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Dinámica de la locomoción dependiente de la edad en Caenorhabditis elegans: un análisis de exponentes de Lyapunov

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DOI:

10.3791/68955

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23 de septiembre de 2025

 ,  ,  , 
1Physics and Astronomy Department, Vassar College

En este artículo

Resumen

Este estudio examina el efecto de la edad en la locomoción en C. elegans midiendo el exponente de Lyapunov (LLE) más grande. A medida que envejecen, C. elegans muestra un aumento y posterior disminución en el control motor. Los resultados muestran un pico de LLE a los cinco días, seguido de una disminución a medida que los gusanos envejecen.

Resumen

Este estudio investiga la influencia de la edad en la movilidad de Caenorhabditis elegans (C. elegans) mediante el empleo de difracción óptica dinámica (DOD) para estimar el exponente de Lyapunov más grande (LLE). El LLE, una métrica clave en los sistemas dinámicos, cuantifica la tasa de divergencia o convergencia de trayectorias en el espacio de fases, indicando la previsibilidad y el caos en la dinámica del sistema, en este caso, los comportamientos locomotores del gusano. La luz láser de 632 nm difracta el gusano nadador en una columna de agua, formando un patrón de difracción. Un fotodiodo detecta la luz en un solo punto dentro del patrón de difracción, capturando una serie de tiempo unidimensional a medida que el gusano ondula. Esta serie temporal sirve como una representación compuesta de todo el movimiento del gusano, encapsulando su dinámica de locomoción, ya que un punto en el patrón de difracción es una superposición de todos los puntos del gusano. Luego, la serie de tiempo se incrusta en un espacio de fase de mayor dimensión para calcular el LLE. C. elegans suele vivir alrededor de 14 días, siguiendo un patrón de aumento y disminución del control motor con la edad. Para aislar los efectos específicos de la edad, los gusanos se transfirieron a placas de agar frescas que contenían E. coli cada dos días, asegurando que tuvieran una edad adecuada (de 3 a 12 días de edad). El análisis de una cohorte de 13 C. elegans reveló que el LLE alcanzó su punto máximo a los cinco días después de la eclosión, a una tasa de 1,34 ± 0,03 1/s. Este pico significa un punto crítico en el desarrollo donde la locomoción de los gusanos muestra la mayor complejidad y comportamiento caótico. Los valores de LLE observados se alinean con la ecuación de Moore, un modelo bien establecido que describe los cambios relacionados con la edad en la actividad voluntaria, vinculando la disminución del control motor y los niveles de actividad con el aumento de la edad en C. elegans.

Introducción

La locomoción de Caenorhabditis elegans (C. elegans), un gusano microscópico, se ha estudiado para mejorar la comprensión del cableado de las neuronas motoras porque este nematodo es neurológicamente simple, con solo 302 neuronas1. C. elegans es un organismo modelo que se mantiene fácilmente con una vida útil de solo 14 días2. Solo alrededor de 72 neuronas de 302 en C. elegans se utilizan para la locomoción y se encuentran en todo el cuerpo adulto del nematodo1. El movimiento de baja dimensión (es decir, de lado a lado, hacia adelante y hacia atrás)3 de C. elegans los convierte en un espécimen fácil desde el cual rastrear rangos en LLE. Los sistemas nerviosos de los nematodos se comprenden en una medida increíble4.

El análisis de video ha ayudado a cuantificar la locomoción de C. elegans midiendo cantidades como el radio de curvatura, las frecuencias de ondulación y la longitud de onda5. Estas mediciones han establecido variables de control que permiten comparar las propiedades locomotoras en diferentes ambientes y bajo diversas condiciones 6,7. Esta información forma un modelo evolutivo de los circuitos que impulsan la locomoción de C. elegans8 e incluso permite la creación de simulaciones dinámicas virtuales y físicas de gusanos9.

La difracción óptica dinámica (DOD)10 también se ha utilizado para cuantificar la locomoción de C. elegans. Durante el DOD, la luz láser de baja intensidad se dobla alrededor del gusano vivo, formando un patrón de difracción de campo lejano conocido como patrón de difracción de Fraunhofer. La distribución de intensidad en el patrón vivo cambia a medida que el nematodo se mueve. Un punto en la difracción es una superposición de todos los puntos en el gusano, de modo que la intensidad dependiente del tiempo en el patrón de difracción forma una serie de tiempo unidimensional que contiene información sobre la dinámica locomotora11. Nos centramos en el exponente de Lyapunov más grande (LLE) de locomoción dependiente de la edad que calculamos a partir de la serie temporal unidimensional experimental. El LLE en diferentes etapas de desarrollo es comparable a otros estudios relacionados con la edad, mostrando que los circuitos neuronales se manifiestan en patrones locomotores que se pueden medir utilizando varias herramientas, como el análisis de video o DOD5.

DOD proporciona una serie temporal sensible en múltiples escalas, ya que el patrón de interferencia puede resolver la locomoción a una fracción de la longitud de onda utilizada al mismo tiempo que tiene en cuenta los cambios a gran escala en la plasticidad (forma) de la especie. Esta característica es particularmente útil cuando un sistema es sensible a las condiciones iniciales, como en los sistemas caóticos donde pequeños cambios conducen a cambios exponenciales en la trayectoria, también conocido como efecto mariposa12. Por esta razón, es crucial capturar las series temporales a una velocidad que permita el registro de pequeños cambios, ya que estos cambios pueden dar lugar a cambios significativos a medida que el sistema evoluciona. Un fotodiodo (PD) puede capturar la serie temporal más rápido que muchas cámaras de alta velocidad caras. La combinación de la sensibilidad espacial en el patrón de difracción y una alta tasa de acumulación de datos puede capturar la esencia de un sistema caótico 13,14.

El LLE describe la divergencia exponencial de las trayectorias del espacio de fase. El espacio de fase contiene todos los estados posibles de un sistema, descritos por sus variables de estado (o coordenadas) y sus derivadas asociadas (o momentos)15. Diferentes trayectorias describen la evolución del sistema para diferentes condiciones iniciales. En un sistema caótico, dos trayectorias cercanas divergirán exponencialmente con el tiempo, y esa divergencia se cuantifica mediante un LLE positivo. En los sistemas físicos, esta divergencia se manifiesta como la propagación de la incertidumbre en las condiciones iniciales del sistema, y también como la incapacidad de predecir de manera confiable el estado del sistema después de algún tiempo, como lo da el LLE14.

En los sistemas experimentales, las variables de estado a menudo se desconocen; sin embargo, la topología del espacio de fase se puede reconstruir a partir de una sola variable medida utilizando el teorema de incrustación de Takens16 construyendo sus versiones retardadas en el tiempo (equivalentes a derivadas de tiempo). Cada versión retrasada se representa en un eje; Juntos, los retrasos de tiempo forman un gráfico de retraso, que es topológicamente idéntico a un gráfico de fase si la serie temporal es infinitamente larga. Las series temporales experimentales tienen una longitud limitada y, por lo tanto, solo pueden representar LLE estimadas que están limitadas por incertidumbres experimentales.

La locomoción de C. elegans lleva un LLE10 positivo, un indicador de caos. Un organismo joven sufre cambios locomotores a los17 años. Un LLE más grande indica una menor previsibilidad en comparación con un LLE más pequeño. El LLE proporciona un método confiable para cuantificar los patrones locomotores de un organismo 10,13,14. Las características locomotoras de los nematodos están relacionadas con las neuronas dentro de los nematodos18. Según Cohen et al.19, la locomoción de los nematodos depende de las neuronas motoras, lo que sugiere que el estudio de la complejidad en la locomoción del nematodo también está relacionado con sus circuitos neuronales.

Se calibra el LLE en función de la edad para minimizar las incertidumbres para estudios futuros. Estudios anteriores promediaron el LLE en nematodos de tres a seis días de edad13. Este estudio monitoreó cuidadosamente las edades de los nematodos para facilitar un análisis riguroso de las disminuciones asociadas con el envejecimiento. Además, se han investigado cambios en la locomoción para identificar otras alteraciones biológicas en C. elegans18. La ecuación de Moore rastrea los parámetros de edad relacionados con la locomoción20. Aquí, usamos una versión modificada de la ecuación de Moore que permite flexibilidad en el momento en que el mecanismo locomotor está en su lugar para ser evaluado, introducido como un marcador temporal T:

figure-introduction-1, (1)

donde P(t) representa el rendimiento, t es el tiempo, a y c representan los parámetros de escala, mientras que b y d son los tiempos característicos del crecimiento y la disminución exponenciales, respectivamente. Se ha demostrado que la ecuación de Moore predice las trayectorias de cantidades aparentemente no relacionadas, como la velocidad y la actividad voluntaria, a medida que los organismos envejecen. Las especies se pueden caracterizar por la forma de la curva especificada por la ecuación de Moore; es decir, algunas especies pueden alcanzar su punto máximo antes que otras21.

Protocolo

1. Preparación de C. elegans para la adquisición de datos

  1. Coloque 0,5 ml de E. coli con OD600 en cada placa de agar Nematodo Growth Medium (NGM) para que los nematodos coman. Espere a que la E. coli se seque en cada plato de agar.
  2. Adquiera una placa de control de C. elegans de cualquier proveedor de materiales biológicos para fabricar nuevas placas de C. elegans con el fin de controlar la edad.
  3. Esterilice un pico de platino con una llama de un mechero Bunsen o equivalente. Use un microscopio de disección para elegir de 5 a 10 C. elegans adultos de tipo salvaje para colocar en cada plato.
  4. Deje que los nematodos pongan huevos durante 4-5 h antes de recoger a los adultos del plato. Incube los nematodos restantes y déjelos recogerlos el día deseado.
  5. El día de la recopilación de datos, llene una cubeta de cuarzo de grado óptico de 4,5 ml con dimensiones de 10 mm x 10 mm x 45 mm con agua destilada a temperatura ambiente justo debajo de la parte superior de la cubeta para evitar cualquier derrame cuando se agrega una tapa de plástico. Elija 2-3 nematodos y colóquelos suavemente en la cubeta. Una vez que los nematodos estén en la cubeta, colóquela de lado para alinear fácilmente el gusano en el rayo láser. El C. elegans puede flotar hacia el fondo, pero continuará con ondulaciones de natación siempre que esté completamente sumergido en el agua5.

2. Recopilación de datos

NOTA: El procedimiento a continuación para registrar las series de tiempo debe implementarse aproximadamente a la misma hora todos los días para minimizar las incertidumbres en la edad.

  1. Configure el experimento descrito en el artículoanterior 22. Implemente una pequeña modificación de construir un periscopio con dos espejos y colocar la cubeta de lado entre los dos espejos para que sea más fácil centrar el gusano en el rayo láser más adelante. En lugar de la cámara, coloque un PD en el patrón de difracción (Figura 1).
    1. Alinee los espejos verticalmente para construir el periscopio mencionado anteriormente.
      NOTA: Este es el único trabajo de alineación láser que debe completarse.
  2. Encienda el láser HeNe (Helium Neon) y deje que se caliente para alcanzar el equilibrio térmico (~ 15 min).
  3. Inicie el osciloscopio digital para comenzar la recopilación de datos. Ajuste los parámetros del intervalo de tiempo y el búfer de memoria en el osciloscopio digital. Establezca el intervalo de tiempo en 100 s e implemente un búfer de memoria de al menos 100 kilomuestras por segundo (kS).
  4. Establezca la resolución en 1 kHz para la velocidad de adquisición de datos y 12 bits para resolver las amplitudes, lo que ayuda a distinguir la complejidad a pequeñas escalas23.
  5. Configure el osciloscopio para centrar las oscilaciones de intensidad utilizando el desplazamiento automático de CA para centrar la serie temporal en cero voltios.
  6. Elija 2-3 nematodos y colóquelos suavemente en una cubeta llena de agua destilada para que sea más fácil encontrar y centrar al menos 1 gusano en el rayo láser. No agite la cubeta.
  7. Coloque la cubeta que contiene 2-3 nematodos en el periscopio y centre 1 nematodo en el rayo láser.
    1. Cuando el C. elegans está centrado en el rayo láser, se formará un patrón de difracción de campo lejano a unos 50 cm del periscopio.
  8. Coloque el fotodiodo en el patrón de difracción de campo lejano cuando un C. elegans atraviese el rayo láser. Asegúrese de que el DP esté colocado descentrado en el patrón de difracción para capturar la luz difractada en lugar del máximo central (rayo láser transmitido).
  9. Recopilar al menos 10 s de datos para calcular el LLE de manera confiable; es decir, se requieren al menos 10,000 puntos de datos para calcular un LLE estable.
    NOTA: Menos puntos de datos dan como resultado un LLE que fluctúa artificialmente.
  10. Repita la recopilación de datos anterior para cada día de 9 a 15 veces. Recopile datos para edades de 3 a 12 días a la misma hora del día.

3. Análisis de datos

NOTA: Para el análisis de datos, la serie temporal se incrusta en el espacio de fase utilizando un gráfico de retraso16 y luego se estima el LLE calculando la divergencia de las trayectorias.

  1. Elija secciones de la serie temporal en las que el nematodo nade libremente dentro del rayo láser examinando cuidadosamente la serie temporal. La Figura 2A muestra una serie temporal viable con una señal continua de al menos 20 s.
  2. Examine la serie temporal para una relación señal-ruido baja (Figura 2B). Establezca el nivel de ruido registrando una serie temporal sin el gusano en la cubeta. Las características de la serie temporal, no solo la amplitud, deben ser más del doble del nivel de ruido.
  3. Excluya cualquier dato saturado de la serie temporal relevante (Figura 2C). Si hay demasiados datos saturados para extraer información útil, regrese a la sección Recopilación de datos anterior, repita los pasos 2.7.1 a 2.9 y ajuste el nivel de intensidad alejando el fotodiodo del máximo central.
  4. Determinar la frecuencia media dada por
    figure-protocol-1(2)
    donde f es la frecuencia y P es el espectro de potencia (Figura 3). Esto se puede hacer computacionalmente usando una transformada rápida de Fourier (FFT) y luego promediando las frecuencias. Muchos programas computacionales tienen una función incorporada para calcular la frecuencia media de un conjunto de datos.
  5. Reconstruya la topología del espacio de fase utilizando un método de retardo de tiempo. Elija una serie temporal X y retrase la serie temporal en un retraso de tiempo τ para resolver las trayectorias (Figura 4). El retardo de tiempo óptimo se determina identificando el primer mínimo local en la información mutua (MI)24:
    figure-protocol-2(3)
    donde N es el número de puntos, Xi es un punto en la serie temporal X, mientras que Xi+τ es un punto retardado en el tiempo en la misma serie temporal. p(Xi) es la probabilidad de que ocurra el punto Xi, y p(Xi+τ) es la probabilidad de que ocurra Xi+τ. p(Xi, Xi+τ) es la probabilidad conjunta25 de la serie temporal Xi y de la serie temporal rezagada Xi+τ coincidentes.
  6. Identifique el primer mínimo en el gráfico de MI entre 0.140 y 0.240 s (140 y 240 puntos de datos), como se muestra en la Figura 5. No hay un número exacto para el retraso; El propósito principal es resolver las trayectorias de fase lo suficiente como para determinar la divergencia.
  7. Utilice la serie temporal Xi y sus versiones retrasadas por τ, según se determine minimizando el MI en el paso anterior.
  8. Determine la dimensión de incrustación. La dimensión de incrustación más adecuada es la dimensión más baja para la cual los falsos vecinos más cercanos (FNN) se estabilizan en un mínimo (Figura 6)26. Utilice el método desarrollado por Abarbanel et al.27,28.
  9. Utilice el algoritmo de Rosenstein29 para reconstruir el sistema dinámico en un espacio de fase y rastrear la divergencia de las trayectorias cercanas a lo largo del tiempo. En particular, utilice la rutina de MATLAB de Merve Kizilkaya, tal como se publicó en el foro30 de MATLAB, para calcular el LLE. Esta rutina requiere la siguiente entrada: la serie temporal, la frecuencia media del atractor, el retraso de tiempo τ, la velocidad de adquisición de datos para la serie temporal y el intervalo para ajustar la divergencia.
  10. Repita el procedimiento anterior para 9-15 conjuntos de datos para reducir la incertidumbre de las estimaciones de LLE. Promedie los LLE para cada día y luego ajuste la curva de Moore (Figura 7).

Resultados

Al medir el LLE frente a la edad, también medimos otras cantidades a menudo asociadas con sistemas dinámicos complejos, como la frecuencia del atractor, MI y FNN. Recopilamos datos del estudio de edad de los días 3 a 12. Los gusanos son demasiado pequeños e inmaduros antes de los 3 días de edad para manipularlos manualmente. A los 12 días, los gusanos están envejecidos y apenas se mueven ya que sus circuitos neuronales se deterioran y su sistema nervioso disminuye31.

El algoritmo de Rosenstein selecciona un punto vecino en un intervalo de al menos un período medio para cada punto de la trayectoria incrustada. Comenzando con el vector de separación entre los dos puntos en las dos trayectorias vecinas (Figura 8), el algoritmo rastrea la evolución de la divergencia. La separación de las trayectorias inicialmente aumenta exponencialmente debido a la naturaleza caótica del sistema32, y luego se estabiliza ya que la trayectoria está acotada. Trazar el logaritmo de la divergencia promedio a lo largo del tiempo rastrea la separación de las trayectorias (Figura 8 y Figura 9). La pendiente de los mínimos cuadrados lineales que se ajustan a la primera parte de la curva antes de que se aplane da como resultado una estimación confiable para el LLE33 del sistema. Tenga en cuenta que la incertidumbre está involucrada en la elección del rango para el ajuste de mínimos cuadrados y el ajuste en sí. La sensibilidad a las condiciones iniciales hace que la región de ajuste lineal muestre un comportamiento oscilatorio a medida que se realiza un seguimiento de la divergencia en el atractor. La variación biológica entre los gusanos, que se promediaron para cada grupo de edad, supera la variabilidad en el ajuste lineal de LLE para un solo ensayo, como se muestra en una publicación anterior10.

La serie de tiempo (Figura 2A) muestra que los picos y valles coinciden con los aspectos de la locomoción del gusano, como los cambios en la frecuencia de natación, la forma y la orientación. La serie temporal es aperiódica; Las oscilaciones en las series de tiempo nunca se repiten, pero permanecen limitadas en intensidad. La frecuencia es constante mientras fluctúa ligeramente, lo que indica complejidad y limitación en la frecuencia. La Figura 10 muestra una tendencia decreciente en las frecuencias de natación a medida que el gusano envejece, que se desglosa en el día 12. La frecuencia media salta después del día 12 para la mayoría de los gusanos. Es probable que esto sea una indicación de que el circuito neuronal se está rompiendo. Por el contrario, el rezago promedio τ, determinado por el primer mínimo del IM, aumenta a medida que la población envejece, ya que el ciclo se alarga (Figura 11).

En nuestro caso, el IM representa la superposición estadística entre dos series temporales rezagadas. Si el IM es mínimo, entonces hay una superposición mínima entre las trayectorias. Teóricamente, las trayectorias caóticas nunca se superponen; sin embargo, en la práctica, con dígitos significativos limitados y algo de ruido experimental, algunos puntos se superpondrán dentro de cierta tolerancia24. Nuestro objetivo es minimizar la posibilidad de superposición minimizando el IM. La diferencia entre un IM minimizado y un IM significativamente mayor se ilustra en la Figura 4.

La dimensión de incrustación está determinada por los falsos vecinos más cercanos (FNN). El número de FNN se aplana con un 5% o menos de FNN alrededor de las dimensiones de incrustación 3 o 4. En la Figura 6, la edad de los nematodos no afecta la dimensión de incrustación, excepto en el día 12, cuando el gusano está casi al final de su vida útil.

La trayectoria del LLE sigue la curva de Moore (Figura 7) con un pico a los 5 días, lo que indica que la locomoción más impredecible (y posiblemente compleja) ocurre cuando los C. elegans están recién maduros. En la Figura 7, un gráfico de LLE de los días 3 a 12 muestra un aumento lineal con un pico a los 5 días, seguido de una disminución después del día 5. Las barras de error de la Figura 10 representan la desviación estándar de la media 4,34 y reflejan varios factores, incluida la diversidad dentro de las especies biológicas y la estimación de LLE. La variación entre los gusanos tiende a superar las incertidumbres en la rutina de ajuste de LLE. La variabilidad entre días, como los días 5 y 7, no se superpone, por lo que los datos se distinguen claramente. La tendencia de los LLE con la edad coincide estrechamente con una ecuación de Moore de un estudio anterior18, que describe los efectos de la edad sobre la memoria y la locomoción en otros organismos vivos.

Los LLE en la Tabla 1 son consistentes, mostrando una tendencia lentamente creciente y luego decreciente con la edad. Los valores son consistentes con los resultados publicados anteriormente utilizando DOD10 y análisis de video34,35.

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Figura 1: Configuración experimental de difracción de campo lejano (no dibujada a escala). Los espejos de dirección forman un periscopio. La cubeta que contiene el C. elegans se coloca entre los espejos de dirección. El rayo láser es difractado por el tornillo sin fin y viaja hacia el PD a través del segundo espejo de dirección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Series temporales de intensidad. La serie de tiempo del DOD muestra fluctuaciones de intensidad a medida que el nematodo se mueve en el rayo láser con (A) una serie de tiempo viable para el análisis de datos. (B) Esta serie temporal indica que el intervalo entre 11 y 30 s no muestra ninguna señal; simplemente muestra el nivel de ruido del sistema, ya que las amplitudes constantes más cortas se originan principalmente en la luz dispersa. (C) Esta serie temporal tiene algunos casos de datos saturados. Cada punto de datos representa un pico significativo en el gráfico que se corta y aplana en los picos y valles. En este ejemplo, los picos se aplanan a medida que la intensidad oscila entre -100 y 100 UA entre 45 y 50 s. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Espectro de potencia. El espectro de potencia muestra un máximo de alrededor de 0,95 Hz. Las frecuencias se distribuyen ya que la frecuencia en las trayectorias del atractor cambia y nunca se repite exactamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Datos experimentales incrustados en gráficos de retraso 3D con dos retrasos diferentes de la misma serie temporal de un gusano de 9 días. Esta serie temporal muestra que la locomoción es un atractor limitado consistente con la teoría del caos. (A) La trayectoria se resuelve utilizando el primer mínimo local (MI ≈ 2,11), lo que da un retraso de alrededor de 0,183 s (183 puntos de datos). Los cruces de trayectoria visibles son el resultado de una proyección en un espacio bidimensional. (B) Este gráfico de retraso permanece sin resolver por un retraso inapropiado de 0.002 s (2 puntos de datos, (MI > 7)) ya que los puntos están demasiado juntos para ser distinguibles y no muestran divergencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: La disminución exponencial de la información mutua. El primer mínimo en el MI determina el retraso del conjunto de datos a 0,161 s (161 puntos de datos) en este caso específico para resolver la trayectoria de fase. Este retraso desplaza el valor de la serie temporal para reconstruir el atractor en el espacio de fase. El retraso solo necesita estar cerca del primer mínimo, lo suficiente para resolver las trayectorias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Las dimensiones de incrustación promedio en los días 3, 5, 9 y 12, respectivamente. Se utiliza una vista ampliada de la dimensión de incrustación para mostrar la diferencia específica entre las dimensiones de incrustación de cada día. Solo el día 12 muestra una diferencia notable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: El promedio de los LLE estimados entre los días 3 y 12. El LLE alcanza su punto máximo a los 5 días. Durante un máximo de 5 días, los nematodos exhiben una trayectoria de crecimiento consistente con la transición de la inmadurez a la madurez. Después de esos 5 días, los nematodos experimentan una disminución en la divergencia. Las incertidumbres son medidas de la desviación estándar de la media, que está dominada por las variaciones entre gusanos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 8: Representación de la divergencia presente en la teoría del caos. Un LLE positivo hará que las trayectorias inicialmente cercanas diverjan con el tiempo. t es un intervalo de tiempo, d es la divergencia y x(t) es un punto en el espacio de fase. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 9: Divergencia de la trayectoria de fase en una escala logarítmica. El LLE estimado es la pendiente del ajuste lineal (1.08 1/s) en la región ascendente antes de aplanarse debido a la acotación del atractor entre 0.96 y 1.01 s. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 10: La frecuencia media media de cada día. El promedio del día 12 denota un cambio significativo en las señales neurológicas que impulsan la locomoción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 11: El retraso promedio de cada día. El IM conduce en promedio a retrasos más bajos entre los días 3 y 6, mientras que aparece un retraso promedio más alto entre los días 7 y 12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Edad (días)Número de conjuntos de datosLLE (1/s)Desviación estándar de la media (1/s)
3111.140.02
4151.200.03
5131.340.03
6111.230.02
7101.160.03
8121.130.02
9121.070.02
1091.000.03
1190.960.03
1290.920.02

Tabla 1: El número de conjuntos de datos y el promedio de LLE para cada día del estudio de edad. Los LLE son consistentes con los datos anteriores recopilados a través del DOD y muestran la trayectoria creciente y luego decreciente de la curva de Moore de la Figura 7. Se recopilaron de 9 a 15 conjuntos de datos por cada día de datos. Los conjuntos de datos tendieron a la baja a medida que los gusanos envejecían debido a la naturaleza de su degradación muscular y deterioro neuronal, lo que provocó una disminución de la locomoción.

Discusión

Clasificamos la locomoción de C. elegans evaluando el LLE en diferentes edades, respaldado por parámetros como la frecuencia de natación, la información mutua (MI) y los falsos vecinos más cercanos (FNN), cada uno de los cuales ofrece información adicional sobre las propiedades dinámicas del sistema. Las propiedades deterministas y no lineales de este sistema se estudian utilizando métodos de datos sustitutos y gráficos de recurrencia36.

El uso de DOD para cuantificar los efectos del envejecimiento en la locomoción es una técnica complementaria a la microscopía tradicional. No es un sustituto de la inspección visual de las especies microscópicas; Proporciona una forma consistente y eficiente de cuantificar la locomoción más allá de las técnicas tradicionales. Dado que el DOD omite el análisis de video, una parte de la carga de trabajo computacional es inherentemente administrada por la técnica óptica, ya que la difracción mapea directamente la distribución de intensidad en el espacio de Fourier. La superposición del campo óptico durante la difracción rastrea todas las especies microscópicas. Idealmente, la resolución se rige por la longitud de onda λ de la luz utilizada, en este caso, 632 nm. Incluso un cambio de una fracción de la longitud de onda dará como resultado un cambio en la intensidad. Por esta razón, la resolución se rige por el alcance y la resolución del fotodetector, así como por la potencia del láser. Por ejemplo, si el detector detecta una señal de serie temporal que fluctúa entre dos voltajes, Vmin y Vmax, y la resolución es n bits (consulte el paso 2.4 del Protocolo), entonces la resolución máxima es λ / n, o en nuestro caso, 632 nm / 12. En teoría, este método se puede aplicar a cualquier cuerpo que cambie de forma; sin embargo, el DOD es particularmente adecuado para especies microscópicas, ya que los láseres económicos con las longitudes de onda adecuadas están fácilmente disponibles y son rentables.

Para garantizar un patrón de difracción claro y consistente, el gusano debe rastrearse cuidadosamente y mantenerse centrado dentro del rayo láser mientras nada. Si el gusano se desalinea, la señal puede degradarse o perderse por completo. Para mitigar los problemas de saturación del fotodiodo y reducir el ruido estocástico, se utiliza un filtro de densidad neutra para atenuar la intensidad del láser. Este filtrado ayuda a mantener el rango dinámico del fotodiodo y evita la sobresaturación en las series temporales registradas. No obstante, cualquier segmento de los datos que presente una saturación excesiva o una relación señal/ruido baja se excluye del análisis final para mantener la calidad de los datos.

Una deriva en la frecuencia de natación produce un espectro de frecuencia continuo, un marcador temprano establecido de caos13. La relación inversa entre la frecuencia media y el IM sugiere que aproximadamente 1/8 de un ciclo resuelve la trayectoria con suficiente precisión para estimar el LLE, similar a la resolución requerida para analizar una forma de onda sinusoidal.

El bajo porcentaje de FNN alrededor de las dimensiones de incrustación 3 y 4 en la Figura 6 implica bajos niveles de ruido tanto en la locomoción de C. elegans como en el sistema óptico. Sin embargo, en gusanos de 12 días de edad, el porcentaje de FNN aumenta ligeramente pero se mantiene muy por debajo del 5%, no necesariamente debido a un aumento en la verdadera dimensión de incrustación, sino probablemente debido al aumento del ruido en la señal locomotora, atribuido a la degradación neuronal en organismos envejecidos34,37.

Los cambios en el LLE a lo largo del desarrollo muestran que el grado de caos en la locomoción varía con la edad, coincidiendo estrechamente con las predicciones de la ecuación de Moore. Un pico en el LLE temprano en la vida es consistente con las características de las especies seleccionadas R, como C. elegans, que deben desarrollar funcionalidad neuromuscular rápidamente en ausencia de cuidado parental. En particular, el 70% de las conexiones neuronales de largo alcance se forman cuando el gusano tiene solo el 20% de su tamaño adulto37,38. Por el contrario, las especies seleccionadas por K, como los humanos, exhiben un desarrollo neurológico más lento, respaldado por la inversión de los padres, lo que resulta en patrones motores retrasados pero más complejos. Estas diferencias se reflejan en el momento del pico de LLE entre especies.

El corto ciclo de vida de C. elegans, de aproximadamente 14 días, con un rápido desarrollo durante los dos primeros días en cuatro estadios larvarios2, lo hace especialmente adecuado para estudiar la complejidad máxima de la locomoción. Si bien los estudios anteriores se han centrado en el deterioro de la estructura neuronal para explicar los cambios en la locomoción relacionados con la edad34,39, nuestro trabajo conecta estos cambios físicos con la dinámica caótica subyacente del sistema. La integración de DOD con la dinámica no lineal permite una caracterización cuantitativa precisa en múltiples escalas de longitud, ofreciendo nuevos conocimientos sobre los impulsores neuronales del comportamiento. El LLE consistentemente positivo en todas las etapas de desarrollo apoya fuertemente la presencia de comportamiento caótico en el sistema locomotor.

Este estudio ofrece un marco metodológico novedoso para examinar los cambios de comportamiento relacionados con la edad en C. elegans, ampliando así la comprensión actual de los correlatos biológicos y dinámicos del deterioro motor. Además, valida el uso del LLE como un biomarcador sensible para los cambios neurológicos asociados con la edad y demuestra que el LLE es una medida cuantitativa confiable de la dinámica locomotora afectada por el envejecimiento.

El DOD es un método potente y no invasivo para cuantificar la locomoción y el caos en organismos microscópicos, que se considera mejor como un complemento del análisis de vídeo que como un sustituto. En su implementación actual, el experimento requiere que los nematodos tengan al menos tres días de edad, ya que los gusanos más jóvenes son demasiado pequeños para producir señales de difracción confiables. La serie temporal unidimensional extraída de un solo punto en el patrón de difracción necesariamente comprime la información espacial, lo que puede oscurecer la dinámica localizada a lo largo del cuerpo del organismo. Los enfoques multicanal ayudan a abordar esta limitación al verificar la consistencia de los parámetros en todo el campo de difracción, aunque aún se pueden pasar por alto las heterogeneidades espaciales sutiles. La estimación precisa del LLE depende además de obtener series temporales suficientemente largas y sin ruido; Los desafíos prácticos, como el movimiento del tornillo sin fin fuera del haz o las fluctuaciones ambientales, pueden comprometer la calidad de los datos y reducir la confianza en los valores de LLE. Al igual que con todos los métodos experimentales, el ruido de medición y las decisiones subjetivas durante el ajuste LLE introducen una incertidumbre adicional, que para mediciones individuales generalmente permanece dentro de aproximadamente el 15%.

El trabajo futuro se centrará en medir el LLE en diversas condiciones experimentales, lo que permitirá comparaciones entre LLE modelados y medidos. Esto facilitará el desarrollo de modelos neurológicos predictivos que podrían profundizar nuestra comprensión de cómo surge y se deteriora el control motor complejo con el tiempo. También continuaremos explorando la consistencia de nuestros hallazgos explorando otros métodos computacionales, como el cálculo del plano de Entropía-Complejidad para verificar nuevamente la naturaleza determinista de este sistema biológico40.

Divulgaciones

El autor no tiene nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Vassar College y al Fondo de Investigación del Salmón Lucy Maynard por su apoyo financiero. También agradecemos a la Dra. Kathleen Susman, al Dr. Juan Merlo y a la Dra. Susannah Zhang por brindar su visión y asistencia durante todas las etapas de esta investigación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
2 Espejos frontales de aluminioThorlabsPF10-03-F01
Láser HeNe de 632 nmNewportLGX1Cualquier láser de luz roja
Placa de Petri vacíaCarolina971632Placas de Petri de plástico en las que vertimos el agar de crecimiento del nematodo
Escherichia coli K12, huésped vivo de bacteriófagosCarolina124500Utilizado como fuente de alimento para la C. elegans; OD600
Microscopio Leica S9iLeica MicrosystemsLED2500Microscopio Disecador
EncendedorMecheros BicCualquier tipo de herramienta de esterilización utilizada para esterilizar el pico antes y después de recoger cada gusano
MATLABMathWorksRosenstein Algorithm-Routine en el foro MATLAB creado por Merve Kizilkaya
Agar de crecimiento de nematodosCarolina173520Botella de medio preparado, 135 mL
FotodiodoThorlabsDET36ADetector polarizado de Si de 350-1100 nm
Picoscope5204Tecnología PicoPP376Osciloscopio de PC www.picotech.com
Platinum PickSe usaba para recoger C. elegans; Es una pequeña púa hecha a mano con una pieza de cristal portátil y una cuchara de platino;
Cuvette de cuarzoCélulas de Starna21/G/5Lleno de agua destilada para colocar C. elegans en su interior

Referencias

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Dinámica de la locomoción dependiente de la edad en Caenorhabditis elegans: un análisis de exponentes de Lyapunov
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