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Artículo de método

Imágenes de calcio in vivo y ex vivo de una neurona del circuito olfativo en la larva de Drosophila melanogaster de tercer estadio

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DOI:

10.3791/68956

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31 de octubre de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Nevada, Reno, 2Integrative Neuroscience Program, University of Nevada, Reno, 3Molecular Biosciences Program, University of Nevada, Reno, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada, Reno

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Presentamos protocolos de imágenes de calcio para una neurona olfativa larvaria de Drosophila , utilizando un adhesivo tisular tópico para la inmovilización. Este método mejora la estabilidad, facilitando experimentos confiables in vivo y ex vivo . Los scripts R personalizados analizan las señales de calcio, proporcionando una plataforma eficiente para la investigación neurofisiológica detallada.

Resumen

Las imágenes de calcio son cruciales para estudiar la dinámica neuronal y la función cerebral. Sin embargo, los métodos actuales para obtener imágenes de calcio en larvas de Drosophila son un desafío debido a los artefactos de movimiento y las necesidades de equipos especializados. Aquí, presentamos un método práctico y de bajo costo para realizar imágenes de calcio in vivo y ex vivo en larvas de Drosophila de tercer estadio, utilizando un adhesivo tisular tópico para inmovilizar muestras. También proporcionamos scripts R personalizados y un marco para el análisis de datos, lo que facilita las mediciones de los cambios de calcio en diferentes condiciones experimentales. Usando este enfoque, registramos con éxito transitorios de calcio en un par de neuronas larvarias del SNC con artefactos de movimiento mínimo, demostrando la reproducibilidad en todas las preparaciones. El método es compatible con los sistemas confocales de disco giratorio estándar y se puede adaptar para configuraciones de dos fotones comerciales o de bricolaje, lo que lo hace accesible a laboratorios con diferentes recursos. Este enfoque puede aumentar la accesibilidad a los estudios de imágenes de calcio larvario y se puede adaptar para examinar los efectos tanto de estímulos externos, como olores, como estímulos internos, como neuromoduladores.

Introducción

Comprender la dinámica del calcio en las neuronas es crucial para desentrañar los complejos mecanismos subyacentes a la señalización neuronal y la función cerebral, ya que los iones de calcio juegan un papel fundamental en la modulación de la actividad neuronal y en el impulso de las respuestas celulares a los estímulos. La dinámica neuronal del calcio se puede monitorear a través de imágenes de calcio, que brindan información en tiempo real sobre la señalización mediada por calcio en una amplia gama de organismos, incluida la larva de Drosophila. La larva de Drosophila está emergiendo como un poderoso sistema modelo para estudiar la función del circuito subyacente al comportamiento. Es uno de los tres únicos organismos para los que se ha generado un conectoma cerebral completo de resolución sináptica1. La larva es susceptible a una variedad de herramientas sofisticadas que permiten obtener imágenes y manipular neuronas tanto a nivel de todo el cerebro como de una sola neurona 2,3.

La capacidad de medir la dinámica del calcio en las neuronas de las larvas de Drosophila a través de imágenes de calcio ha sido crucial para avanzar en la investigación en neurociencia4. Los avances recientes en las imágenes de calcio han permitido medir la dinámica del calcio a nivel de sinapsis individuales en la larva5 hasta registros multineuronales en larvas de movimiento libre6. Las imágenes de calcio se pueden realizar in vivo, donde los eventos de calcio se capturan en contextos fisiológicos naturales de toda la larva 4,7,8,9, o ex vivo, donde los eventos de calcio se registran en tejidos larvarios disecados conservados en condiciones fisiológicas simuladas10. En general, los investigadores han utilizado varias iteraciones del método de imágenes de calcio en larvas de Drosophila para descubrir mecanismos fundamentales de circuitos neuronales, sensaciones, aprendizaje y memoria, y comportamiento 8,11,12,13,14,15,16,17. Sin embargo, los estudios de imágenes de calcio larvario son limitados debido a la necesidad de equipos especializados y problemas en la interpretación de datos debido a artefactos de movimiento.

Aquí, presentamos una metodología rentable y fácilmente implementable para imágenes de calcio in vivo y ex vivo en larvas de Drosophila melanogaster de tercer estadio. Tomamos imágenes de la dinámica del calcio en Keystone-LN, una neurona del circuito olfativo inhibidor18,19, dentro de preparaciones larvarias completas para mostrar imágenes de calcio in vivo, y en cerebros larvales disecados para mostrar imágenes de calcio ex vivo. Las larvas enteras y los cerebros disecados permanecen viables y receptivos durante aproximadamente 10-15 minutos en nuestras condiciones de imagen, lo que permite la adquisición de múltiples ensayos de estímulo por muestra. Para abordar el desafío de inmovilizar larvas enteras o muestras de tejido mientras mantenemos la viabilidad del tejido y reducimos la variabilidad experimental, optimizamos el uso de GLUture, un adhesivo tisular tópico de cianoacrilato biocompatible.

En comparación con los métodos tradicionales de inmovilización larvaria, como la inclusión o fijación de agarosa, este enfoque basado en adhesivos reduce los artefactos de movimiento al tiempo que preserva la viabilidad del tejido20,21; En relación con los sistemas de imágenes de dos fotones, la configuración de disco giratorio reduce los costos de instrumentación y mejora la accesibilidad para laboratorios con recursos limitados. Finalmente, describimos enfoques de imágenes sencillos, junto con scripts R desarrollados a medida para análisis de datos. Nuestro enfoque puede aumentar la accesibilidad a los estudios de imágenes de calcio larvario y puede adaptarse para examinar los efectos tanto de estímulos externos, como olores, como estímulos internos, como neuromoduladores.

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Protocolo

1. Preparación de larvas de Drosophila de tercer estadio para imágenes de calcio

  1. Mantenga las moscas con alimento estándar para moscas (ver Tabla de materiales) a 25 °C, con 50-60% de humedad relativa (HR) y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h.
  2. Para expresar la proteína fluorescente roja (RFP) para la identificación de neuronas y GCaMP6f (indicador de calcio) en la(s) neurona(s) de interés ('X'), cruce hembras vírgenes de la línea X-Gal4 con machos portadores de UAS-GCaMP6f y UAS-tdTomato22.
    NOTA: Para este estudio, se utilizó la línea Keystone-Gal4 para impulsar la expresión de tdTomato y GCaMP6f en un solo par de neuronas locales inhibidoras (Keystone-LN) en el cerebro larvario 18,19.
  3. Después de permitir que las moscas macho y hembra se apareen y pongan huevos durante 48 h, transfiera los adultos a un vial nuevo.
  4. Extraiga las larvas de tercer estadio (aproximadamente 120 h después de la puesta de huevos) flotándolas sobre una solución de sacarosa al 15%. Utilice una micropipeta P1000 para transferir las larvas flotantes a un vaso de precipitados de vidrio de 1.000 ml.
  5. Lave las larvas 3-4 veces reemplazando el agua en el vaso de precipitados con 800 ml de agua destilada fresca cada vez. Deje que las larvas descansen durante 10 minutos antes de continuar con el resto del protocolo.

2. Protocolo de inanición para larvas de Drosophila de tercer estadio (si se prueban condiciones de hambre frente a no hambrientas)

  1. Prepare dos cámaras de alimentación colocando un pequeño cuadrado de toallita de laboratorio en placas de Petri de 6 cm. Para condiciones que no mueran de hambre, agregue 350 μL de solución de sacarosa 0.2 M; para condiciones de hambruna, agregue 350 μL de agua destilada.
  2. Transfiera un número igual de larvas lavadas a cada cámara de alimentación. Deje que las larvas se alimenten de sacarosa (no hambrienta) o agua destilada (hambrienta) durante 2 h a temperatura ambiente.

3. Imágenes de calcio in vivo

NOTA: Todos los experimentos que involucren el adhesivo tisular deben realizarse utilizando prácticas de seguridad estándar de laboratorio. Se requiere equipo de protección personal (EPP), incluidos guantes de nitrilo, bata de laboratorio y gafas de seguridad o un protector facial; Deben evitarse los guantes de algodón debido a reacciones exotérmicas con cianoacrilato. Evite el contacto del adhesivo con la piel, los ojos o las membranas mucosas. En caso de unión de la piel, remoje el área en agua tibia y jabón y separe suavemente; En caso de exposición ocular, enjuague con agua tibia durante ≥5 min y busque atención médica inmediata. El adhesivo debe mantenerse alejado de llamas abiertas y altas temperaturas, ya que el adhesivo curado puede liberar humos irritantes si se quema. Guarde el adhesivo a ≤30 °C, lejos de la humedad y la luz solar directa, en un recipiente herméticamente cerrado cuando no esté en uso.

  1. Prepare el tampón de imagen de calcio con la siguiente composición: NaCl 110 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 1,2 mM, MgCl2 0,8 mM, D-glucosa 10 mM y HEPES 10 mM. Almacenar a 4 °C cuando no esté en uso.
    NOTA: La solución salina modificada que contiene 110 mM de NaCl es una formulación ampliamente aceptada para la disección e imagen del SNC larvario y se encuentra dentro del rango típico utilizado en electrofisiología y estudios de imágenes (≈108-128 mM de NaCl)23,24,25,26.
  2. En un cubreobjetos de microscopio de 24 x 50 mm (1,5 mm de grosor), cree un pocillo con vaselina dispensada de una jeringa.
  3. Coloque una pequeña gota de adhesivo tisular tópico (60% de 2-octilo y 40% de cianoacrilato de n-butilo) en el centro de la cubierta de vidrio. Extienda el adhesivo uniformemente en una capa delgada y uniforme con una varilla de vidrio.
  4. Transfiera con cuidado una sola larva sobre el adhesivo con un cepillo o un alambre delgado. Presione suavemente el lado ventral de la larva sobre el adhesivo. Deje que el adhesivo se seque, asegurándose de que la larva esté completamente inmovilizada.
  5. Una vez que la larva esté inmovilizada, coloque el cubreobjetos en la platina de microscopio invertida (Figura 1A).

4. Imágenes de calcio ex vivo

  1. Prepare el tampón de disección larvaria con la siguiente composición: NaCl 110 mM, KCl 5,4 mM, CaCl2 0,3 mM, MgCl2 0,8 mM, D-glucosa 10 mM y HEPES 10 mM. Almacenar a 4 °C cuando no esté en uso.
  2. Diseccionar las disecciones cerebrales descritas por Ishimoto y Sano10. Brevemente, con un cepillo o alambre delgado, transfiera una sola larva a una placa de Petri de 3,5 cm con elastómero de silicona en capas en la parte inferior.
  3. Bajo un microscopio de disección, coloque la larva con su lado ventral hacia arriba y localice el cerebro. Con unas tijeras de disección, haga un corte de aproximadamente un tercio del extremo anterior de la larva. Haz otro corte en los ganchos de la boca. Preservar el cerebro mientras se quitan los ganchos del cuerpo y la boca (adaptado de Janelia Flylight Protocol27).
  4. Identificar el grupo de nervios que contienen neuronas motoras del cordón ventral. Con fórceps, separe suavemente el cerebro del resto de la larva disecada. Recorta cualquier exceso de tejido del cerebro.
    NOTA: Manejar suavemente la fuerza excesiva puede causar daño tisular ya que el cerebro es frágil.
  5. Prepare un cubreobjetos de microscopio con el adhesivo tisular para obtener imágenes de calcio como se describe en los pasos 3.2 a 3.3.
  6. Con una micropipeta P10, aspire cuidadosamente el cerebro diseccionado con 5 μL de solución de disección de la placa de Petri. Expulse lentamente el cerebro sobre el adhesivo. Antes de que el adhesivo se seque, oriente el cerebro en una posición dorsal hacia arriba (con los dos lóbulos cerebrales hacia abajo y el cordón ventral dorsal hacia arriba).
  7. Con una micropipeta P200, transfiera 100 μl del tampón de imágenes de calcio sobre el cerebro larvario inmovilizado en el cubreobjetos.
  8. Coloque el cubreobjetos con el cerebro en el microscopio invertido, conectado a un módulo de escáner confocal de disco giratorio y una cámara CCD para obtener imágenes de calcio (Figura 1B).
    NOTA: Para preparaciones ex vivo , asegúrese de orientar el cerebro correctamente mientras el pegamento aún está húmedo. Para una calidad de imagen óptima, coloque el cerebro de manera que el ROI esté más cerca del objetivo del microscopio y evite aplicar exceso de pegamento cerca del ROI.

5. Protocolo de imagen

  1. Abra el software para obtener imágenes de calcio con el microscopio confocal. Capture imágenes utilizando un objetivo de 10x/1,4 NA con cambio de filtro entre láser GFP (excitación 488 nm, intensidad 70%, emisión 525 nm/50 m, OD8) y láser RFP (excitación 561 nm, intensidad 50%, emisión 610 nm/75 m, OD8). Establezca la exposición entre 100 ms y 1.000 ms, la ganancia al 50% del valor de exposición correspondiente y un factor de agrupación de 2 durante la captura de la imagen.
  2. Ajuste el microscopio a un aumento de 10x y ubique el cerebro bajo iluminación de campo claro.
  3. Identifique la neurona de interés buscando la señal tdTomato con el láser RFP (excitación establecida en 561 nm).
    NOTA: Seleccione saturación y reduzca gamma para establecer el valor de exposición correcto.
  4. Una vez identificada la región de interés (ROI), cambie al láser GFP (excitación establecida en 488 nm) para capturar señales GCaMP6f. Asegúrese de que las señales tdTomato y GCaMP se colocalicen antes de capturar imágenes de pila de ambos canales.
    NOTA: Ajuste la configuración de imagen para las grabaciones de pila tdTomato y GCaMP6f para maximizar la fluorescencia.
  5. Capture dos grabaciones de series temporales separadas de señales tdTomato y GCaMP6f simultáneamente a una velocidad de 0,5 fotogramas/s (durante un total de 2 min).
    NOTA: El cerebro larvario diseccionado permanece viable durante aproximadamente 10 min en estas condiciones de amortiguación; Después de este tiempo, las señales se degradarán.
  6. Una vez que la muestra esté lista para la imagen, capture dos grabaciones de series temporales separadas de señales tdTomato y GCaMP6f simultáneamente a una velocidad de 0,5 fotogramas/s (durante un total de 2 min).
    NOTA: El cerebro larvario diseccionado permanece viable durante aproximadamente 10 min en estas condiciones de amortiguación; Después de este tiempo, las señales se degradarán.
    NOTA: Al realizar un análisis cuantitativo, recomendamos aumentar la potencia del láser y ajustar la ganancia de exposición del detector según sea necesario mientras se mantiene la escala de intensidad lineal.

6. Tratamiento y análisis de datos

  1. Abra e importe las pilas de señales tdTomato y GCaMP6f en ImageJ (NIH)28.
  2. Para identificar la región de interés (ROI) correcta, combine las señales tdTomato y GCaMP6f para confirmar la colocalización. Después de la verificación, divida los canales tdTomato y GCaMP6f.
  3. En el menú superior, selecciona Plugins | Nuevo y haga clic en Macros para iniciar una nueva macro. A continuación, importe las macros personalizadas basadas en ROI a ImageJ. Seleccione la pila GCaMP6f y presione Ejecutar para el análisis de calcio.
  4. Procese las señales de fluorescencia utilizando una macro ImageJ personalizada (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging). La macro primero genera proyecciones de máxima intensidad, realiza la corrección de movimiento usando el complemento StackReg (modo de registro rígido )29 y aplica la corrección de decoloración.
  5. Aparecerá una ventana emergente de "Acción requerida" solicitando la selección manual del ROI, lo que permite a los usuarios obtener manualmente un ROI amplio. Haga clic en Aceptar para continuar con el análisis. Para llevar a cabo la corrección de movimiento, asegúrese de que el cuadro rectangular cubra todo el ROI en todos los fotogramas para una corrección de movimiento precisa mientras conserva la forma espacial local y de ROI en todos los fotogramas.
    NOTA: Las grabaciones se registraron en ImageJ usando StackReg. Cuando el movimiento en el plano era grande (desplazamiento XY acumulativo > 1 μM) o la deriva Z axial provocaba pérdida de enfoque, el registro se volvía poco fiable o la muestra se perdía por completo de la ventana de imagen. Por lo tanto, las muestras que mostraban una deriva extrema o señales de calcio en declive (>30%) se etiquetaron automáticamente y se excluyeron del análisis posterior para garantizar mediciones precisas de la actividad neuronal. Estos umbrales son consistentes con las prácticas de control de calidad comúnmente aplicadas en los estudios de imágenes de calcio 30,31,32,33. La exclusión también aseguró que solo se usaran registros estables con transitorios de calcio ligados a estímulos confiables para los análisis.
  6. Para el análisis, extraiga trazas de fluorescencia de ROI circulares definidas manualmente, guiadas por autocorrelación de píxeles; estos ROI abarcarán todo el campo de neuronas clave.
    1. Extraiga los datos de intensidad de fluorescencia sin procesar para dos fluoróforos: GCaMP6f/GFP y tdTomato/RFP, utilizando macros personalizadas en ImageJ (v1.54p) (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging, consulte la tabla de materiales).
    2. Aplique una ventana deslizante con un ROI de 20 x 20 píxeles y un tamaño de paso de 10 píxeles en todo el campo de visión. Para cada ROI, la macro calculará: (1) la intensidad en todos los fotogramas, (2) la diferencia de fluctuación de referencia (es decir, la diferencia entre los valores de intensidad máxima y mínima durante los primeros 10 fotogramas) y (3) el cambio máximo de intensidad de fotograma a fotograma (ΔF). Se eliminarán los ROI que muestren fluctuaciones de intensidad inferiores a 10 unidades, y solo se seleccionarán los valores de ΔF más nítidos para un análisis más detallado.
    3. Normalice los rastros de fluorescencia utilizando los siguientes métodos:
      1. Normalización de Fmax y Fmin: Calcule Δ normalizado usando la fórmula:
        figure-protocol-1
        Donde F es la fluorescencia sin procesar en cada punto de tiempo, Fmin es la fluorescencia mínima (línea de base) y Fmax es la fluorescencia máxima durante la grabación.
      2. Normalización ΔF/F 0: Además, realice la normalización ΔF/Fo, donde Fo (línea de base) está determinado por los primeros 10 fotogramas de cada grabación, utilizando la fórmula:
        figure-protocol-2
        Donde Ft es la fluorescencia en el tiempo t y F0 es el valor de referencia calculado a partir de los primeros 10 fotogramas.
  7. Después de extraer las señales GCaMP6f, haga clic con el botón izquierdo y seleccione todo, corte y pege para transferir todos los valores a una nueva hoja de cálculo de Excel. En la barra de menús superior, selecciona Datos | Texto a columnas. Aparecerá una ventana emergente del asistente "Texto a columna ". En el paso 1, selecciona Delimitado y, a continuación, haz clic en Siguiente. En el paso 2, en Delimitadores, seleccione Tabulador y coma y, a continuación, haga clic en Siguiente. En el paso 3, seleccione Finalizar.
    OPCIONAL: Para trazar las señales de calcio normalizadas, resalte Fnorm_FminFmax y seleccione Gráfico de dispersión.
  8. Busque un archivo .csv que se genere que contenga: (1) valores de fluorescencia sin procesar F, (2) ΔF/Fo y (3) Fnorm (intensidad de fluorescencia normalizada). Organice el conjunto de datos final en cuatro columnas: (1) tiempo (marcos), (2) condición de la muestra (hambriento o alimentado), (3) ID de replicación (muestra individual) y (4) intensidad normalizada (valores Fnorm escalados de 0 a 1).
  9. Por último, realice el análisis y la visualización de datos en R mediante scripts de R personalizados (https://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging, consulte Tabla de materiales).
    1. Importe el script de R personalizado en un nuevo proyecto de R. Asegúrese de que los paquetes de R necesarios, incluidos ggplot2, dplyr y readr, estén instalados y actualizados antes de ejecutar el análisis.
    2. A partir de la línea 1 del script de R personalizado, presione Ejecutar continuamente para realizar el análisis de calcio. Asegúrese también de que la salida incluya mapas de calor que ilustren la intensidad de calcio normalizada para los primeros 30 fotogramas, 60 fotogramas y todos los fotogramas de la grabación de series temporales, y diagramas de caja para mostrar la mediana de las intensidades normalizadas.
    3. Evaluar la importancia de la intensidad de calcio normalizada mediante la prueba U de Mann-Whitney.

7. Eliminación y descontaminación de residuos

  1. Después de los experimentos, elimine los desechos gruesos de las herramientas y superficies con agua corriente, luego desinfecte con etanol al 70% o lejía al 10% seguido de agua estéril. Trabaje sobre una superficie desinfectada y lávese las manos después de quitarse los guantes; No coma ni beba en el laboratorio.
  2. Coloque el tejido larvario y los desechables contaminados en bolsas de riesgo biológico y autoclave antes de desechar.
  3. Deseche los desechos adhesivos completamente curados en la basura general; El adhesivo no curado y los desechables contaminados deben recolectarse en un contenedor de desechos químicos peligrosos sellado y etiquetado.
  4. Coloque todos los objetos punzantes (cuchillas, agujas, vidrios rotos) en un recipiente resistente a los pinchazos.
  5. Recoger disolventes inflamables (etanol, acetona) en contenedores de residuos inflamables etiquetados.

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Resultados

Para demostrar nuestro enfoque de imágenes de calcio larvario, lo aplicamos con éxito a preparaciones in vivo y ex vivo de las larvas de Drosophila (Figura 2 y Figura 3, Video 1, Video 2, Video 3 y Video 4). Medimos la dinámica del calcio en larvas de Drosophila de tercer estadio que expresan GCaMP6f y Td-Tomato en un solo par de Keystone-LN en el cerebro larvario

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Discusión

Aquí, describimos un enfoque para imágenes de calcio in vivo y ex vivo en larvas de Drosophila melanogaster de tercer estadio. Tomamos imágenes de la dinámica del calcio en Keystone-LN, una neurona local inhibidora en la larva de Drosophila . Medimos la dinámica del calcio Keystone-LN en preparaciones larvarias enteras (in vivo) y en preparaciones disecadas del cerebro larvario (ex vivo) (Figura 1).

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que divulgar.

Agradecimientos

Estamos agradecidos con el Dr. Jeffrey Harper, quien puso a nuestra disposición el microscopio confocal de disco giratorio de su laboratorio para estos experimentos. Estamos agradecidos por el regalo de la línea de mosca: w; UAS-GCaMP6f/CyO, llorar; UAS-tdTomato del Dr. Jung Hwan Kim. Este trabajo fue apoyado por fondos de la Fundación Nacional de Ciencias bajo los números de premio 2341202 y 2129234. La Figura 1 se creó con Biorender.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Acciones y Fly Stocks Mantenimiento
Alimento para moscas nutriflyGenesee Scientific66-112
UAS-GCaMP6f, tdTomatoDonación del Dr. JH Kim 
w;; Keystone-Gal4 (GMR27F08-GAL4)BDSC49232
Protocolo de reactivos para la inanición
Placa de Petri de 6 cmGenesee Scientific32-106G
SacarosaMillipore SigmaS0389-500G
Reactivos para la imagen y el tampón de disección
Cloruro de calcioJ.T. Baker, Avantor SciencesJT1311-1CAS: 1311-01, 500g
D-(+)-glucosaThermo Fisher ScientificA16828.36CAS: 50-99-7, 500g
HEPES-2-[4-(2-Hidroxietil)-1-piperazinilo]-ácido etanosulfónicoJ.T. Baker, Avantor SciencesJT4018-1CAS: 4018-01, 100g
Cloruro de magnesioVWR97064-150CAS: 7786-30-3, 100g
Cloruro de potasioThermo Fisher ScientificJ64189.36CAS: 7447-40-7, 500g
Cloruro de sodioEMD Milipore SigmaEMD-SX0420-1CAS: 7647-14-5, 500g
Herramientas y reactivos para la disección
Amortiguador de disecciónComposición proporcionada en el texto
Placas de Petri Olympus, 60 x 15mm ventiladasGenesee Scientific32-105
Base de elastómero Sylgard 184Ciencias de la Microscopía Electrónica24236-10A
Agente de curado con base elastómera Sylgard 184Ciencias de la Microscopía Electrónica24236-10B
Pinzas Estilo 5, EMSCiencias de la Microscopía Electrónica78320-5
Tijeras de muelle Vannas - Filo de 3 mmHerramientas Científicas Fines15000-00
Imagenología y Equipamiento/Reactivos de montaje
Módulo de escáner confocalYokogawaCSU-W1Conectado al microscopio
Búfer de imagenComposición proporcionada en el texto
Microscopio invertidoLeica MicrosystemsDMi8 Conectado a un módulo de escáner confocal de disco giratorio y a una cámara CCD
Vidrio de cubierta de microscopio, 24mm x 50mm, grosor # 1,5Globe Scientific Inc.1415-15
Adhesivo tópico MWI Veterinary GLUTUREFisher ScientificNC0632797
Vaselina puraWalgreens912556
Enlaces a recursos públicos
BioRenderhttps://www.biorender.com/
ImageJNIH912556https://imagej.net/ij/
Vídeo del protocolo Janelia Flylighthttps://www.janelia.org/https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o
Mathew Lab Githubhttps://github.com/MathewLab/JoVE-Calcium-imaging

Referencias

  1. Winding, M., et al. The connectome of an insect brain. Science. 379 (6636), eadd9330(2023).
  2. Eschbach, C., Zlatic, M. Useful road maps: studying Drosophila larva's central nervous system with the help of connectomics. Curr Opin Neurobiol. 65, 129-137 (2020).
  3. Aimon, S., Grunwald Kadow, I. C. Studying complex brain dynamics using Drosophila. J Neurogenet. 34 (1), 171-177 (2020).
  4. Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
  5. Fukumasu, K., Nose, A., Kohsaka, H. Extraction of bouton-like structures from neuropil calcium imaging data. Neural Netw. 156, 218-238 (2022).
  6. Yamaguchi, A., et al. Multi-neuronal recording in unrestrained animals with all acousto-optic random-access line-scanning two-photon microscopy. Front Neurosci. 17, 1135457(2023).
  7. Marescotti, M., Lagogiannis, K., Webb, B., Davies, R. W., Armstrong, J. D. Monitoring brain activity and behaviour in freely moving Drosophila larvae using bioluminescence. Sci Rep. 8 (1), 9246(2018).
  8. Si, G., et al. Structured odorant response patterns across a complete olfactory receptor neuron population. Neuron. 101 (5), 950-962.e7 (2019).
  9. Ji, H., Han, C. Larvaspa, a method for mounting Drosophila larva for long-term time-lapse imaging. J Vis Exp. (156), e60792(2020).
  10. Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in Drosophila. J Vis Exp. (136), e57701(2018).
  11. Maier, G. L., Komarov, N., Meyenhofer, F., Kwon, J. Y., Sprecher, S. G. Taste sensing and sugar detection mechanisms in Drosophila larval primary taste center. Elife. 10, (2021).
  12. Carreira-Rosario, A., York, R. A., Choi, M., Doe, C. Q., Clandinin, T. R. Mechanosensory input during circuit formation shapes Drosophila motor behavior through patterned spontaneous network activity. Curr Biol. 31 (23), 5341-5349.e4 (2021).
  13. Yoon, Y., et al. System level analysis of motor-related neural activities in larval Drosophila. J Neurogenet. 33 (3), 179-189 (2019).
  14. Vaadia, R. D., et al. Characterization of proprioceptive system dynamics in behaving Drosophila larvae using high-speed volumetric microscopy. Curr Biol. 29 (6), 935-944.e4 (2019).
  15. Utashiro, N., Williams, C. R., Parrish, J. Z., Emoto, K. Prior activity of olfactory receptor neurons is required for proper sensory processing and behavior in Drosophila larvae. Sci Rep. 8 (1), 8580(2018).
  16. Gillespie, J. M., Hodge, J. J. CASK regulates CaMKII autophosphorylation in neuronal growth, calcium signaling, and learning. Front Mol Neurosci. 6, 27(2013).
  17. Francis, J., et al. Inhibitory circuit motifs in Drosophila larvae generate motor program diversity and variability. PLoS Biol. 23 (4), e3003094(2025).
  18. Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. Elife. 5, (2016).
  19. Odell, S. R., et al. Internal state affects local neuron function in an early sensory processing center to shape olfactory behavior in Drosophila larvae. Sci Rep. 12 (1), 15767(2022).
  20. Worrell, J. W., Levine, R. B. Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ. J Neurophysiol. 100 (2), 868-878 (2008).
  21. Marley, R., Baines, R. A. Dissection of third-instar Drosophila larvae for electrophysiological recording from neurons. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (9), (2011).
  22. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  23. Held, M., et al. Aminergic and peptidergic modulation of insulin-producing cells in Drosophila. Elife. 13, (2025).
  24. Kim, S. M., Wang, J. W. Calcium imaging of pheromone responses in the insect antennal lobe. Methods Mol Biol. 1068, 179-187 (2013).
  25. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol [A]. 175 (2), 179-191 (1994).
  26. Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J Neurosci. 24 (10), 2496-2505 (2004).
  27. Larval Dissection. , Howard Hughes Medical Institute. https://www.youtube.com/watch?v=UVCPmuu2b6o (2019).
  28. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: an open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  29. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  30. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  31. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nat Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  32. De Vries, S. E. J., et al. A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex. Nat Neurosci. 23 (1), 138-151 (2020).
  33. Zhang, Y., et al. Imaging sensory transmission and neuronal plasticity in primary sensory neurons with a positively tuned voltage indicator. Nat Commun. 16 (1), 6396(2025).
  34. Root, C. M., Ko, K. I., Jafari, A., Wang, J. W. Presynaptic facilitation by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search. Cell. 145 (1), 133-144 (2011).
  35. Slankster, E., et al. Mechanism underlying starvation-dependent modulation of olfactory behavior in Drosophila larva. Sci Rep. 10 (1), 3119(2020).
  36. Lehnert, B. P., Baker, A. E., Gaudry, Q., Chiang, A. S., Wilson, R. I. Distinct roles of TRP channels in auditory transduction and amplification in Drosophila. Neuron. 77 (1), 115-128 (2013).
  37. Murthy, M., Turner, G. Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (2), 140-148 (2013).
  38. Giovannucci, A., et al. CaImAn: an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, (2019).
  39. Cao, G., et al. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 154 (4), 904-913 (2013).
  40. Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).

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