Logrando una recogida de datos tomográficos de alta calidad utilizando el microscopio electrónico de transmisión de 200 kV con sistema de lentes de condensador dual

Summary

La tomografía electrónica permite la obtención de imágenes a nivel casi atómico de orgánulos, células y macromoléculas dentro de tejidos en muestras crio-biológicas. Alcanzar dicha resolución requiere condiciones de imagen estrictamente controladas. Aquí, usando como ejemplo un microscopio electrónico de transmisión de 200 kV con un sistema de lentes condensadoras de dos etapas, describimos cómo realizar la recogida de datos de tomografía electrónica de alta calidad.

Abstract

La criotomografía electrónica (crio-ET) ha surgido como una técnica poderosa para esclarecer las estructuras de orgánulos celulares y grandes complejos proteicos en sus entornos nativos. A diferencia de la microscopía electrónica convencional a temperatura ambiente, la crio-ET minimiza el daño inducido por radiación y preparación en estructuras internas. Además, a diferencia del análisis de partícula única (SPA), la crio-ET reduce la necesidad de purificación repetitiva, preservando así la información estructural más auténtica de las muestras. Para lograr imágenes de alta resolución, la crio-ET también impone requisitos estrictos sobre las condiciones de imagen del TEM. A pesar de la mejora continua en la eficiencia de adquisición de datos crio-ET y la aparición de numerosas plataformas de software, la mayoría de las soluciones son propietarias, específicas de cada proveedor y están estrechamente acopladas a ciertos modelos de microscopio electrónico, lo que conlleva altos costes de implementación. En este estudio, instalamos el software de código abierto SerialEM en un microscopio electrónico de 200 kV (Glacios 2 cryo-TEM) con un sistema de lentes de condensador dual y realizamos calibraciones exhaustivas para permitir la adquisición de datos tomográficos de alta calidad. Utilizando la apoferritina como muestra modelo, describimos todo el flujo de trabajo: desde la preparación de la crio-muestra hasta la recogida automatizada de datos crio-ET, seguida de la reconstrucción por tomografía y el análisis subtomográfico. Este método ofrece una solución rentable y accesible para la recogida de datos crio-ET, especialmente para laboratorios que utilizan microscopios Glacios sin acceso a software propietario.

Introduction

La criotomografía electrónica (crio-ET) ha surgido como una técnica poderosa para estudiar las estructuras nativas de complejos macromoleculares y orgánulos celulares in situ. Una gran ventaja de la crio-ET frente al análisis de partícula única (SPA) es su capacidad para evitar los pasos excesivos de purificación, preservando así el estado nativo de las biomoléculas objetivo dentro de su contexto biológico. Actualmente, se puede investigar un amplio espectro de especímenes —incluyendo orgánulos^purificados 1,2,3,4, láminas de membrana celular, complejos ^{macromoleculares 5},^{virus 6}, láminas^{celulares 7} y secciones^{tisulares 8,9,10}— mediante crio-ET. Dada la diversidad de tipos de muestra y objetivos experimentales, las estrategias de recogida de datos varían sustancialmente y deben adaptarse cuidadosamente tanto a la muestra como a la configuración específica del instrumento.

La recogida de datos es un paso fundamental en el flujo de trabajo crio-ET, ya que tanto la calidad de los datos como la eficiencia en la adquisición impactan directamente en el procesamiento posterior y en el éxito experimental general del experimento. Para satisfacer las demandas experimentales en evolución, se han desarrollado varias plataformas de recogida de datos. Entre los más utilizados se encuentran la tomografía comercial y el software de código abierto SerialEM^{11, 12 y 13}. Tomografía ofrece una interfaz altamente integrada y fácil de usar con una curva de aprendizaje baja, pero es menos flexible y requiere una licencia comercial. En cambio, SerialEM es un paquete gratuito y de código abierto que soporta tanto flujos de trabajo basados en interfaces gráficas de usuario (GUI) como basados en scripts, proporcionando mayor flexibilidad y extensibilidad.

La recogida de datos tomográficos a partir de crioláminas presenta desafíos únicos. Las láminas de alta calidad son difíciles de preparar, y su inestabilidad mecánica y alta sensibilidad a la irradiación electrónica complican aún más la recogida de datos. Para abordar estos desafíos, Fabian Eisenstein desarrolló el flujo de trabajo^{PACEtomo 14}, una mejora de SerialEM que introduce el desplazamiento de imagen del haz para adquirir múltiples tomogramas por serie de inclinación, reduciendo así la frecuencia de los ajustes de enfoque y seguimiento. Esta estrategia maximiza la cantidad de datos utilizables de cada sección minimizando la exposición innecesaria de electrones. Funcionalidades similares también están disponibles en el software comercial Tomography5.

En cambio, la recogida de datos de orgánulos o láminas de membrana fijadas en criogenia suele ser más sencilla, ya que estas muestras suelen prepararse en rejillas de carbono con agujeros, ofreciendo amplio espacio para enfocar y^{rastrear 15,16}. En tales casos, los flujos de trabajo de adquisición de crio-ET integrados de SerialEM —accesibles directamente a través de su interfaz gráfica— ofrecen una opción cómoda y sin scripting, especialmente adecuada para principiantes o laboratorios más pequeños. No obstante, desde la perspectiva de la eficiencia, seguimos recomendando estrategias basadas en el desplazamiento de imagen de haz siempre que sea posible.

Dado el alto coste de los microscopios crioelectrónicos, optimizar las estrategias de recogida de datos para maximizar la utilización del instrumento es esencial. Un TEM de 200 kV equipado con un sistema de lentes condensadoras de dos etapas ofrece una penetración de electrones ligeramente menor para muestras gruesas que un instrumento de 300 kV, pero sigue siendo totalmente viable para crio-ET cuando está correctamente calibrado. Sin embargo, su rango relativamente estrecho de condiciones de haz paralelo y su tamaño fijo de punto a través de ampliaciones lo hacen generalmente menos adecuado para crio-ET de alta resolución a menos que el sistema esté optimizado con precisión.

Nuestro equipo de microscopía electrónica está equipado con una cámara Falcon 4i de detección directa de electrones, que ofrece ventajas sustanciales en capacidad de conteo de electrones individuales e imagen continua de alta velocidad. Para aprovechar plenamente el rendimiento de este detector, el TEM debe operarse bajo condiciones de imagen bien optimizadas. Para los TEM que emplean un sistema de condensador de dos etapas, la calibración precisa de las condiciones de iluminación para luz paralela es un factor importante para mejorar la calidad de imagen^17,18. En los sistemas modernos de condensador de dos etapas, el punto focal de la lente condensadora de segunda etapa debe coincidir con el plano focal frontal de la lente del objetivo superior para asegurar que el camino óptico que intersecta con el plano de la muestra sea paralelo. Condiciones de luz paralelas establecidas con precisión son cruciales para asegurar que los valores de subenfoque y la magnificación se mantengan consistentes en posiciones locales en las imágenes recopiladas.

En este estudio, nos centramos en establecer un flujo de trabajo crio-ET de alta calidad utilizando apoferritina como muestra modelo. Como el sistema de microscopio electrónico de transmisión de 200 kV no está licenciado para el software comercial de tomografía, instalamos y calibramos la plataforma de código abierto SerialEM en su lugar. Optimizando cuidadosamente los parámetros del haz paralelo para el sistema de lentes condensadoras de dos etapas del microscopio, logramos la recogida automática de datos tomográficos a través de la interfaz gráfica SerialEM, sin necesidad de scripts en Python ni configuraciones complejas. Este enfoque proporciona una solución fácil de usar y rentable para la adquisición eficiente de datos crio-ET en instrumentos de 200 kV como Glacios.

Protocol

1. Preparación y carga de muestras criogénicas

1. Para preparar el Vitrobot, enciéndelo y ajusta la temperatura a 10 °C. Pon la humedad al 100%. Cambia el papel de filtro.
2. Coloca una rejilla de carbono cuantificada R1.2/1.3 de 300 mallas con cuantoil en el sistema de descarga glow. Ajusta las condiciones de descarga luminosa a 15 mA durante 60 s con una presión de vacío de 0,39 mBar, carga negativa. Realiza la descarga luminosa para hidrofilizar la superficie de la rejilla.
3. Configura los parámetros de Vitrobot de la siguiente manera: Tiempo de mancha: 3 s, Tiempo de espera: 0 s, Fuerza de Drenaje: 2, Temperatura: 8 °C, Humedad: 90%.
4. Prepara el etano líquido en una copa de etano envuelta en nitrógeno líquido enfriándolo con nitrógeno líquido.
5. Aplicar 3 μL de muestra de apoferritina sobre la rejilla descargada por glow. Vitrifica inmediatamente la muestra en etano líquido
6. Transfiere la muestra del etano a una caja de almacenamiento preenfriada en nitrógeno líquido. La preparación de la muestra criogénica ya está completa.
   PRECAUCIÓN: Se deben seguir estrictamente los siguientes protocolos de seguridad al manipular nitrógeno y etano líquidos: Se requiere equipo de protección individual (por ejemplo, guantes criogénicos y gafas de seguridad) para prevenir congelaciones durante las operaciones; Antes de la condensación del etano, asegúrese de que la copa receptora esté libre de nitrógeno líquido para evitar salpicaduras causadas por la ebullición rápida; Tras su uso, cierra bien las válvulas principales y reguladoras de presión del sistema de gas etano para evitar fugas; El etano residual y el nitrógeno líquido deben ser eliminados en equipos de ventilación designados dentro de la sala de preparación tras la preparación de la muestra.

2. Determinar las condiciones de luz paralela para la microscopía electrónica

1. Antes de realizar la alineación paralela del haz de luz, primero ajusta los siguientes parámetros del telescopio: escenario a altura eucéntrica, lente objetivo enfocada, inclinación del haz nP ppX/ppY, punto de pivote sin coma X/Y, coma y estigma.
2. Utilizando una rejilla transversal, confirmar que la muestra está a altura eucéntrica y el enfoque adecuado a una ampliación de SA 73.000× (sin filtro de energía) en modo nanosonda.
3. Cambia al modo de difracción (longitud de cámara: D750 mm) e inserta la apertura objetivo de 100 μm (Figura 1A, 1B).
4. Haz clic en la pestaña Ajustar para la apertura del objetivo y utiliza los mandos multifunción X e Y para desplazar la apertura del objetivo fuera del centro, de modo que el borde de la apertura se superponga con los anillos de difracción dorados y ocluya parcialmente el punto central (Figura 1C).
5. Haz que el plano focal posterior del objetivo aparezca ajustando el enfoque de difracción usando el botón de enfoque hasta que el borde del diafragma del objetivo esté lo más nítido posible (Figura 1D).
6. Ajusta la intensidad del haz (intensidad de C2) hasta que se minimice el ancho de los anillos de difracción de oro.
7. Centra la apertura del objetivo. Aumenta la longitud de la cámara de difracción hasta que solo quede visible el punto central (Figura 1E).
8. Haz clic en la pestaña de Difracción en el panel Stigmator y utiliza los mandos multifunción X e Y para ajustar la forma del punto central mientras se cicla por encima y por debajo del punto de cruce para hacer circular el haz (Figura 1F).
9. Ajusta la intensidad del haz hasta que el punto central se minimice. Esto establecerá condiciones de iluminación paralelas. Dado que las condiciones de iluminación paralela pueden variar según el tamaño de punto, documenta los ajustes de C2 correspondientes para cada tamaño de punto comúnmente utilizado para facilitar una configuración rápida en futuros experimentos.
   NOTA: El tamaño específico del punto utilizado durante la adquisición de datos depende de la ampliación y del ajuste de apertura C2; Debemos asegurarnos de que la imagen se realice a la tasa óptima de dosis para la cámara.

3. Recogida de datos de tomografía electrónica de alta calidad para muestras de apoferritina

NOTA: Esta sección describe un procedimiento estandarizado para la adquisición de datos tomográficos de alto rendimiento, adecuado tanto para usuarios experimentados como para nuevos investigadores.

1. Para recortar la rejilla y cargar la criomuestra preparada en el microscopio electrónico, se coloca la junta tórica en la herramienta de alineación, colocando la rejilla preparada en el centro de la junta tórica. Usa el bolígrafo de muelle para enganchar el anillo C al anillo tórico, fijando la muestra entre ellos.
2. Inserta la Autogrid verticalmente en la ranura del casete, transfierela al nanocup a través de la estación de trabajo y luego cárgala en el microscopio electrónico.
3. Para capturar un montaje completo de toda la cuadrícula usando SerialEM, lanza el software SerialEM. Activa el modo de Baja Dosis. Define el modo de búsqueda a 115× aumento.
   NOTA: La ampliación de búsqueda se utiliza típicamente para adquirir mapas de gran área. Esta ampliación se ajusta lo más bajo posible para acelerar el proceso de mapeo, asegurando al mismo tiempo la precisión de la unión de la imagen.
4. Abre el archivo del Navegador. Ve a Navigator > Montajes y Cuadrículas > monta el montaje completo. En el cuadro de diálogo, configura Usar Modo de Búsqueda; Guarda imágenes en formato bin4. Haz clic en Iniciar en Controles de Montaje.
5. Para calibrar los campos de búsqueda y visualización, en el modo Búsqueda, localiza un punto de referencia muy reconocible (Figura 2A). Haz clic en Añadir marcador en el navegador. Haz clic en Ir a Marcador para moverte a la ubicación del marcador.
6. Cambia al modo Vista (2600×) y localiza el mismo punto de referencia. Haz clic en el punto de referencia. Ve a Navegador, haz clic en Shift a Marcador para alinear los campos (Figura 2B). Siguiendo las indicaciones en el cuadro de diálogo, los desplazamientos de haz de ambas aumentaciones se asignan a todos los marcadores en el mapa de búsqueda, y los valores de desplazamiento se guardan (Figura 2C).
   NOTA: La ampliación de vista generalmente se ajusta a la más baja del Área Seleccionada (SA) para asegurar que tanto la vista como el Grabar estén en el mismo modo, facilitando el proceso de centrado durante el cambio de aumento.
7. Para calibrar los campos de vista y registro (Figura 3). En el modo Vista, localiza un punto de referencia muy reconocible. Cambia al modo Grabar (120k×). Usa el ratón para centrar el punto de referencia en el modo Grabar.
   NOTA: La configuración de la ampliación de registro depende de la resolución estimada del objetivo (cuando la resolución del objetivo es el doble del tamaño del píxel) y del tamaño de la muestra.
8. Vuelve al modo Vista y haz una foto. Arrastra el objeto objetivo bajo la ampliación de vista hasta la mira que representa el centro del campo de visión usando el botón derecho del ratón.
9. Haz clic en Establecer junto a Shift en la sección Desenfocar para alinear los campos.
10. Para seleccionar el cuadrado objetivo y capturar un mapa de aumento medio, 5.1 en el montaje completo, haz clic en Añadir polígono para delimitar el área a capturar. Después de delinear un área, haz clic en Detener Añadir para finalizar la selección.
11. Repite el paso 3.10 para todas las áreas deseadas. Para cada polígono en el Navegador, marca las opciones Adquirir (A) y Nuevo Archivo en Ítem.
12. En el cuadro de diálogo que aparece tras marcar Nuevo archivo en Ítem, selecciona lo siguiente: Imágenes montadas; Ajustar montaje al polígono; Cierra el archivo cuando vayan a abrir el siguiente archivo nuevo. Haz clic en OK.
13. En el nuevo cuadro de diálogo, selecciona lo siguiente: Mover escenario en lugar de cambiar imagen; Utiliza los parámetros de Vista en modo de Baja Dosis. Guarda la imagen en la ubicación especificada.
14. Para capturar el mapa de aumento medio, en el menú Navegador, haz clic en Adquirir en Objetos. Revisa las siguientes opciones: Adquirir y guardar imagen o montaje; Haz un mapa de Navigator.
15. En la sección Acción Primaria, comprueba el modo Usar Vista para capturar imágenes. En la sección de Tareas antes o después de Primaria, comprueba Eucentricidad Aproximada. Haz clic en IR para empezar a capturar el mapa de aumento medio.
16. Para seleccionar puntos en el mapa de aumento medio. Abre el mapa de aumento medio en la interfaz del Navegador. Haz clic en Añadir Punto y haz clic izquierdo en los objetos objetivo del mapa.
17. Repite para todos los puntos deseados. Después de seleccionar todos los puntos, haz clic en Detener Añadir para finalizar la selección.
18. Para la alineación de aperturas, utiliza alineaciones directas en la interfaz del microscopio para ajustar la inclinación del haz nP ppX/ppY y el punto de pivote sin coma X/Y, minimizando el bamboleo del punto de viga en el campo de visión.
19. Realiza el tune scope usando un script de la biblioteca de scripts SerialEM (https://serialemscripts.nexperion.net/script/47).
20. Para iniciar la recogida de datos de tomografía, en la interfaz Navigator, localice el ROI y compruebe la Serie de Inclinación. En el cuadro de diálogo, selecciona Imágenes de Fotogramas; Elige la ubicación de almacenamiento de datos.
21. En el cuadro de diálogo de configuración, establece un rango de grados de -50° a 50°. Ajusta el incremento base a 2,5°, el ángulo inicial a 0° y activa el esquema dose-simétrico.
    NOTA: Los ajustes para la dosis por inclinación, rango de ángulo de inclinación y paso de inclinación siguen generalmente los principios descritos a continuación: La dosis total se mantiene en aproximadamente 100 e⁻/Ų. El rango de inclinación se selecciona para asegurar que, incluso en el ángulo de inclinación más alto, la muestra permanezca en gran medida sin obstáculos y permita una transmisión y obtención de imágenes electrónicas suficientes. Si el rango de inclinación es relativamente grande (por ejemplo, más allá de ±60°), el escalón de inclinación puede ajustarse a 3°. Para un rango de inclinación menor (por ejemplo, alrededor de ±50°), el paso de inclinación puede reducirse a 2,5° o 2° para asegurar que la dosis total se mantenga alrededor de 100 e⁻/Ų. Esto es especialmente importante para los microscopios de 200 kV, donde el daño por radiación es más pronunciado en comparación con los de 300 kV, por lo que es esencial evitar una dosis total excesiva.
22. En la sección de Intensidad del haz o Control de exposición, comprueba Mantener la intensidad del haz. Ajusta el objetivo de desenfoque a -3 μm y la frecuencia de autoenfoque a una vez por inclinación.
23. Marca Parar si el Autoalineamiento desplaza más del 60% del tamaño de la imagen, y pon Seguimiento Antes y después.
24. Para comenzar la recogida de datos, en Navigator, haz clic en Adquirir en Elementos. En acción principal, comprueba Ciclo de desenfoque objetivo en autoenfoque, espera de deriva y TS.
25. Ajusta el rango de desenfoque de -3,5 a -4,5 μm, en 4 pasos. En General, activa Cerrar válvulas de columna al final. En la sección Tareas antes o después de Primaria, activa Realinear a ítem y Finir Eucentricidad antes de Primario.

4. Promedia subtomogramática de apoferritina

1. Realiza corrección de movimiento y estimación CTF usando Warp¹⁹. Realizar alineación tomográfica en serie de inclinación usando AreTomo3²⁰.
2. Ejecuta reconstrucción tomográfica y deconvolución usando Warp. Realiza la selección de partículas basada en plantillas usando PyTom²¹.
3. Realiza el refinamiento inicial usando RELION^{5 22}. Realizar refinamiento de alta resolución usando M²³.
4. Determinar la estructura final procesando ocho series de inclinación, seguida de la selección de 5.939 partículas y refinamiento iterativo, logrando una resolución final de 2,8 Å (Figura 4).

Results

Tras una alineación precisa del haz paralelo, realizamos la recogida de datos tomográficos para apoferritina utilizando la función de interfaz gráfica de SerialEM. El procesamiento posterior con Warp, AreTomo, PyTom, RELION y otro software relevante produjo una estructura final con una resolución de 2,8 Å. Esta resolución demuestra suficientemente la alta calidad de nuestros datos, alcanzando un nivel actualmente alcanzable mediante el promedio subtomogramático a una resolución relativamente alta. Como se muestra en la Figura 4, los resultados alineados y reconstruidos (Figura 4A) demuestran claramente la arquitectura general y la distribución espacial de la apoferritina. El promedio por subtomograma se realizó en partículas extraídas de ocho series de inclinación alineadas y reconstruidas, dando lugar a una estructura con una resolución de 2,8 Å (Figura 4B). La correlación de capas de Fourier (FSC) correspondiente se presenta en la Figura 4C.

Figura 1: Determinación de la condición de iluminación paralela usando el segundo sistema de lentes condensadoras. (A) Patrón de difracción en modo difracción sin apertura. (B) Patrón de difracción tras la inserción de una apertura objetiva de 100 μm. (C) Desplazamiento de apertura respecto al centro de difracción para visualizar mejor la nitidez de los bordes. (D) Borde de apertura enfocado y anillos de difracción optimizados ajustando las corrientes del objetivo y del objetivo C2. (E) Punto central de difracción elíptico que requiere corrección mediante el panel Stigmator. (F) Punto de difracción central circular y minimizado que indica una iluminación paralela optimizada. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Proceso de alineación de aumento alto a bajo desde Búsqueda (115×) hasta Vista (2600×). (A) Imagen en modo búsqueda con el marcador (flecha roja) situado en el borde del agujero. (B) Imagen en modo de visualización con el marcador (flecha roja) situado en la misma ubicación del objeto que en (A). La opción Shift to Marker se pulsa en el navegador. (C) En la ventana emergente, los desplazamientos del haz de ambas ampliaciones se asignan a todos los marcadores en el mapa de búsqueda y se guardan los valores de desplazamiento. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Proceso de alineación de aumento alto a bajo desde Vista (2600×) hasta Registro (120k×). (A) En modo Registro, el objeto objetivo se posiciona en el centro del campo de visión (el círculo rojo discontinuo resalta el objeto objetivo). (B) Imagen capturada en modo Vista, donde el objeto objetivo no se alinea con la mira roja (el círculo discontinuo rojo resalta el objeto objetivo y la mira roja). (C) El objeto objetivo se arrastra hasta el centro de la mira roja haciendo clic derecho y moviéndola, seguido de pulsar el botón Set situado junto al botón Shift (el recuadro rojo discontinuo resalta el botón). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Determinación de la estructura de la apoferritina. (A) Imagen estructural. Mapa de resolución local del promedio final del subtomograma. La textura parece uniforme, con características nanométricas dispuestas y repetidas en todo el campo visual. (B) Mapeo cuantitativo resuelto espacialmente. Un mapa circular de falso color de la misma o de una región nanoestructurada relacionada. Los colores varían desde azul/verde hasta amarillo/rojo, correspondientes a los valores numéricos mostrados en la escala de colores a continuación (aproximadamente de 2,5 a 3,5 en unidades arbitrarias). La distribución heterogénea del color indica variación espacial en una propiedad medida (por ejemplo, altura, grosor, índice de refracción o respuesta mecánica/óptica) a lo largo de la muestra. (C) Caracterización espectral o funcional global. Curva de correlación de capas de Fourier (FSC) utilizada para la estimación de resolución. La resolución final de 2,8 Å se indica con la línea discontinua en FSC = 0,143. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discussion

Los procedimientos para la preparación de muestras criogénicas y la recogida de datos por tomografía electrónica deben adaptarse al tipo específico de muestra. La estrategia experimental descrita aquí es muy adecuada para macromoléculas biológicas, complejos proteicos y orgánulos pequeños. Estas muestras pueden ser vitrificadas directamente en rejillas electromagnéticas, y su espesor relativamente pequeño asegura una transmisión eficiente de electrones y la adquisición de imágenes de alto contraste. Idealmente, el espesor de la muestra no debe superar los 200 nm.

Para muestras congeladas por inmersión, generalmente se prefiere una dimensión lateral inferior a 10 μm para minimizar la formación de hielo cristalino, lo que puede comprometer la integridad estructural. Para muestras más grandes, la congelación a alta presión o la inclusión de crioprotectores, como el glicerol, en el tampón pueden retrasar la nucleación^{del hielo 23}. Sin embargo, para satisfacer los requisitos de grosor del TEM, a menudo es necesario un adelgazamiento adicional. Entre los enfoques de adelgazamiento disponibles, el fresado por haz de iones enfocado^{(FIB) 24}es el más adoptado debido a su precisión y daño mínimo, produciendo láminas adecuadas para crio-ET de alta resolución.

Durante la recogida de datos de lamelas, es fundamental maximizar la utilización de lamelas. La implementación de la adquisición de desplazamiento de imagen de haz puede reducir la necesidad de pasos repetitivos de enfoque y seguimiento, aumentando así el rendimiento de recogida de datos. Aunque no se describe en detalle aquí, esta técnica ha sido ampliamente explicada en la metodología PACEtomo.

Actualmente, las opciones de software más populares para la recogida de datos tomográficos incluyen Tomografía (Thermo Fisher Scientific) y SerialEM. La tomografía es una solución comercial con flexibilidad limitada para la personalización, mientras que SerialEM, desarrollado por David Mastronarde en la Universidad de Colorado Boulder, es un software de código abierto que soporta automatización basada en scripts. Sin embargo, aprovechar plenamente las capacidades de SerialEM requiere una curva de aprendizaje considerable. En este estudio, presentamos un flujo de trabajo simplificado que aprovecha la interfaz gráfica de SerialEM, eliminando la necesidad de scripts o configuraciones basadas en Python mientras permite la adquisición de datos nocturna sin supervisión.

Un desafío frecuente que se encuentra durante la adquisición de datos tomográficos con este método es el seguimiento inexacto, que puede llevar a una serie de inclinación incompleta con ángulos ausentes o complicar la alineación posterior. Para mitigar estos problemas, los parámetros de seguimiento deben optimizarse en función del contraste de la muestra y la estabilidad de la fase de inclinación. Las estrategias efectivas incluyen ajustar el tiempo de exposición en las posiciones de seguimiento para asegurar la claridad de la imagen, separar físicamente las posiciones de seguimiento y enfoque para reducir el daño acumulado por radiación, y reducir la ampliación de seguimiento cuando la estabilidad de la etapa es pobre para facilitar una correspondencia fiable de patrones. En conjunto, estos ajustes son esenciales para lograr un rendimiento robusto de seguimiento en diversas condiciones experimentales. En este trabajo, utilizamos la apoferritina como muestra modelo. Bajo la premisa de probar y corregir la luz paralela, utilizamos las funciones integradas de SerialEM para recopilar datos de alta calidad para crio-ET y realizar cálculos subtomográficos sobre las muestras de ferritina, obteniendo finalmente la estructura final a 2,8 Å.

Este método se desarrolló para ampliar la aplicabilidad de microscopios electrónicos de 200 kV para crio-ET de alta resolución. Lograr dicha resolución depende fundamentalmente de obtener datos de imagen de alta calidad, lo que a su vez requiere condiciones de iluminación precisas. Para ello, realizamos una alineación precisa de iluminación paralela como paso preparatorio crítico. El procedimiento de alineación descrito aquí está diseñado específicamente para TEM equipados con un sistema de lentes de dos condensadores, como el Thermo Fisher Scientific Talos Arctic y el Glacios. A diferencia de los instrumentos con una tercera lente condensadora (C3), estos sistemas restringen la condición de iluminación paralela a un único valor específico de excitación de la lente C2. Esta restricción inherente requiere una alineación excepcionalmente precisa del haz de electrones para posicionar la imagen fuente en el plano focal frontal de la lente objetivo superior, un requisito previo para un rendimiento óptimo de imagen. Nuestros resultados posteriores de procesamiento de datos demuestran que, tras esta alineación, la calidad de adquisición de datos obtenida con este microscopio de 200 kV para las muestras analizadas es casi comparable a la que normalmente se espera de un instrumento de 300 kV.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTCryoTM cuadrícula niti	Najingdingxin	M04240922A	Utilizado para la preparación de muestras criogénicas
apoferritina	Biortus	BP17854-00A	Utilizado para la preparación de muestras criogénicas
Rejilla de rejilla cruzada	Agar Scientific	AGS106	Utilizado para determinar las condiciones de luz paralela
Glacios2	Thermo Fisher	9959084	Utilizado para la recopilación de datos de tomo
Papel de filtro número 2, 55 mm	Whatman	10311807	Papel secante
PELCO eeasyGLOW	TED PELLA	91000-01020	Usado para descarga luminosa
Red Quantifoil Cu	quantifoil	N1-C14nCu30-01	Utilizado para la preparación de muestras criogénicas
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher	230101164	Utilizado para la preparación de muestras criogénicas