Las líneas celulares resistentes a los medicamentos permiten comprender los mecanismos de resistencia al tratamiento y la evaluación no clínica de nuevos compuestos, medicamentos reutilizados y terapias combinadas. Este artículo presenta un protocolo para crear líneas celulares resistentes mediante la exposición de líneas celulares parentales a aumentos escalonados en la concentración del fármaco diana.
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Artículo de método
Desarrollo de líneas celulares resistentes a los medicamentos para procedimientos experimentales
En este artículo
Resumen
Resumen
El desarrollo de líneas celulares resistentes a los medicamentos es esencial para comprender los mecanismos de la resistencia a los medicamentos e identificar estrategias para superar el fracaso del tratamiento en la terapia contra el cáncer. Los modelos de resistencia permiten la evaluación preclínica de nuevos compuestos, fármacos reutilizados y terapias combinadas. Para generar células resistentes, las líneas celulares cancerosas parentales se exponen repetidamente a concentraciones cada vez mayores del fármaco objetivo durante varias semanas. Las células que sobreviven y proliferan en cada etapa se seleccionan, expanden y exponen a dosis más altas de medicamentos. El desarrollo de resistencia se confirma cuantificando y comparando los valores de concentración inhibitoria media máxima (CI50) entre células parentales y resistentes mediante ensayos de viabilidad celular y análisis de regresión no lineal. Los valores significativamente aumentados de IC50 indican una adaptación exitosa a la presión del fármaco y el desarrollo de resistencia. Estas líneas celulares resistentes a los medicamentos están disponibles para análisis integrales, como microarrays y secuenciación de células individuales, así como varios experimentos in vitro o in vivo . Estos modelos proporcionan herramientas valiosas para investigar posibles estrategias terapéuticas para superar la resistencia a los medicamentos.
Introducción
La quimioterapia es la opción de tratamiento más utilizada para los cánceres locales que no son susceptibles de cirugía o radioterapia o cánceres metastásicos. Los medicamentos dirigidos molecularmente y la quimioterapia se utilizan como tratamientos de primera línea para muchas neoplasias malignas, y su eficacia es ampliamente reconocida. Algunos cánceres muestran resistencia a ciertos medicamentos desde el inicio del tratamiento, lo que hace que el tratamiento sea ineficaz. Sin embargo, en casos más comunes, el tratamiento que inicialmente fue efectivo se vuelve ineficaz debido al desarrollo de resistencia a los medicamentos, lo que lleva a la progresión del cáncer.
La resistencia a los medicamentos es causada tanto por mutaciones genéticas como por una respuesta epigenética en las células cancerosas que inducen la expresión de productos génicos que evaden los medicamentos o ayudan al crecimiento celular 1,2. Además, en muchos casos, esta resistencia evoluciona a resistencia a múltiples fármacos, donde la célula cancerosa se vuelve resistente a múltiples fármacos 3,4. Por lo tanto, identificar los mecanismos de resistencia a los medicamentos y desarrollar estrategias para superarla son extremadamente importantes para el avance del tratamiento del cáncer.
Las líneas celulares resistentes a los fármacos son modelos utilizados con frecuencia para estudiar los mecanismos de resistencia terapéutica y desempeñan un papel importante tanto en experimentos in vitro como in vivo 5. Estos modelos son herramientas esenciales para obtener una comprensión más profunda de las vías de acción de los fármacos, identificar biomarcadores que influyen en la eficacia terapéutica y encontrar estrategias terapéuticas para inhibir la formación de resistencia a los fármacos. El proceso básico de creación de una línea celular resistente a los medicamentos es inducir resistencia exponiendo una línea celular a niveles crecientes del fármaco objetivo 3,6.
La concentración utilizada y la duración de la exposición a la droga son componentes críticos de este proceso. En cada nivel de concentración, el subconjunto de células que sobreviven se amplifica y luego se expone a la siguiente concentración de fármaco de manera repetitiva. En última instancia, se deriva una línea celular resistente a los medicamentos que tiene una concentración inhibitoria media máxima aumentada (IC50) para el fármaco en comparación con la línea celular parental. Este informe detalla el procedimiento para generar una línea celular resistente a paclitaxel (DU145-TxR) a partir de la línea celular de cáncer de próstata humano DU145, empleando un método escalonado con exposiciones intermitentes a fármacos.
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Protocolo
1. Ensayos de cultivo celular y viabilidad celular
NOTA: El paclitaxel es un medicamento contra el cáncer y es citotóxico. Cuando lo manipule, use una bata, gafas y guantes, y trabaje dentro de un gabinete de seguridad para evitar la inhalación en el cuerpo. El DMSO no es altamente citotóxico, pero cuando entra en contacto con la piel o las membranas mucosas, aumenta la permeabilidad de los medicamentos disueltos, así que use una bata, gafas y guantes cuando lo manipule.
- Cultivar células DU-145 en una placa de cultivo celular de 10 cm utilizando medio completo (RPMI-1640 + 1% de penicilina-estreptomicina [pen-estreptococo] + 10% de suero fetal bovino [FBS]) en una incubadora de 37 °C al 5% de CO2 hasta un 80% de confluente.
- Aspirar el medio de cultivo, lavar con DPBS, agregar tripsina al 0,05% y dejar en la incubadora durante 5 min.
- Después de golpear y confirmar por microscopía que las células están separadas de la placa y flotando, agregue 1 ml de medio completo para detener la acción de la tripsina.
- Cuente el número de células y siembre a una densidad de 1,0 × 104/99 μL por pocillo en medio completo en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Incube durante 2 h para permitir que las células se adhieran al fondo de la placa. Las celdas deben colocarse por triplicado o cuadruplicado para cada grupo de prueba.
- Ajuste el paclitaxel y el DMSO que se agregarán a cada pocillo. Asegúrese de que la cantidad de DMSO agregada a cada pocillo sea la misma y que la concentración final de DMSO no sea superior al 1%.
- Para realizar esto y siguiendo nuestro protocolo, comience con 10 mM de paclitaxel en DMSO y agregue 87,2 μL de DMSO a 12,8 μL de este fármaco en un tubo para obtener 100 μL de paclitaxel a 1.280 μM.
- Transfiera 50 μL de esta solución a otro tubo y dilúyala a la mitad con 50 μL de DMSO (640 μM).
- Repita este procedimiento para realizar una dilución en serie y preparar soluciones de paclitaxel en concentraciones de 0 (solo DMSO), 0,1, 0,5, 1, 2, 4, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 620 y 1.280 μM.
NOTA: El paclitaxel diluido con DMSO debe almacenarse congelado para su reutilización en experimentos posteriores (para minimizar los ciclos de congelación-descongelación, almacenar en alícuotas).
- Diluir 1 μL de la solución de paclitaxel preparada anteriormente con 9 μL de medio completo en un tubo separado, y añadir 1 μL de este a cada pocillo 2 h después de sembrar las células. Las concentraciones de paclitaxel en cada pocillo serán 0, 0,1, 0,5, 1, 2, 4, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 620 y 1.280 nM, y cada pocillo contendrá 100 μL de medio.
NOTA: Al establecer la concentración de fármacos utilizados en los ensayos de viabilidad celular, verifique los valores de IC50 publicados en artículos anteriores y asegúrese de que la concentración se encuentre dentro del rango3. La concentración de DMSO en cada pocillo fue del 0,1% en todo momento (es deseable menos del 1%). - Incubar durante 48 h. Agregue 10 μL de reactivo de proliferación celular WST-1 a cada pocillo (100 μL de medio de cultivo) e incube durante 0,5 a 4,0 h adicionales.
NOTA: El tiempo óptimo de incubación depende de la línea celular y la densidad celular. En este estudio, cultivamos células durante aproximadamente 1,5 h. Si el tiempo de incubación es demasiado corto o demasiado largo, la absorbancia de cada pocillo será demasiado baja o demasiado alta en el siguiente paso. Como resultado, no será posible confirmar la diferencia en la viabilidad celular. Por lo tanto, para la prueba inicial, se deben probar varios tiempos de incubación para confirmar el tiempo de incubación adecuado. - Mida la absorbancia de WST-1 con un lector de microplacas.
NOTA: La absorbancia objetivo es de 450 nm (se recomienda 420-480 nm) y la absorbancia de fondo es de 650 nm (se recomienda 600 nm o más).
2. Cálculo de la viabilidad celular y del valor de la concentración inhibitoria semimáxima (IC50)
- Calcule la viabilidad celular a partir de la absorbancia. La absorbancia es (A450nm-A650nm).
Viabilidad celular (%) = [(As-Ab)/(Ac-Ab)] × 100
As: absorbancia de la muestra (células tratadas con fármacos)
Ab: absorbancia en blanco (solo medio, sin celdas)
Ac: absorbancia de control (células no tratadas con fármacos) - Resuma la viabilidad de la celda calculada en la sección anterior en un software de hoja de cálculo.
- Calcule y registre el IC50 para las células parentales mediante análisis de regresión no lineal.
NOTA: El modelo logístico de cuatro parámetros (4PL) suele ser un método de cálculo adecuado. Las herramientas de cálculo IC50 en línea están disponibles7. Sin embargo, el modelo 4PL no debe usarse cuando la eficacia del compuesto está fuera del rango de concentración y los datos no pueden representar completamente las asíntotas inferior y superior de la curva sigmoide.- Para evitar tal aumento, mida la viabilidad celular en tantos puntos de concentración como sea posible. Si no se puede obtener una curva sigmoidea, utilice un modo de dos o tres parámetros con valores mínimos y máximos fijos7.
- Si no utiliza software de cálculo o software estadístico, incluidos los disponibles en la web, utilice la siguiente fórmula:
IC50=((50-C)(B-A) + A(D-C))/(D-C)
R: El valor más bajo entre las concentraciones de fármacos medidas con una viabilidad celular del ≤50%
B: El valor más alto entre las concentraciones de fármacos medidas con una viabilidad celular del >50%
C: Viabilidad celular en B
D: Viabilidad celular en A
NOTA: Esta fórmula supone que el gráfico entre los dos puntos que intercalan el valor IC50 es una línea recta.
3. Exposición a drogas
NOTA: En la Figura 1 se muestra una descripción general de los procedimientos descritos en esta sección.
- Células parentales de semillas en placas de cultivo celular (2,0 × 106 células/placa para placas de 100 mm).
- Agregue paclitaxel a una concentración inhibidora de viabilidad celular de ~ 10-20% (IC10-20, ~ 0.5 nM en este caso) al medio y cultive en una incubadora durante 2 días.
- Reemplace con medio sin paclitaxel e incube durante varios días.
- Una vez que las células hayan crecido y se hayan vuelto 80% confluentes, páselas a una nueva placa de cultivo celular. Criopreservar las células restantes.
- Agregue paclitaxel a las celdas pasadas a una concentración de ~ 1.5-2.0 veces la concentración inicial (0.75-1 nM). Incubar en una incubadora durante 2 días.
- Reemplace con medio sin paclitaxel e incube durante varios días.
- Si las células crecen de manera similar, repita los pasos 3.4-3.6, aumentando la concentración de exposición a paclitaxel paso a paso.
NOTA: El experimentador puede establecer libremente el aumento de la concentración del fármaco (1,5-2,0 veces), y el experimento debe repetirse a esa concentración. Recomendamos congelar y almacenar las células cada vez que se aumente la concentración del medicamento. Si la concentración de paclitaxel continúa aumentando, es posible que la proliferación celular no se recupere y las células mueran. En tales casos, descongele las células que proliferaron en la concentración antes de la muerte, reduzca el aumento de paclitaxel a 1,1-1,5 veces (se recomienda 1,2 veces) y repita el cultivo. - Aumente gradualmente la resistencia de la línea celular al fármaco y luego, calcule y registre el IC50 utilizando WST-1 y el software como se describe en la Sección 2.
NOTA: Si se observa un aumento en IC50 de al menos 3-5 veces, se puede determinar que la cepa es una línea celular resistente a los medicamentos.
4. Mantenimiento de la resistencia a los medicamentos
- Para mantener el fenotipo resistente de la línea celular resistente a los fármacos, incubar con una concentración de fármaco de IC10-20.
NOTA: Se recomienda que el IC50 en un ensayo de supervivencia celular se mida periódicamente, ya que la resistencia a los medicamentos puede cambiar.
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Resultados
Con este método, anteriormente pasamos 9 meses estableciendo con éxito células DU145 resistentes a paclitaxel (DU145-TxR). Los resultados del ensayo de viabilidad celular mostraron que el valor de IC50 de paclitaxel para la línea celular madre DU145 fue de 1,1 nM, mientras que el valor de IC50 para DU145-TxR fue 149,6 veces mayor que el de la línea celular madre (IC50: 164,6 nM) (Tabla 1 y Figura 2). Este resultado indica que DU145-TxR ha adq...
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Discusión
El desarrollo de líneas celulares cancerosas resistentes a los medicamentos es un método establecido para investigar la toxicidad de los medicamentos y los mecanismos de resistencia, pero el primer desafío que enfrentan los investigadores es seleccionar un modelo apropiado para expresar resistencia. Un método común para crear líneas celulares resistentes a los medicamentos in vitro es exponer la línea celular al fármaco objetivo, pero es necesario considerar cómo establecer la concentrac...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen posibles conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado en parte por la subvención P01 CA093900 de los Institutos Nacionales de Salud.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tripsina-EDTA al 0,05 % | Gibco | 25300-054 | |
| Pipeta serológica desechable de 10 ml | Fisher scientific | 13-678-11E | |
| Plato de 100 mm | Tubo | 353003 | |
| 15 ml Viales | Corning | ||
| 2,0 ml Placa de | Corning | 431386 | |
| de | 96 pocillosCorning | 353072 | |
| Portaobjetos de cámara de recuento de células | Invitrogen | C10228 | |
| Reactivo de proliferación celular WST-1 | Centrífuga | de 5015944001 | |
| 5702 | R eppendorf | ||
| innumerables II | Invitrogen | Contador de células | |
| Dimetil sulfóxido | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | D4W2J | |
| DU145 | ATCC | HTB-81 Línea celular de cáncer de | próstata |
| EVOS FLc | Thermo Fisher Scientific | Microscopio digital invertido | |
| FBS | Gibco | A5670701 | |
| Paclitaxel | Selleck | S1150 | |
| Penicilina– estreptomicina | Invitrogen | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Synergy H1 | BioTek | Lector de microplacas | |
| Solución azul de tripano 0.4% | Invitrogen | 15250061 |
Referencias
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- Emran, T. B., et al. Multidrug resistance in cancer: understanding molecular mechanisms, immunoprevention and therapeutic approaches. Fron Oncol. 12, 891652(2022).
- Takeda, M. The establishment of two paclitaxel-resistant prostate cancer cell lines and the mechanisms of paclitaxel resistance with two cell lines. Prostate. 67 (9), 955-967 (2007).
- Abelman, R. O., et al. TOP1 mutations and cross-resistance to antibody-drug conjugates in patients with metastatic breast cancer. Cli Cancer Res. 31 (10), 1966-1974 (2025).
- McDermott, M. In vitro development of chemotherapy and targeted therapy drug-resistant cancer cell lines: a practical guide with case studies. Fron Oncol. 4, 40(2014).
- Breen, L., Murphy, L., Keenan, J., Clynes, M. Development of taxane resistance in a panel of human lung cancer cell lines. Toxico In Vitro. 22 (5), 1234-1241 (2008).
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Reimpresiones y permisos
