA de última generación para la segmentación, el seguimiento, el análisis del pedigrí celular y la cuantificación de datos de microscopía. Fundamentalmente, complementa estos modelos con un marco innovador para la corrección semiautomática de la salida de los modelos.

Abstract

Los avances recientes en microscopía cuantitativa para las ciencias de la vida han permitido a los biólogos experimentales sondear células con una resolución y velocidad sin precedentes. Al mismo tiempo, la revolución de la IA ha aumentado drásticamente la cantidad de información que se puede extraer de los datos de microscopía multidimensional. Sin embargo, la gran cantidad de datos generados y la complejidad de los modelos de IA de última generación suponen un grave cuello de botella en la fase de análisis de imágenes. Cell-ACDC es un software de código abierto y fácil de usar que proporciona una potente solución integral para la segmentación, el seguimiento y el análisis cuantitativo de células individuales en datos de microscopía multidimensional. Está diseñado para biólogos experimentales que pueden carecer de la experiencia técnica avanzada necesaria para implementar dichos modelos. Este artículo muestra cómo utilizar el marco para aprovechar fácilmente los modelos más recientes, junto con muchas herramientas para la corrección de datos inteligente y semiautomatizada, para maximizar la cantidad de información biológica que se puede obtener. Cell-ACDC admite datos de microscopía multicanal, de lapso de tiempo y de pila z, y proporciona un conjunto de herramientas dedicado adaptado a cada tipo de dimensionalidad de datos. Debido a su diseño modular, que permite que los biólogos integren sin problemas los nuevos modelos y accedan directamente a ellos, Cell-ACDC tiene el potencial de servir como una herramienta de referencia para el análisis de datos de microscopía.

Introduction

La microscopía se ha vuelto fundamental para acelerar el descubrimiento biológico en todas las etapas de la investigación y el desarrollo, desde la ciencia básica ^1,2,3 hasta el descubrimiento y las pruebas de fármacos ^4,5 y en una notable gama de tamaños, desde cultivos celulares hasta tejidos ^6,7, organoides ^8,9 y organismos completos¹⁰. Estas técnicas avanzadas de microscopía, sin embargo, tienen dos inconvenientes principales. En primer lugar, los datos de microscopía son intrínsecamente grandes¹¹, especialmente cuando se adquieren múltiples dimensiones (por ejemplo, tiempo y volúmenes). En segundo lugar, la extracción precisa de la rica información biológica en los datos requiere el despliegue de marcos avanzados de análisis de imágenes que a menudo se basan en modelos de IA. Esta tarea puede ser desalentadora para los biólogos experimentales. Por lo tanto, los pasos de manejo, procesamiento y análisis de datos pueden ralentizar en gran medida la investigación científica al tiempo que reducen el potencial de nuevos descubrimientos. Idealmente, los marcos de software para el análisis de bioimágenes deberían ayudar al usuario en cada paso del análisis, desde el manejo de archivos de microscopía sin procesar hasta la segmentación y el seguimiento hasta el análisis posterior para extraer información biológica. En la práctica, el rápido desarrollo de nuevos programas informáticos para el análisis de bioimágenes, si bien es un resultado positivo, ha tenido el efecto secundario de crear un panorama disperso de herramientas específicas para un paso de análisis concreto o que requieren conocimientos avanzados de programación. Esto deja al usuario con la desafiante tarea de ensamblar el flujo de trabajo de análisis, lo que a menudo resulta en canalizaciones subóptimas donde los datos se guardan, manipulan y convierten varias veces para que sean compatibles con la siguiente herramienta. Además, el desarrollo del análisis de bioimágenes no está estandarizado a un solo lenguaje de programación, y muchas herramientas se desarrollan como los complementos ImageJ¹² o QuPath¹³ (Java), los complementos Napari (Python)¹⁴ o los scripts de Python. En algunos casos, este entorno desafiante lleva a los científicos a optar por el análisis manual, un proceso que no solo es lento sino que también introduce sesgos humanos y dificulta la reproducibilidad.

Para resolver esto, se desarrolló Cell-ACDC (Cell-Analysis of the Cell Division Cycle)¹⁵, un conjunto de herramientas de software de código abierto basado en GUI escrito en Python para analizar datos de microscopía multidimensional. Fundamentalmente, Cell-ACDC proporciona una multitud de modelos de última generación preimplementados e instalados automáticamente (cuando sea necesario) para la segmentación (Cellpose, StarDist, Segment Anything, YeaZ, YeastMate, etc.16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,^27,28) y seguimiento (Trackastra, Trackpy, Bayesian Tracker, Cell-ACDC, etc.19,29,30,31,32,33,34). Estos modelos se complementan con un marco para visualizar datos anotados y correcciones manuales asistidas por computadora. Además, dentro del mismo marco, Cell-ACDC proporciona un módulo para cada paso de la canalización de análisis de imágenes, encargándose automáticamente del manejo, procesamiento y almacenamiento de datos (Figura 1). Más específicamente, permite al usuario realizar la segmentación de instancias (por ejemplo, células individuales), el seguimiento de objetos, la anotación de estados de células (por ejemplo, la etapa del ciclo celular) y varias formas de cuantificación, incluido el análisis de los canales de fluorescencia disponibles.

Una de las principales fortalezas de Cell-ACDC es el análisis de datos de microscopía de lapso de tiempo de células vivas, lo que plantea desafíos significativos debido a la necesidad de consistencia en todos los puntos de tiempo. Si bien existen numerosos modelos para la segmentación automatizada y el seguimiento de células individuales, las correcciones manuales siguen siendo esenciales para abordar cuestiones biológicas complejas. Cell-ACDC ofrece un conjunto de herramientas diseñadas específicamente para agilizar el proceso de corrección. Integra algoritmos inteligentes para minimizar el número de ajustes manuales. En particular, las correcciones se propagan automáticamente a través de todos los marcos futuros y pasados relevantes, preservando la integridad de los datos durante todo el análisis. Dado su diseño modular y su creciente base de usuarios, el desarrollo continuo de este software es una prioridad, con esfuerzos continuos centrados en integrar nuevos modelos y abordar las necesidades cambiantes de la comunidad.

Protocol

NOTA: Cell-ACDC está diseñado para ser lo más claro e intuitivo posible para los usuarios sin experiencia en programación. Esto se logra principalmente dividiendo el flujo de trabajo de análisis en pasos más pequeños y fáciles de seguir y proporcionando información adicional a través de información sobre herramientas y botones de información. Dado que Cell-ACDC cubre una amplia gama de pasos cuyo orden de ejecución a menudo no es secuencial, se muestra un gráfico de decisión en la Figura 2. La siguiente guía repasará un ejemplo específico. Los pasos 10 y 11 se pueden usar para importar otros datos en lugar de usar los datos proporcionados descargados en el paso 3.

1. Instalación de Cell-ACDC

NOTA: Cell-ACDC se distribuye actualmente como un paquete de Python a través del índice de paquetes de Python (PyPI) y se puede instalar con el comando pip install "cellacdc[torch]".

1. Configurar Miniforge
   1. Descarga el instalador desde el sitio web de Miniforge (consulta la Tabla de materiales para obtener más detalles).
   2. Instalar Miniforge: Para Windows, ejecute el instalador descargado y siga las instrucciones. Para Mac o Linux, abra la terminal y ejecute el siguiente comando:
      curl -L -O "https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Miniforge3-$(uname)-$(uname -m).sh
   3. Una vez completada la instalación, abra el terminal correcto siguiendo las instrucciones a continuación:
      1. Para Windows, presione Win + S, escriba Miniforge Prompt y presione Entrar.
      2. Para Mac/Linux: abra la aplicación Terminal.
2. Administrar el entorno virtual.
   1. En el símbolo del sistema, escriba el siguiente comando para crear un entorno virtual. Luego presione Enter para ejecutar el comando.
      conda create -y -n acdc python=3.12
   2. Active el entorno ejecutando:
      conda activar acdc
3. Instalación
   1. Con el entorno activo, instale Cell-ACDC ejecutando el siguiente comando:
      pip install "cellacdc[torch]"
   2. Después de la instalación, ejecute Cell-ACDC -y para permitir que el software finalice su configuración.

2. Ejecución de Cell-ACDC

1. Abra el terminal correcto (consulte el paso 1.1.3).
2. Active el entorno ejecutando el comando:
   conda activar acdc
3. Inicie Cell-ACDC ejecutando el siguiente comando:
   Celda-ACDC

3. Descarga de datos de muestra

NOTA: Los datos de ejemplo se descargarán en "C:\Users\%USERNAME%\acdc-appdata\acdc-examples\TimeLapse_2D\Position_8" en Windows y en "~/acdc-appdata/acdc-examples/TimeLapse_2D/Position_8" en MacOS y Linux. Si no se muestra la guía de bienvenida, seleccione Ayuda > Guía de bienvenida (Figura 3B) en la barra de menú de la ventana principal del iniciador de Cell-ACDC (Figura 1), .

1. Seleccione Descargar y probar con un ejemplo de lapso de tiempo (Figura 3B).
2. Espere hasta que finalice la descarga.
3. Haga clic en No, gracias para dejar de cargar los datos directamente en la GUI.

4. Módulo de preparación de datos

NOTA: Los datos se pueden alinear antes de la segmentación y se pueden seleccionar regiones de interés (ROI). Estos pasos son opcionales pero beneficiosos si el campo de visión se desplaza con el tiempo o si solo partes de los datos son de interés, respectivamente.

1. Haga clic en Iniciar módulo de preparación de datos... en la ventana principal para abrir el módulo de preparación de datos (Figura 1A, Módulo de preprocesamiento de datos).
2. Seleccione la carpeta que contiene los datos.
   1. Haga clic en el icono de carpeta en la barra de herramientas de la nueva ventana para cargar los datos de microscopía (Figura 4A).
   2. Seleccione la carpeta que contiene los datos y, a continuación, confirme la selección pulsando Seleccionar carpeta.
3. Seleccione un canal para el proceso de alineación utilizando el menú desplegable para seleccionar el canal phase_contr . Luego, presione Ok para confirmar la selección (Figura 4B).
4. Presione Ok para confirmar las propiedades de la imagen (Figura 4C).
   NOTA: Si trabaja con datos de pila z, pero solo se debe usar un segmento para la segmentación, seleccione el segmento z apropiado usando el control deslizante. Utilice los botones de la barra de herramientas para aplicar la selección a otros marcos si es necesario.
5. Ejecute el proceso de alineación.
   1. Haga clic en el botón de inicio , que también se encuentra en la barra de herramientas (Figura 5A).
   2. Haga clic en Sí para iniciar el proceso de alineación.
      NOTA: Haga clic en No para omitir la alineación.
   3. Presione Aceptar para confirmar que se reconoció la información sobre el relleno.
      NOTA: La alineación puede llevar tiempo, dependiendo del tamaño de los datos.
   4. Presione Aceptar para finalizar la alineación una vez que se complete el proceso.
6. Establezca ROI y ROI en segundo plano.
   1. Vaya al último fotograma del vídeo de segmentación utilizando el control deslizante de selección de fotogramas en la parte inferior de la GUI de preparación de datos.
   2. Ajuste el ROI de fondo agregado automáticamente arrastrándolo a través de la imagen o cambiando su tamaño usando los diamantes. Asegúrese de que el ROI de fondo no tenga celdas. Deje el ROI como está (Figura 5B).
      NOTA: Para definir ROI adicionales, haga clic en el botón Agregar ROI de recorte (ubicado en la barra de herramientas) y selecciónelos en el visor. Por lo general, el ROI debe ser lo más pequeño posible y al mismo tiempo abarcar todas las celdas de interés en los fotogramas relevantes. Sin embargo, para garantizar la reproducibilidad dentro de este protocolo, se recomienda no modificarlo.
7. Para recortar las ROI seleccionadas en nuevos archivos de imagen, haga clic en el botón Recortar más a la izquierda.
   NOTA: Este paso es opcional. Si no se necesitan imágenes recortadas, la ventana se puede cerrar. Las coordenadas de todos los ROI y ROI en segundo plano se guardan automáticamente y se pueden utilizar más tarde para la segmentación. Si no se cambió el ROI, estos botones no harán nada. Las opciones de recorte incluyen direcciones XY, cortes z o intervalos de tiempo específicos. Cada botón está etiquetado con las dimensiones que se recortarán.
8. Guardar los datos alineados
   1. Cierre la ventana con el botón de cierre de ventana (por ejemplo, la X en la esquina superior derecha en Windows o el punto rojo en la esquina superior izquierda en macOS o Linux).
   2. Presione Sí, guardar datos alineados para guardar los datos alineados.
   3. Haga clic en Sí, guardar datos alineados nuevamente para confirmar.
9. Guarde los datos recortados si no se omitió el paso 4.7 y no se modificó el ROI.
   1. Seleccione Sí, guardar datos recortados para guardar los datos recortados.
   2. Presione Sí, recortar por favor para confirmar el guardado del cultivo.
   3. Haga clic en Aceptar para confirmar la ruta de acceso predeterminada de la carpeta.
      NOTA: Seleccione una carpeta diferente para mantener los datos sin recortar.
   4. Seleccione Sí, sobrescribir para confirmar si la ruta predeterminada se usó antes.
   5. Presione Aceptar para confirmar después de que se complete el proceso.

5. Encontrar el mejor modelo y parámetros para la segmentación

NOTA: Cell-ACDC ofrece una GUI con retroalimentación en tiempo real para encontrar los mejores parámetros de segmentación (Figura 6). En general, estos modelos son proporcionados por terceros, cada uno con su propia documentación. Es responsabilidad del usuario determinar el mejor modelo de segmentación y sus parámetros óptimos, y los usuarios deben consultar la documentación del modelo respectivo que están probando para obtener más información.

1. Haga clic en Iniciar GUI ... en la ventana principal (Figura 1A, Visualizar y corregir módulo).
2. Cargue los datos de ejemplo.
   1. Haga clic en el icono de carpeta en la barra de herramientas de la nueva ventana para abrir el menú de selección de carpetas.
   2. Seleccione la carpeta que contiene los datos y, a continuación, pulse Seleccionar carpeta para confirmar la selección.
3. Seleccione un canal para la visualización. Usa el menú desplegable para seleccionar el canal phase_contr para la segmentación y, luego, selecciona Aceptar para confirmar.
4. Termine de cargar los datos.
   1. Presione Aceptar para confirmar el nombre de máscara de segmentación predeterminado.
   2. Haga clic en Aceptar para Posiciones cargadas para confirmar las propiedades de la imagen.
   3. Seleccione No para evitar la carga de datos de fluorescencia adicionales.
5. En el selector de modo (Figura 6, "Selector de modo"), seleccione el modo Segmentación y seguimiento.
6. Encuentre la mejor configuración de preprocesamiento.
   1. Vaya a Preprocesamiento de > de imágenes... en la barra de menú superior para abrir la ventana de preprocesamiento personalizada (Figura 7A).
   2. Selecciona Eliminar píxeles calientes u otro paso de preprocesamiento deseado en el menú desplegable.
   3. Utilice el icono de engranaje para inicializar y cambiar la configuración de un paso. Utilice el botón de información para mostrar información sobre el paso y los parámetros disponibles. Deje la configuración sin cambios.
   4. Usa el ícono más para agregar un paso más.
   5. Seleccione Volver a escalar intensidades y confirme la configuración repitiendo los pasos 5.6.1 y 5.6.2.
   6. Marque la casilla de verificación de vista previa para ver los efectos de los pasos en tiempo real.
   7. Haga clic en Aplicar a todos los fotogramas (Figura 7B).
   8. Pulse Guardar datos preprocesados para iniciar el proceso de guardado.
   9. Presione Aceptar para confirmar el nombre predeterminado.
   10. Cierre la ventana Receta de preprocesamiento .
7. Encuentra la mejor configuración de segmentación.
   1. Seleccione Segmento > marco Segmento mostrado en la cinta superior, luego seleccione YeaZ_v2 (Figura 8A).
   2. Presione Aceptar para descargar YeaZ_v2 si se le solicita.
      NOTA: La descarga puede tardar varios minutos. El progreso se muestra en la ventana de la consola. No cierre la GUI durante la descarga, incluso si no responde.
   3. Deje los parámetros predeterminados sin cambios.
      NOTA: La mayoría de los parámetros tienen botones de información que proporcionan instrucciones detalladas.
   4. Habilite el posprocesamiento marcando los parámetros de segmentación de posprocesamiento (Figura 8B).
   5. Acepte los parámetros haciendo clic en Aceptar.
      NOTA: La segmentación puede tardar un momento, dependiendo de la complejidad del modelo, el tamaño de la imagen y las especificaciones del equipo. Especialmente, la versión 4 de Cellpose puede ser muy lenta.
   6. Si se le pregunta sobre la activación de la segmentación automática, seleccione No.
   7. Verifique que la segmentación funcione bien.
   8. Repita el paso 5.7.1 para volver a abrir los parámetros de segmentación.
   9. Si los resultados de la segmentación son los esperados, pulse Guardar todos los parámetros en el archivo de recetas. De lo contrario, cambie los parámetros de segmentación y repita los pasos 5.7.4 a 5.7.8.
   10. Utilice la entrada de texto para dar a la receta de segmentación la prueba de nombre.
   11. Haga clic en Aceptar para aceptar el nombre.
   12. Presione Aceptar para terminar de guardar el flujo de trabajo.
   13. Cierre la pantalla de selección de parámetros.
8. Cerrar la ventana de la GUI
   1. Cierre la ventana de la GUI.
   2. Presione No para no guardar antes de cerrar.

6. Segmentación y seguimiento (procesamiento por lotes)

1. Haga clic en Iniciar módulo de segmentación... en la ventana principal (Figura 1A, módulo "Segmentar y rastrear").
   1. Seleccione los datos de ejemplo. Utilice el selector de carpetas de Cell-ACDC para elegir la carpeta que contiene los datos y, a continuación, pulse Seleccionar carpeta para confirmar la selección.
2. Seleccione los parámetros para el procesamiento por lotes.
   1. Seleccione el canal phase_contr_preprocessed como canal para la segmentación. Presione Ok para confirmar la selección.
      NOTA: Algunos modelos utilizan un canal adicional como entrada. Este canal se puede seleccionar posteriormente al establecer otros parámetros de segmentación.
   2. Confirme las propiedades de la imagen haciendo clic en Aceptar.
3. Establezca la configuración del modelo de segmentación.
   1. Elija YeaZ_v2 como el modelo que se debe utilizar para la segmentación y, a continuación, confirme la selección haciendo clic en Aceptar.
   2. Haga clic en el botón Cargar receta guardada... para cargar la receta guardada anteriormente.
   3. Seleccione segmentation_recipe_test.ini de la lista y, a continuación, confirme la selección haciendo clic en Aceptar.
   4. Descarte el mensaje de carga correcta presionando Aceptar.
   5. Confirme los parámetros seleccionando Aceptar.
4. Confirme otros ajustes de segmentación.
   1. Presione Aceptar para aceptar el nombre predeterminado del archivo de segmentación.
   2. Seleccione No para confirmar que toda la imagen debe segmentarse.
   3. Seleccione Aceptar para establecer el fotograma de parada como el fotograma final del timelapse.
5. Establezca la configuración de seguimiento. Seleccione YeaZ como el método de seguimiento que se utilizará, luego confirme la selección presionando Ok.
6. Ejecute la rutina de segmentación y seguimiento.
   1. Haga clic en Ejecutar ahora para ejecutar la canalización de segmentación y seguimiento.
      NOTA: Esto puede tardar varias horas en función del tamaño de la imagen, la complejidad del modelo y las especificaciones del equipo. En las ejecuciones de prueba, la segmentación de los datos de prueba con YeaZ_v2 tardó aproximadamente 2 minutos en un dispositivo sin GPU.
   2. Haga clic en Aceptar para completar la segmentación.

7. Corrección de errores de segmentación y seguimiento

NOTA: En general, las celdas que faltan en el marco actual en comparación con el anterior se indican con un contorno y un ID amarillos. Las celdas recién detectadas aparecen con un ID rojo y un contorno grueso. Las celdas que se han aceptado como perdidas se muestran con un contorno e ID verdes.

1. Haga clic en Iniciar GUI... en la ventana principal (Figura 1A, módulo "Visualizar y corregir").
2. Cargue los datos de ejemplo.
   1. Haga clic en el icono de carpeta en la barra de herramientas de la nueva ventana.
   2. Seleccione la carpeta que contiene los datos y, a continuación, pulse Seleccionar carpeta para confirmar la selección.
3. Seleccione un canal para la visualización. Usa el menú desplegable para seleccionar el canal phase_contr_preprocessed y, luego, selecciona Aceptar para confirmar.
4. Seleccione el nombre de la máscara de segmentación. Seleccione Cargar seleccionado para cargar el archivo de segmentación creado en el paso anterior.
5. Finalice el proceso de carga de datos.
   1. Confirme las propiedades de la imagen haciendo clic en Aceptar para Posiciones cargadas.
   2. Seleccione No para evitar la carga de datos de fluorescencia adicionales.
6. Utilice el selector de modo (Figura 6, "Selector de modo") para seleccionar el modo de segmentación y seguimiento .
   NOTA: Utilice las casillas de verificación en la parte inferior de la GUI para cambiar las anotaciones mostradas. Las imágenes de la izquierda y la derecha pueden mostrar diferentes anotaciones.
7. Seleccione un rastreador en tiempo real. En la barra de menú (Figura 6, "Barra de menú"), vaya a Seguimiento > Seleccione el algoritmo de seguimiento en tiempo real y seleccione el rastreador en tiempo real deseado. Utilice los pasos Cell-ACDC o Cell-ACDC 2 para la levadura en ciernes o la división simétrica Cell-ACDC para otros organismos.
8. Corrige la segmentación y el seguimiento.
   1. Utilice las teclas de flecha izquierda y derecha para navegar entre fotogramas.
   2. Vaya al fotograma 10.
   3. Presione la tecla S para activar la herramienta manual de separación de brotes.
   4. Utilice el botón derecho para dividir automáticamente la máscara de segmentación de la celda 1.
   5. Vaya al cuadro 14.
   6. Presione la tecla B para activar el pincel.
   7. Dibuje la máscara de segmentación que falta para el brote con el botón izquierdo del mouse.
   8. Revise los fotogramas posteriores mientras corrige los errores de segmentación y seguimiento. Utilice las herramientas disponibles (Figura 6, "Editar barra de herramientas"). Corrija al menos hasta el cuadro 42.
      NOTA: La mayoría de las herramientas tienen una información sobre herramientas que explica su funcionalidad. Pase el cursor sobre una herramienta para mostrar la información sobre herramientas.

8. Anotaciones del ciclo celular

NOTA: Solo pase a este paso después de finalizar las correcciones de segmentación y seguimiento para todos los fotogramas de interés. Utilice el modo de anotación correcto según el tipo de división celular (simétrica, por ejemplo, células de mamíferos, o asimétrica, por ejemplo, levadura en ciernes). Para obtener los datos de muestra, consulte "Células que se dividen asimétricamente", paso 8.1. El paso 8.2 describe el flujo de trabajo general para células de división simétrica.

1. Células que se dividen asimétricamente
   NOTA: Para organismos como la levadura en ciernes, los brotes se pueden asignar a las madres. Ambos objetos deben estar presentes en el mismo marco. De forma predeterminada, se muestra la etapa del ciclo celular esperada basada en las anotaciones de la levadura en ciernes. La etapa del ciclo celular de los cogollos se muestra en rojo, mientras que la de todos los demás objetos se muestra en blanco. Las madres están conectadas a sus cogollos con una línea amarilla discontinua.
   1. Active el análisis del ciclo celular utilizando el selector de modo (Figura 6, "Selector de modo").
   2. Seleccione Sí, vaya al cuadro 1 cuando se le solicite.
   3. Utilice las teclas de flecha izquierda y derecha para navegar entre fotogramas.
   4. Vaya al fotograma 41. Haga clic en Aceptar para aceptar la inicialización de la tabla Anotación de ciclo de celda cuando se le solicite.
   5. Haga clic con el botón derecho en la celda 1 o en su botón para separar la conexión y anotar el evento de división celular.
   6. Continúe hasta que se hayan visto todos los fotogramas relevantes. Corrija errores en las asignaciones automáticas de botones madre utilizando las herramientas disponibles (Figura 6, "Editar barra de herramientas").
   7. Herramientas disponibles
      NOTA: Estas herramientas, excepto la herramienta Romper/Volver a vincular la asociación madre-yema , se pueden activar mediante un acceso directo personalizable o presionando los botones asociados en la barra de herramientas.
      1. Asignar Bud a la Madre (A): Activa la herramienta Asignar Bud a la Madre . Mantenga presionado el botón derecho del mouse sobre el auricular. Arrastre a la celda madre correspondiente y suelte el botón del mouse.
         NOTA: Utilice esta herramienta cuando la asignación automática de brotes a las madres sea incorrecta.
      2. Anotar historial desconocido (U): active la herramienta Anotar historial desconocido . Use el botón derecho del mouse para hacer clic en la celda que debe anotarse como que tiene un historial desconocido.
         NOTA: Utilice esta herramienta para anotar manualmente celdas con un historial desconocido, lo que ayuda a corregir ambigüedades de linaje donde la inferencia automática es insuficiente.
      3. Reinicializar la anotación del ciclo celular
         NOTA: Utilice esta opción para volver a ejecutar el algoritmo de anotación de ciclo de celda desde el fotograma actual en adelante. Esto garantiza la coherencia con las correcciones o actualizaciones recientes realizadas en los datos de segmentación/seguimiento.
      4. Romper/volver a enlazar la asociación madre-brote: asegúrese de que no se haya seleccionado ninguna otra herramienta. Haga clic con el botón derecho en un par de brotes madre existente para romper la asociación, o haga clic con el botón derecho nuevamente para restablecer la conexión.
2. Células en división simétricas
   NOTA: Esta función está en fase de prueba beta y se lanzará oficialmente pronto. Es posible asignar dos o más células hijas a una sola célula madre. Las células madre potenciales son las presentes en el marco anterior pero ausentes en el actual, mientras que las células hijas potenciales son células de nueva aparición en el marco actual.
   1. Activar división normal: árbol de linaje usando el selector de modo (Figura 6, "Selector de modo").
   2. Seleccione Sí, vaya al cuadro 1 cuando se le solicite.
   3. Utilice las teclas de flecha izquierda y derecha para navegar entre fotogramas.
   4. Corrija errores en las asignaciones automáticas de madre e hija utilizando las herramientas disponibles (Figura 6, "Editar barra de herramientas").
   5. Propagar los cambios cuando se le solicite haciendo clic en Propagar.
   6. Herramientas disponibles
      NOTA: Estas herramientas se pueden activar usando el acceso directo o los botones respectivos en la barra de herramientas.
      1. Buscar la madre para un nuevo ID de celda (F): Active la herramienta Buscar madre para un nuevo ID de celda . Haga clic con el botón derecho en la nueva celda para recorrer las células madre candidatas. Mayús + clic derecho para retroceder por los candidatos.
         NOTA: Utilice esta herramienta para asignar o modificar la madre de una celda hija.
      2. Establecer madre desconocida (U): Activa la herramienta Establecer madre desconocida . Haga clic con el botón derecho en la celda cuya madre se desconoce.
         NOTA: Utilice esta herramienta para designar manualmente la madre de una célula como desconocida.

9. Guardar datos

1. Vaya a Archivo > Guardar en la cinta superior.
2. Haga clic en Establecer medidas... para seleccionar las medidas deseadas.
3. Marque la casilla de verificación junto a las métricas de mCitrine o cualquier otra medida deseada.
4. Haga clic en Aceptar para confirmar.
5. Haga clic en Sí para guardar las mediciones.
6. Haga clic en Aceptar para confirmar el fotograma hasta el que se deben guardar las mediciones.
7. Haga clic en No cuando se le pregunte sobre la concatenación de datos.

10. Crea la estructura de datos

NOTA: En esta sección se describe la preparación de los datos de microscopía para la segmentación y el seguimiento. Esto se puede omitir cuando se utilizan datos de demostración, que se descargan en "Descarga de datos de ejemplo". La estructura de datos que se generará se describe en la Figura 9.

1. Coloque los archivos de microscopía en una carpeta vacía.
   NOTA: Se admiten formatos de microscopía como .czi (Zeiss), .lif (Leica) y .nd2 (Nikon), así como archivos de .tif y .png individuales.
2. Haga clic en el módulo 0. Crear estructura de datos... en la ventana principal (Figura 1A, módulo "Crear estructura de datos").
3. Seleccione BioIO o Fiji Macro.
   1. Si se usa Windows , haga clic en Usar BioIO, mientras que para los usuarios de MacOS y Linux , seleccione Usar macro de Fiji.
      NOTA: A continuación, se supone que se utiliza Windows.
   2. Si se le solicita que instale BioIO, presione Aceptar para instalar.
   3. Seleccione la disposición del archivo de microscopía. Seleccione la opción que coincida con la disposición de los archivos de microscopía usando el menú desplegable, luego presione Aceptar para confirmar.
4. Seleccionar carpetas de origen y destino y estrategia de carga de datos
   1. Presione Listo para confirmar que los archivos están en una carpeta vacía.
   2. Utilice el selector de carpetas de Cell-ACDC para elegir la carpeta que contiene los archivos.
   3. Presione Seleccionar carpeta para elegir una carpeta.
   4. Presione Seleccionar carpeta nuevamente para elegir la misma carpeta que la carpeta de destino.
      NOTA: El archivo de microscopía sin procesar no se elimina.
   5. Seleccione Sí, cargar toda la posición a la vez.
5. Si se le solicita que instale un subpaquete de BioIO, presione Aceptar para instalar.
6. Establezca los metadatos del archivo de entrada.
   1. Corrija los metadatos.
      NOTA: Vuelva a verificar el "Orden de las dimensiones" haciendo clic en el icono del ojo pequeño junto a los campos del nombre del canal . Se resaltan otros metadatos que no se pudieron cargar desde el archivo sin procesar.
   2. Presione Aceptar para confirmar los metadatos.
   3. Pulse Sí para confirmar el orden de las dimensiones.
7. Espera a que finalice el proceso.
8. Presione Sí para cerrar la ventana cuando finalice el proceso.
   NOTA: La creación de la estructura de datos puede tardar horas dependiendo del tamaño de los datos.

11. Utilidades de preprocesamiento de datos

NOTA: En la ventana principal hay varias opciones disponibles para procesar imágenes antes de pasar al análisis. Para acceder a estas herramientas, vaya al menú desplegable Utilidades en la barra de menú de la ventana principal (Figura 1B, "Utilidades"), coloque el cursor sobre Preprocesamiento de imágenes y luego seleccione la opción que debe usarse. Dos ejemplos son:

1. Combinar canales: use esta opción para fusionar dos o más canales de imagen.
   NOTA: Por ejemplo, se pueden promediar dos canales de fluorescencia.
2. Cambiar el tamaño de las imágenes: use esto para reducir el tamaño de conjuntos de datos de imágenes muy grandes.
   NOTA: Esto puede acelerar significativamente el tiempo de procesamiento y, en muchos casos, tiene poco o ningún impacto en la calidad de la segmentación.

12. Solución de problemas

1. Si Cell-ACDC falla, cree un informe de errores en la página de GitHub de Cell-ACDC navegando a la pestaña Problemas y haciendo clic en el botón verde Nuevo problema . Siga la plantilla proporcionada para incluir todos los detalles relevantes necesarios para diagnosticar y resolver el problema. Alternativamente, siéntase libre de buscar ayuda en el foro de image.sc usando la etiqueta #cell-acdc o comuníquese con uno de los autores correspondientes. En muchos casos, especialmente después de instalar un paquete, simplemente reiniciar el software puede resolver el problema.
2. Si Cell-ACDC se bloquea o deja de responder, compruebe si hay actualizaciones de progreso en la consola. Los tiempos de segmentación largos, especialmente cuando se utilizan modelos computacionalmente intensivos, como Cellpose versión 4, o se procesan grandes conjuntos de datos, son normales. Si Cell-ACDC sigue sin responder, consulte el paso 12.1 para obtener más instrucciones.
3. Si la segmentación automática incluye incorrectamente el fondo, compruebe si un paso de preprocesamiento puede haber suavizado demasiado el fondo. Muchos modelos de segmentación se entrenan con imágenes sin procesar (no preprocesadas) y pueden tener un rendimiento deficiente cuando el fondo carece de suficiente textura.

Results

Cuantificación del volumen nuclear en esferoides tumorales en 3D

La microscopía 3D automatizada (z-stacks) permite a los científicos visualizar sistemas multicelulares complejos como los organoides. Para cuantificar las propiedades morfológicas y de la señal de fluorescencia a nivel de una sola célula, a menudo se requiere la segmentación celular en 3D. El siguiente ejemplo demuestra cómo Cell-ACDC puede segmentar los núcleos en organoides que contienen miles de células del canal de tinción nuclear y cuantificar su volumen (datos de ^Ref.9). La segmentación se realizó utilizando un modelo Cellpose personalizado que se entrenó y publicó en ^Ref.9. El modelo de Cellpose entrenado se puede usar directamente en Cell-ACDC proporcionando la ruta del archivo de ponderaciones en la GUI al seleccionar los parámetros del modelo para Cellpose v2. La segmentación se realizó utilizando el segundo módulo de Cell-ACDC para procesar por lotes todas las imágenes (Figura 1A, módulo "Segmentar y rastrear"). A continuación, el resultado se visualizó en la GUI del tercer módulo (Figura 1A, módulo "Visualizar y corregir"). Este módulo se ha optimizado para visualizar miles de objetos individuales con múltiples opciones de anotación (por ejemplo, contornos, máscaras de segmentación superpuestas o ID de texto). Después de calcular las mediciones de las máscaras 3D, todas las mediciones disponibles se documentaron directamente en la GUI. Se puede acceder a ellos yendo a la barra de menú superior (Figura 6, "Barra de menú"), seleccionando el menú Medidas y luego Establecer medidas.... El cuadro de diálogo emergente permite a los usuarios obtener información específica de la medición desde los botones de información y seleccionar qué mediciones guardar. Para los resultados representativos de la Figura 10, se utilizó "cell_vol_fl_3D", que es el volumen de cada objeto calculado multiplicando el total de vóxeles en el objeto por el tamaño de píxel al cuadrado y la profundidad del vóxel. Estas propiedades se extraen automáticamente del archivo sin procesar de microscopía o son proporcionadas por el usuario. El cálculo de las mediciones de esta GUI requiere cargar las imágenes sin procesar. Por lo tanto, para agilizar el proceso y permitir el procesamiento por lotes, las mediciones también se pueden calcular desde el menú Utilidades (Figura 1B, "Utilidades"), yendo al submenú Mediciones y luego a Calcular medidas para uno o más experimentos. Finalmente, se representó la distribución del volumen nuclear como resultado representativo (Figura 10). Este análisis revela una fracción significativa de núcleos pequeños, probablemente debido a artefactos de segmentación. Podrían eliminarse fácilmente filtrando objetos pequeños de la máscara de segmentación. Al mismo tiempo, los núcleos muy grandes podrían deberse a núcleos fusionados durante la segmentación. Siempre se recomienda trazar la distribución de volumen de los objetos (por ejemplo, células individuales) para identificar artefactos y extraer información biológica adicional sobre el tamaño de la célula.

Cuantificación de datos de microscopía de lapso de tiempo

Con la microscopía de lapso de tiempo, la dinámica celular se puede observar directamente a nivel unicelular. Además de la segmentación celular, la extracción de la dinámica temporal requiere un análisis adicional, incluido el seguimiento celular y la anotación del pedigrí celular. Debido a la interdependencia de estas etapas de análisis, los errores introducidos al principio de la canalización pueden propagarse a pasos posteriores. Como resultado, es necesaria la visualización y corrección continuas de los errores de segmentación, seguimiento y anotación. A continuación se demuestra que Cell-ACDC es adecuado para abordar estas tareas. Se seleccionaron dos conjuntos de datos de dos organismos modelo diferentes: 1) levadura en ciernes (cepa DCY001-1 de la ^Ref.35, donde las dos proteínas histonas H2B, Htb1 y Htb2, están marcadas con mCitrine), y 2) células madre embrionarias de ratón (mESC, datos de la ^Ref.22).

Estos dos conjuntos de datos destacan dos modos de anotación disponibles en Cell-ACDC: división celular asimétrica y simétrica (es decir, citocinesis simétrica o "normal"). Como el modo de división difiere, los dos organismos requieren un marco de seguimiento y anotación diferente.

En la división asimétrica, la célula madre forma un brote que crece y finalmente se separa para convertirse en una célula hija. Después de la división, la célula madre conserva su ID de celda original y su número de generación aumenta en uno, mientras que a la celda hija se le asigna un nuevo ID de celda y su número de generación se establece en uno. La fase de gemación corresponde a las fases S/G2/M del ciclo celular y se anota como tal en Cell-ACDC. Estas opciones de anotación ayudan a abordar preguntas biológicas típicas relacionadas con el ciclo celular en levaduras en ciernes.

En el caso de la división "simétrica" (por ejemplo, células de mamíferos), la célula madre se divide en dos células hijas. La célula madre, es decir, su ID, desaparece al dividirse, y las dos células hijas reciben nuevas ID. Además, el número de generación de las células hijas aumenta en uno en relación con la célula madre. Cell-ACDC también realiza un seguimiento del ID principal, el ID raíz (la celda antecesora original al comienzo de un linaje) y el ID hermano.

Para ambos modos de anotación, se desarrolló un marco innovador para corregir errores de anotación, donde la corrección se propaga automáticamente a todos los puntos de tiempo relevantes pasados y futuros. La visualización, anotación y corrección se realizaron en la GUI del tercer módulo (Figura 1A, módulo "Visualizar y corregir" y Figura 6). Para segmentar y rastrear las celdas en el conjunto de datos 1, se aplicó el modelo YeaZ_v2²⁶ al canal de contraste de fase, mientras que para el canal nuclear (histona) se utilizó el modelo StarDist²⁵ . Luego, usando la utilidad Seguimiento y linaje > Rastrear y/o contar objetos subcelulares (Figura 1B, barra de menú de Utilidades ), Cell-ACDC asignó a cada núcleo el ID de celda de su celda correspondiente, asegurando la coherencia entre las tablas generadas a partir de máscaras de celda y núcleo.

Para el conjunto de datos 2, se utilizó el modelo de segmentación DeepSea²² . Los tres modelos ya están disponibles en Cell-ACDC, lo que muestra la ventaja de integrar varios modelos de segmentación en el software.

Una vez corregidos los errores de segmentación y seguimiento, se anotaron los pedigríes celulares, se calcularon las características numéricas y se llevó a cabo un análisis posterior. Para el conjunto de datos 1, el TaYFP_amount_autoBkgr de columna y el número de núcleos segmentados (Figura 11A) se trazaron en función del tiempo. "TaYFP" es el nombre del canal nuclear. "amount_autoBkgr" es un proxy de la cantidad total de proteína celular extraída de las imágenes de epifluorescencia³⁶. Se calcula como la diferencia entre la intensidad media de fluorescencia en cada máscara celular y la mediana de fondo, multiplicada por el área de la celda (en píxeles). Aquí, la mediana de fondo se calcula a partir de todos los píxeles que no están segmentados como celdas. Como se esperaba, la cantidad de H2B comienza a aumentar en la emergencia de las yemas (Figura 11A-ii) y alcanza un valor constante antes de la división nuclear (Figura 11A-iii). Este es un control de calidad importante en la homeostasis de las proteínas histonas, ya que se espera que la cantidad de proteínas histonas dependa del ciclo celular. Además, trazar el número de núcleos a lo largo del tiempo confirma que las cantidades de proteínas histonas alcanzan el máximo aproximadamente alrededor de la división nuclear.

Para el conjunto de datos 2, se graficó el área de la celda a lo largo del tiempo para una célula seleccionada que se sometió a división celular. Como era de esperar, el área de la celda aumenta hasta alcanzar un valor máximo (Figura 11B-i). Luego, disminuye hasta la división celular (Figura 11B-ii) a medida que la célula se contrae. Finalmente, el ciclo se reinicia para las dos células hijas. Este es otro análisis recomendado, ya que verificar los cambios de tamaño celular a lo largo del ciclo celular es esencial para confirmar que las células están creciendo y dividiéndose como se esperaba (o no en el caso de mutantes específicos).

Figura 1: Módulos Cell-ACDC. (A) Descripción general de los 4 módulos principales que se pueden lanzar desde el lanzador principal de Cell-ACDC. Después de segmentar, rastrear y anotar datos de microscopía, las características numéricas se pueden calcular desde el tercer módulo ("Visualizar y corregir") o desde (B) el menú Utilidades en la barra de menú superior. Las "Utilidades" son las rutinas que pueden ejecutarse automáticamente en múltiples conjuntos de datos sin la intervención del usuario. Además de calcular las mediciones, otras utilidades incluyen la concatenación de múltiples tablas de salida en una sola tabla, el seguimiento de objetos subcelulares y el preprocesamiento de imágenes. Cell-ACDC admite datos 2D, 3D (z-stack o time-lapse) y 4D (z-stacks a lo largo del tiempo), con cualquier número de canales adicionales. La tabla de salida con las características numéricas se puede utilizar para el análisis posterior y el descubrimiento biológico (Figura 10 y Figura 11). Para ello, están disponibles los cuadernos de Jupyter en la página de GitHub de Cell-ACDC, que incluyen ejemplos de trazados que se pueden obtener de la tabla de salida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Diagrama de flujo de decisiones de Cell-ACDC. Un diagrama de flujo que describe el módulo que se utilizará según el tipo de conjunto de datos y los requisitos de análisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Descargar datos de ejemplo. (A) Abra la Guía de bienvenida. (B) Descargue los datos de ejemplo necesarios para replicar el protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Carga de datos para la preparación de datos. (A) Cargue datos en la GUI de preparación de datos. (B) Seleccione el canal para cargar. (C) Edite y confirme los metadatos de la imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Ejecución del proceso de preparación de datos. (A) Inicie el proceso. (B) ROI de posición (para recortar) y ROI de fondo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Tercer módulo GUI para visualizar y corregir resultados. Captura de pantalla de la GUI del tercer módulo ("Visualizar y corregir" en la Figura 1A) con elementos resaltados. Tenga en cuenta que la mayoría de los botones de las barras de herramientas tienen una información sobre herramientas (accesible pasando el cursor del mouse sobre el botón) que explica cómo usar esa función específica. El selector de modo se puede utilizar para cambiar entre 5 modos: "Visor", "Segmentación y seguimiento", "Análisis del ciclo celular" (para células que se dividen asimétricamente), "División normal: árbol de linaje" (para células que se dividen simétricamente, por ejemplo, células de mamíferos) y "Anotaciones personalizadas". Tenga en cuenta que una barra de herramientas o barra de menú a menudo está presente en las otras GUI (por ejemplo, el módulo "Preprocesamiento de datos", Figura 1). La barra de herramientas Editar contiene todas las funciones que se pueden utilizar para editar y corregir errores de segmentación y seguimiento (por ejemplo, pincel, borrador, ID de edición, etc.). La imagen cargada se muestra en una vista de dos paneles, lo que resulta útil cuando se necesitan diferentes opciones de anotación (por ejemplo, información del ciclo de celda en la imagen de la izquierda e ID en la imagen de la derecha). La imagen de la derecha también se puede desactivar (haga clic con el botón derecho en la imagen y anule la selección de Mostrar imagen reflejada). Cada panel de imagen incluye un control deslizante LUT en el lateral para ajustar rápidamente los niveles de intensidad. Al hacer clic con el botón derecho en el control LUT, el usuario puede seleccionar diferentes mapas de color para las imágenes de intensidad. Además, en el lado derecho, hay un selector de LUT para el color de las etiquetas de segmentación que se superponen en las imágenes de intensidad (opción de anotación llamada Segm. máscaras). En el lado izquierdo de las opciones de anotación para la imagen de la izquierda, hay conmutadores adicionales para controlar algunas configuraciones, como el guardado automático, el tamaño de fuente, etc. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Visualice el preprocesamiento en la GUI principal. (A) Abra el cuadro de diálogo de preprocesamiento. (B) Diálogo de preprocesamiento con parámetros utilizados en el Protocolo inicializado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Visualice la salida de segmentación en la GUI principal. (A) Seleccione un modelo de segmentación. (B) Configure parámetros de segmentación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Estructura de carpetas requerida por Cell-ACDC. Para trabajar con Cell-ACDC, los datos deben organizarse en una estructura de carpetas específica. Si bien Cell-ACDC proporciona un módulo para generar automáticamente esta estructura, es importante comprender cómo debería verse esta estructura. Primero, todos los archivos deben estar dentro de una carpeta llamada Imágenes. A continuación, todos deben comenzar con el mismo nombre, el llamado "basename_". El conjunto mínimo de archivos requeridos es un archivo TIFF de un solo canal (2D, 3D z-stack o 3D+time) y un archivo CSV que termina en "_metadata.csv". Este archivo debe ser una tabla con dos columnas, la primera columna llamada Descripción y la segunda columna llamada valores, y debe contener al menos entradas para SizeT y SizeZ para el número de fotogramas y z-slices, respectivamente. Si un archivo de imagen no tiene z-slices, SizeZ debe establecerse en 1. Lo mismo ocurre con las imágenes sin lapso de tiempo, donde SizeT debe ser 1. Al ser un archivo CSV, una entrada es una sola línea de Description,value, separada por una coma, por ejemplo, SizeZ,1. Para varios canales, se debe generar un archivo TIFF por canal. La carpeta Imágenes debe colocarse dentro de una carpeta llamada "Position_1". Se permiten múltiples posiciones y deben nombrarse con un número consecutivo. Al cargar datos en cualquiera de los módulos Cell-ACDC, el usuario puede seleccionar una carpeta de posición específica o toda la carpeta del experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: Cuantificación 3D de organoides tumorales. Captura de pantalla de un organoide tumoral representativo (datos de⁹) cargado en la GUI del tercer módulo de Cell-ACDC (izquierda), ejemplos de cortes z con contornos rojos que resaltan las máscaras de segmentación (centro) e histograma de la distribución del volumen celular calculado a partir de las máscaras de segmentación 3D (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11: Cuantificación de datos de microscopía de lapso de tiempo. (A) Captura de pantalla de los datos de microscopía de lapso de tiempo de las células de levadura en ciernes cargadas en la GUI del tercer módulo de Cell-ACDC (izquierda) y la cuantificación de la cantidad de proteína histona H2B a lo largo del tiempo en un ciclo celular representativo (derecha). Las imágenes ampliadas muestran la célula de ejemplo y su yema (flechas blancas) al inicio del ciclo celular (i), en la emergencia de la yema (ii) y en la división nuclear (iii). Los datos se toman de Chatzitheodoridou et ^al.35 (B) Captura de pantalla de datos de microscopía de lapso de tiempo de células madre embrionarias de ratón cargadas en la GUI del tercer módulo de Cell-ACDC (izquierda) y el área celular (μm²) trazada en función del tiempo de una célula representativa que se somete a división celular. Las imágenes ampliadas muestran la celda de ejemplo y sus hijas en el área máxima de la celda antes de la división (i), la división en dos celdas hijas (ii) y el último fotograma analizado después de la división (iii). Los datos se toman de Zargari et ^al.22,33. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El análisis de datos de microscopía multidimensional a menudo requiere el uso de modelos de vanguardia impulsados por IA. Sin embargo, estas herramientas se desarrollan rápidamente y tienen una importante barrera de entrada para su adopción. Además, los biólogos a menudo necesitan la visualización del resultado para una corrección efectiva de errores. Aquí, se demuestra cómo los científicos pueden usar Cell-ACDC para abordar estos desafíos.

Un paso crítico del protocolo presentado es seleccionar el modelo de segmentación óptimo. Cell-ACDC incluye una GUI que permite la selección visual (Figura 1A, módulo "Visualizar y corregir"). También se proporcionan herramientas para preparar datos y procesamiento por lotes de múltiples conjuntos de datos (Figura 1A, Crear estructura de datos, Preprocesamiento de datos, Módulos de segmento y seguimiento y Utilidades). Se recomienda a los usuarios que informen problemas y proporcionen comentarios en el foro de image.sc (utilizando la etiqueta #cell-acdc) o abriendo un problema en la página de GitHub de Cell-ACDC.

Si bien Cell-ACDC ya se ha utilizado en datos relativamente grandes, como con esferoides en imágenes con miles de núcleos⁹, o datos de lapso de tiempo de levadura en ciernes con cientos de células por cuadro, el programa debe cargar todos los datos de un solo canal en la RAM para funcionar correctamente. Se recomienda aproximadamente tres veces el tamaño del archivo de imagen en la memoria disponible para garantizar un rendimiento estable. En la actualidad, los conjuntos de datos que exceden la memoria disponible del sistema no se pueden procesar, pero se planea el soporte para la carga fuera del núcleo (diferida) a través de la integración de OME-Zarr³⁷.

Actualmente, una de las principales limitaciones de Cell-ACDC es el soporte parcial para conjuntos de datos 3D + tiempo, ya que la mayoría de las herramientas se han desarrollado para datos 3D z-stack o 2D + tiempo. Por lo tanto, las futuras versiones de Cell-ACDC ampliarán sus capacidades con soporte completo para datos 3D + tiempo. Además, estamos trabajando en la ampliación del marco de anotación del pedigrí celular para las células que se dividen "simétricamente" (por ejemplo, células de mamíferos), que son aquellas células en las que la célula madre se divide en dos células hijas (a diferencia de la levadura en ciernes, donde la célula madre, una vez por ciclo celular, da lugar a una sola célula hija a través de la gemación). Finalmente, a partir de ahora, Cell-ACDC se limita a datos cuyos datos de un solo canal encajan completamente en la RAM. Por lo tanto, planeamos implementar la carga diferida como se mencionó anteriormente.

Desde su lanzamiento, Cell-ACDC se ha mejorado constantemente, por ejemplo, agregando nuevos modelos de segmentación y seguimiento, nuevos marcos de anotación (por ejemplo, para células de mamíferos, actualmente en pruebas beta) y varias mejoras de rendimiento. Gracias a estos desarrollos, los científicos pudieron emplear Cell-ACDC para acelerar la investigación y permitir el descubrimiento científico 6,9,16,35,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48 ^,49. Lo que hace que este marco de software sea único en comparación con los métodos existentes 14,27,50,51 es su capacidad para aprovechar y complementar los modelos existentes, beneficiándose así de los desarrollos de la comunidad. El desarrollo continuo de Cell-ACDC se mantiene activamente para establecerlo como un marco de referencia para analizar datos de microscopía multidimensional.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BEBÉ	Julian Pietsch	10.7554/eLife.79812	El software de segmentación y seguimiento, opcional, puede instalarse automáticamente con Cell-ACDC
Rastreador bayesiano	Kristina Ulicna	10.3389/fcomp.2021.734559	El software de seguimiento, opcional, puede instalarse automáticamente con Cell-ACDC
Cell-ACDC	Francesco Padovani	10.1186/s12915-022-01372-6	Software
Núcleos de la línea germinal del cellpose	Cristina Piñ eiro Ló pez / Ana Rita Rodrigues Neves / Ivana avka	10.17912/MICROPUB. BIOLOGY.001062	El software de segmentación, opcional, puede instalarse automáticamente con Cell-ACDC
Cellpose versión 2	Carsen Stringer	10.1038/s41592-020-01018-x	El software de segmentación, opcional, puede instalarse automáticamente con Cell-ACDC
Cellpose versión 3	Carsen Stringer	10.1038/s41592-025-02595-5	El software de segmentación, opcional, puede instalarse automáticamente con Cell-ACDC
Cellpose versión 4 (Cellpose-SAM)	Marius  Pachitariu	10.1101/2025.04.28.651001	El software de segmentación, opcional, puede instalarse automáticamente con Cell-ACDC
Ordenador	-	-	Consulta las especificaciones recomendadas a continuación
Ordenador - CPU	Cualquier	-	Mínimo recomendado de 4 núcleos, 2,5 GHz y nbsp;
Ordenador - GPU	Nvidia (preferido) y nbsp;	-	(Opcional) Mínimo recomendado de 8GB de VRAM
Ordenador - Espacio en el disco duro	Cualquier	-	4GB + 3 x tamaño de archivo de microscopía
Ordenador - Sistema operativo	Microsoft, Apple, otros	-	Se soportan Windows, MacOS y Linux
Ordenador - RAM	Cualquier	-	3 x tamaño de archivo de una sola posición, mínimo 16GB
DeepSea	Abolfazl  Zargari	10.1016/j.crmeth.2023.100500	El software de segmentación y seguimiento, opcional, puede instalarse automáticamente con Cell-ACDC
DeLTA y Independencia;	Jean-Baptiste Lugagne / Owen M. O' Connor	10.1101/720615 / 10.1371/journal.pcbi.1009797	El software de segmentación y seguimiento, opcional, puede instalarse automáticamente con Cell-ACDC
InstanSeg	Thibaut Goldsborough	10.48550/arXiv.2408.15954	El software de segmentación, opcional, puede instalarse automáticamente con Cell-ACDC
Miniforge	Conda-Forge	-	Enlace para descargar el instalador desde la web de Miniforge: https://conda-forge.org/download/
Omnipose	Kevin Cutler	10.1038/s41592-022-01639-4	El software de segmentación, opcional, puede instalarse automáticamente con Cell-ACDC
pomBseen	Makoto Ohira	10.1371/journal.pone.0291391	El software de segmentación, opcional, puede instalarse automáticamente con Cell-ACDC
SAM (Modelo de Segmento de Cualquier Cosa)	Alexander Kirillov	10.48550/arXiv.2304.02643	El software de segmentación, opcional, puede instalarse automáticamente con Cell-ACDC
StarDist	Uwe Schmidt / Martin Weigert	10.1007/978-3-030-00934-2_30 / 10.1109/WACV45572.2020.9093435 / 10.1109/ISBIC56247.2022.9854534	El software de segmentación, opcional, puede instalarse automáticamente con Cell-ACDC
DANTA	Carl Doersch	10.48550/arXiv.2306.08637	El software de seguimiento, opcional, puede instalarse automáticamente con Cell-ACDC
Trackastra	Benjamin Gallusser	https://doi.org/10.48550/arXiv.2405.1570	El software de seguimiento, opcional, puede instalarse automáticamente con Cell-ACDC
Trackpy	Daniel Allan	10.5281/zenodo.1213240	El software de seguimiento, opcional, puede instalarse automáticamente con Cell-ACDC
YeastMate	David Bunk	10.1093/bioinformática/btac107	El software de segmentación, opcional, puede instalarse automáticamente con Cell-ACDC
YeaZ	Nicola Dietler	10.1038/s41467-020-19557-4	El software de segmentación y seguimiento, opcional, puede instalarse automáticamente con Cell-ACDC