Un procedimiento flexible para realizar FISH de telómeros e inmunofluorescencia en células que expresan proteínas fluorescentes

Resumen

Este protocolo describe un método para combinar FISH de telómeros (nativos o desnaturalizantes) con inmunofluorescencia y/o visualización de una proteína fluorescente.

Resumen

La visualización de telómeros mediante hibridación fluorescente in situ (TelFISH) ha sido durante mucho tiempo una herramienta esencial en los experimentos de biología de telómeros. La combinación de TelFISH con inmunofluorescencia (IF) también es un método bien establecido (IF-TelFISH), por ejemplo, para identificar focos inducidos por disfunción de telómeros, donde los telómeros se colocalizan con 53BP1. Más recientemente, el FISH de telómeros nativos (nTelFISH) se ha convertido en una herramienta importante para ensayar el alargamiento alternativo de los telómeros, un mecanismo de mantenimiento de los telómeros utilizado en algunas células tumorales. La expresión de proteínas fluorescentes también es una herramienta esencial en biología celular, ya que permite la visualización de proteínas y estructuras que pueden permanecer indetectables por otros métodos. Debido a que los tampones FISH desnaturalizan las proteínas, realizar el ensayo en células con una proteína fluorescente (FP) expresada da como resultado la pérdida de la señal de FP. Aquí se describe un método para integrar IF y telómeros FISH en células con una proteína fluorescente expresada que conserva la señal FP incluso después de FISH. Se proporcionan alternativas para la desnaturalización y los telómeros nativos FISH en combinación con varios escenarios de FI y PF. En conjunto, este protocolo ofrece un marco flexible para explorar la biología de los telómeros tanto en células normales como tumorales.

Introducción

Los organismos con cromosomas lineales deben lidiar con dos problemas. Primero, debido al problema de replicación final, los extremos de los cromosomas se erosionan ligeramente cada vez que se replica el ADN. En segundo lugar, las células deben ser capaces de distinguir los extremos naturales del ADN de las roturas del ADN. Los telómeros evolucionaron como una solución a estos problemas. A través de la acción de la ribonucleoproteína telomerasa, los cromosomas se alargan mediante la adición de repeticiones cortas en tándem-TTAGGG en humanos. Estas repeticiones están unidas por el complejo shelterina, que oculta el extremo del cromosoma de la maquinaria de reparación del daño del ADN celular¹. Los telómeros cortos o disfuncionales conducen a la senescencia celular y a los fenotipos^{de envejecimiento 2}, mientras que el escape de la crisis de los telómeros es un hito importante en la tumorigénesis³. Por estas razones, la biología de los telómeros es de especial interés para comprender la salud y la enfermedad humanas.

La hibridación fluorescente in situ (FISH) de telómeros ha sido durante mucho tiempo un método importante para visualizar telómeros en células de interfase o diseminaciones de metafase⁴. Durante décadas, el FISH de los telómeros se ha acoplado con la tinción de inmunofluorescencia (IF) 53BP1 para identificar focos inducidos por disfunción de los telómeros (TIF), un marcador de telómeros disfuncionales y sin tapa ^5,6. De manera similar, un sello distintivo de los tumores que utilizan el alargamiento alternativo de los telómeros (ALT) para el mantenimiento de los telómeros es la asociación de telómeros con cuerpos nucleares de PML para formar cuerpos de PML asociados a ALT o APB⁷. Los APB se pueden analizar combinando el telómero FISH con la tinción PML IF. Por lo tanto, IF-FISH es una herramienta bien establecida en la biología de los telómeros.

Aquí, el uso de IF-FISH se ha extendido de dos maneras. Primero, IF-FISH se realiza en células con proteínas fluorescentes expresadas (FP). La expresión de proteínas marcadas con fluorescencia se ha convertido en una herramienta omnipresente en la biología celular. Expresar una proteína etiquetada puede ser la única opción para visualizar una proteína para la que no existen anticuerpos buenos. Por ejemplo, el cromocuerpo de actina nuclear marcado con GFP (NAC-GFP) expresa revela la dinámica de la actina nuclear⁸. Este reactivo ha abierto nuevas oportunidades en la exploración de la f-actina nuclear, que alguna vez se consideró un tema controvertido. Mientras que los FP como GFP y mCherry suelen mantener la actividad de fluorescencia después de la fijación, la formamida en los tampones de hibridación FISH los oscurecerá⁹. Para evitar este problema, este protocolo ofrece la innovación de un "refuerzo" anti-FP marcado con fluoróforo en el paso secundario de la tinción de IF. El brillo del fluoróforo no se ve afectado por la formamida, lo que permite IF-FP-FISH.

En segundo lugar, la IF se realiza junto con la FISH de telómeros nativos (nTelFISH), un diagnóstico importante para el estado de ALT. En la desnaturalización de FISH, se debe usar algún método para derretir las hebras de ADN¹⁰ (por ejemplo, calor o álcali), lo que permite que la sonda acceda al ADN que normalmente es de doble hebra. Por el contrario, el FISH nativo no incluye un paso de desnaturalización, por lo que la sonda solo puede acceder al ADN que ya es monocatenario. El telómero nativo FISH detecta específicamente repeticiones de telómeros de hebra C monocatenaria, otro sello distintivo de ALT en células tumorales^11,12. El acoplamiento de este ensayo con la tinción IF-FP nos permite abordar nuevas preguntas para comprender el mecanismo de ALT, que ahora se considera un fuerte candidato para terapias tumorales dirigidas.

El protocolo descrito aquí se puede usar en un estilo de "elige tu propia aventura" para teñir cualquier combinación de IF, FP y telómeros nativos o desnaturalizantes FISH. Debido a que el protocolo es altamente configurable, el tiempo puede variar sustancialmente. En términos generales, se requiere tiempo práctico en cuatro días, pero estos días pueden no ser secuenciales. Las estimaciones del tiempo requerido para completar un flujo de trabajo típico de FISH desnaturalizante se dan en la Figura 1. Los FISH nativos no necesitan hibridarse de la noche a la mañana, por lo que potencialmente se puede eliminar un paso nocturno (combinando el Día 2 y el Día 3) si es factible un largo día en el banco.

Un microscopio confocal típico se adaptará a la obtención de imágenes de cuatro canales de color: en términos generales, azul, verde, rojo y rojo lejano. Se muestran cuatro ejemplos de posibles combinaciones de cuatro colores, pero las posibles permutaciones son infinitas. Es posible utilizar dos anticuerpos IF o dos FP expresados con el mismo éxito. El protocolo es sencillo y robusto. Cualquier anticuerpo que produzca buenos resultados de ayuno intermitente por sí solo es adecuado. Si bien aquí solo se incluyen sondas de telómeros para FISH, la desnaturalización de FISH con una sonda de centrómero también produce buenos resultados. Por lo tanto, este protocolo ofrece un amplio grado de flexibilidad para responder preguntas importantes en biología nuclear.

Protocolo

Antes de comenzar, considere el microscopio, la línea celular que expresa FP y las sondas y anticuerpos disponibles. El azul se usa típicamente para una tinción de ADN como DAPI, ya que los fluoróforos azules generalmente no son brillantes. Se pueden usar anticuerpos secundarios azules si es necesario. Si las células expresan GFP, se puede usar una sonda FISH marcada con un fluoróforo rojo junto con un anticuerpo secundario para IF marcado con AF-647. Alternativamente, para obtener imágenes de células que expresan mCherry, se puede seleccionar un anticuerpo secundario IF marcado con AF-488 y una sonda FISH marcada con AF-647. En la Figura 2 se muestran ejemplos de cuatro posibles combinaciones IF-FP-FISH, y pretenden ser una guía para fomentar la flexibilidad del diseño experimental. Es importante elegir FISH nativo o desnaturalizante, ya que estos métodos no se pueden combinar. Aquí se incluye un método confiable para lavar los cubreobjetos con ácido para permitir la adherencia celular. Esto se puede completar en cualquier momento antes de su uso, y los cubreobjetos estériles se pueden almacenar indefinidamente. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Lavado con ácido de cubreobjetos

NOTA: Los cubreobjetos de vidrio deben limpiarse y lavarse con ácido para permitir que las células cultivadas se adhieran. Para el crecimiento en placas de 12 pocillos, los cubreobjetos redondos de 18 mm son ideales. Consulte con la instalación del núcleo de microscopía para determinar si se prefieren los cubreobjetos # 1 o # 1.5. Los tiempos indicados para limpiar los cubreobjetos no son críticos, pero no escatime en el lavado con ácido.

1. Use pinzas de cubreobjetos (Figura 3A) para colocar los cubreobjetos en los bastidores de modo que sus superficies no se toquen. Coloque cubreobjetos adicionales en diagonal para aumentar la capacidad si es necesario (Figura 3B). Coloque varias rejillas cómodamente en el plato de tinción (Figura 3C).
2. Llena el plato manchador con agua y una pequeña cantidad de detergente. Baje suavemente las rejillas con los cubreobjetos en el plato.
3. Agite los cubreobjetos en el agua jabonosa durante 30 minutos con un balancín o nutator.
4. Levante las rejillas de cubreobjetos del plato de tinción. Deseche el agua jabonosa.
5. Enjuague el plato de tinción y llénelo con agua desionizada. Regrese las rejillas de cubreobjetos al agua limpia y colóquelas en un balancín para agitar suavemente durante 5 min.
6. Repita el enjuague con dos cambios adicionales de agua limpia desionizada, para un total de tres enjuagues.
7. Levante las rejillas de cubreobjetos del plato de tinción. Agregue 1 N HCl al plato.
   PRECAUCIÓN: El HCl es cáustico. Manipule una campana extractora y use equipo de protección personal. Baje con cuidado los cubreobjetos en la solución ácida. Asegúrese de que el HCl 1 N cubra completamente los cubreobjetos. Coloque la tapa en el plato para teñir.
8. Coloque el plato de tinción que contiene los cubreobjetos y la solución ácida en el tanque de un sonicador de baño. Sonicar durante 15 min a 55 °C.
9. Deje los cubreobjetos en el baño de ácido durante la noche.
10. Retire con cuidado las rejillas de cubreobjetos del plato de tinción al día siguiente. Deseche el HCl 1 N de acuerdo con los protocolos de seguridad institucionales.
11. Enjuague el plato de tinción y llénelo con agua desionizada. Regrese las rejillas de cubreobjetos al agua limpia y colóquelas en un balancín para agitar suavemente durante 5 min.
12. Repita el enjuague con dos cambios más de agua limpia desionizada, para un total de tres enjuagues.
13. Levante las rejillas de cubreobjetos del plato de tinción. Vacíe el plato y llénelo con etanol al 70%. Regrese las rejillas de cubreobjetos al plato y agite suavemente durante 5 min.
14. Levante las rejillas de cubreobjetos del plato de tinción. Vacíe el plato y llénelo con etanol al 100%. Regrese las rejillas de cubreobjetos al plato y agite suavemente durante 5 min.
15. Lleve el plato con etanol al 100% y los cubreobjetos a una campana de cultivo de tejidos. En la campana, retire las rejillas de cubreobjetos del plato y déjelas secar al aire.
16. Vacíe el plato y devuélvalo los estantes de cubreobjetos. Almacene con la tapa puesta para mantener la esterilidad. El plato de tinción no es hermético; Si los cubreobjetos se dejan en etanol, eventualmente se evaporará. Los cubreobjetos seguirán siendo utilizables.

2. Celdas de recubrimiento en cubreobjetos

NOTA: El manejo de cubreobjetos requiere práctica. Es más fácil comenzar con una placa de 6 pocillos hasta que esté seguro. Cuando use una placa de 6 pocillos, duplique los volúmenes de lavado dados para las placas de 12 pocillos.

1. Cultive células sanas y en crecimiento que expresen la proteína de interés etiquetada con GFP o mCherry (varios FP rojos o verdes son adecuados; consulte las notas en la Tabla de materiales). Las células de osteosarcoma U2OS, que usan ALT para el mantenimiento de los telómeros, se usan en los ejemplos que se muestran.
   1. Utilice células transfectadas transitoriamente o líneas celulares con expresión estable de FP. Si el experimento requiere tratamiento farmacológico o transfección, considere la confluencia deseada en la fijación (generalmente 70% -80%), la duración del tratamiento y la tasa de crecimiento celular para calcular el número apropiado de células para colocar en placa por cubreobjetos.
2. Prepare cubreobjetos en la campana de cultivo de tejidos para mantener la esterilidad. A cada pocillo de una placa de 12 pocillos, agregue 1 ml de PBS estéril. Con pinzas de cubreobjetos, coloque un cubreobjetos limpio y lavado con ácido en cada pocillo. Agite suavemente a mano durante unos segundos.
3. Aspirar PBS. Agregue 1 ml de PBS estéril fresco por pocillo. Deja el plato a un lado.
4. (Opcional) Cubra los cubreobjetos con fibronectina para mejorar la adhesión celular. Muchas líneas celulares adherentes se adhieren bien a los cubreobjetos lavados con ácido cuando se siembran durante al menos 18 h antes de la fijación. Si las células no se adhieren bien o requieren fijación poco después del recubrimiento, cubra los cubreobjetos para promover la adhesión.
   1. Preparar una solución de 5 μg/ml de fibronectina en PBS estéril.
   2. Aspira PBS de los cubreobjetos. Aplique suavemente aproximadamente 300 μL de solución de fibronectina a cada cubreobjetos, formando una gota retenida por la tensión superficial.
   3. Incubar durante varias horas a 37 °C o durante la noche a 4 °C.
   4. Enjuague varias veces con PBS, sosteniendo los cubreobjetos en un cambio final de PBS. Deje el plato a un lado mientras prepara las celdas.
   5. Si la fibronectina no es adecuada, considere la poli-L-lisina, el colágeno o la gelatina como alternativas.
5. Tripsinizar las células y diluir un número apropiado en 12 ml de medio de cultivo según el diseño experimental y la densidad celular deseada en la fijación.
6. Aspire PBS de los cubreobjetos y agregue 1 ml de la suspensión celular por pocillo.
7. Coloque las células en la incubadora.
8. Tratar las células según sea necesario con fármacos, ARNip u otros reactivos de acuerdo con el diseño experimental. Crece hasta la confluencia deseada.

3. Tinción IF-FP

NOTA: Durante todo el protocolo, no deje que los cubreobjetos se sequen. Es aconsejable pipetear con una mano y aspirar las soluciones con la otra para que los cubreobjetos estén fuera de la solución durante el menor tiempo posible. Pipetee las soluciones suavemente contra la pared del pozo, no directamente sobre el cubreobjetos. Manipule los cubreobjetos con firmeza pero con suavidad con fórceps. Es fácil romper un cubreobjetos agarrándolo con demasiada fuerza. Al principio, planifique cubreobjetos duplicados en caso de rotura. Con la experiencia, los cubreobjetos rotos se convierten en algo raro. Los cubreobjetos no se pueden recoger de un pozo seco. Los cubreobjetos deben cubrirse con un amortiguador para ser recogidos.

1. Retire los medios y fije las celdas con el fijador de su elección. No es necesario enjuagar las células antes de la fijación. Use 1 ml por pocillo en una placa de 12 pocillos o 2 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos.
   1. Opción 1: Use formaldehído al 4% en PBS.
      PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico. Manipule con guantes y deseche adecuadamente. Preparar fresco con formaldehído al 16% sin metanol y 10 veces el caldo PBS. Fijar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
   2. Opción 2: Usar formaldehído al 4% en tampón de citoesqueleto con sacarosa (CBS).
      NOTA: Este tampón es el preferido para preservar la estructura citoesquelética¹³. El CBS tiene una concentración final de 10 mM MES pH 6,1, 138 mM de KCl, 3 mM de MgCl₂, 2 mM de EGTA y 0,32 M de sacarosa. Para preparar el fijador, haga un stock CBS 2x con 20 mM MES pH 6.1, 276 mM KCl, 6 mM MgCl₂, 4 mM EGTA. Prepare un caldo de sacarosa de 1,28 M por separado. Almacenar ambos stocks a 4 °C. Para fijador de trabajo fresco, mezcle 1 volumen de formaldehído sin metanol al 16%, 1 volumen de sacosa y 2 volúmenes 2x CBS. Fijar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
   3. Opción 3: Fijar con metanol a -20 °C. Recomendado para dianas de anticuerpos de ácidos nucleicos (p. ej., ssDNA, G-quadruplexes, híbridos de ARN-ADN). Fijar durante 5 min a -20 °C.
2. Aspirar fijador y desechar de acuerdo con las políticas institucionales.
3. Enjuague los cubreobjetos varias veces con PBS.
   1. PUNTO DE PARADA: Los cubreobjetos fijos pueden almacenarse en PBS a 4 °C durante varios días con una pérdida mínima de señal. Para un almacenamiento más prolongado, deshidrate al 100% de etanol (2 min en etanol al 70%, 2 min en etanol al 90%, almacene en etanol al 100%), selle la placa con film de laboratorio y guárdela a -20 °C. Los cubreobjetos se pueden almacenar de esta manera durante semanas o meses. Cuando esté listo para teñir, rehidrate los cubreobjetos (2 min en etanol al 90%, 2 min en etanol al 70%, 15 min en PBS) y continúe con el siguiente paso.
4. Permeabilizar los cubreobjetos en Triton X-100 al 0,5% en PBS durante 5 min a 4 °C. Realice este paso en el plato.
5. Enjuague los cubreobjetos varias veces con PBS.
6. Prepare la cámara humidificada (Figura 3D). Coloque toallas de papel húmedas en el fondo de la cámara. Para crear un soporte para la tinción, etiquete la parte superior de una tapa de una placa de 12 pocillos para que se corresponda con los cubreobjetos.
   1. Cubra la tapa con película de laboratorio para que las etiquetas permanezcan visibles. Asegúrese de que la cámara sea hermética a la luz con una tapa ajustada. Cubra con papel de aluminio si es necesario (Figura 3E).
7. Pipetee gotas de 75 μL de 100 μg/mL de ARNasa A en PBS sobre el soporte marcado. Levante suavemente cada cubreobjetos y frote el borde en el tejido de laboratorio para eliminar el exceso de tampón. Invierta los cubreobjetos en las gotas de ARNasa A (con la celda hacia abajo). Coloque el soporte en la cámara humidificada y cierre la tapa. Incubar durante 45 min a 37 °C.
8. Agregue PBS fresco a la placa de 12 pocillos. Vuelva a colocar los cubreobjetos en la placa, con la celda hacia arriba. Enjuague varias veces con PBS.
9. Bloquee durante 30 minutos o más a temperatura ambiente. Limpie la solución de ARNasa del soporte cubierto con película. Pipetear gotas de 75 μL de suero de burro al 20% en PBS sobre la película. Invierta los cubreobjetos en el búfer de bloqueo (con la celda hacia abajo).
10. Prepare el anticuerpo primario.
    1. Utilice 75 μl por cubreobjetos. Prepare un 10 % más para evitar errores de pipeteo.
    2. Diluir el anticuerpo en suero de burro al 5%. Determinar las diluciones de anticuerpos empíricamente. Una dilución de 1:100 es un punto de partida razonable.
    3. Mientras bloquea, prepare un segundo soporte marcado para la incubación de anticuerpos primarios. Cubra la tapa con una película y aplique gotas de 75 μL del anticuerpo diluido en los puntos designados.
11. Al final del paso de bloqueo, transfiera los cubreobjetos a las gotas de anticuerpos (con la celda hacia abajo). Coloque el soporte en la cámara humidificada, cierre la tapa e incube durante al menos 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C.
12. Agregue PBS fresco a la placa de 12 pocillos. Vuelva a colocar los cubreobjetos en la placa, con la celda hacia arriba. Lavar en PBS tres veces durante 5 minutos cada una a temperatura ambiente con balanceo.
13. Durante el lavado final, prepare anticuerpos secundarios.
    1. Utilice 75 μl por cubreobjetos. Prepare un 10 % más para evitar errores de pipeteo.
    2. Se recomienda una dilución de 1:400 para los anticuerpos secundarios fluorescentes y los anticuerpos de refuerzo GFP/RFP. Ajústelo según sea necesario en función de la experiencia con el objetivo.
    3. Diluir los anticuerpos secundarios en suero de burro al 5%. Aplicar gotas de 75 μL en los puntos apropiados del soporte etiquetado.
14. Después del lavado, transfiera los cubreobjetos a las gotas de anticuerpos secundarios (con la célula hacia abajo). Incubar durante al menos 30 min a temperatura ambiente en la cámara humidificada sellada.
15. Agregue PBS fresco a la placa de 12 pocillos. Vuelva a colocar los cubreobjetos en la placa, con la celda hacia arriba. Lavar en PBS tres veces durante 5 minutos cada una a temperatura ambiente con balanceo.

4. Volver a fijar y deshidratar

1. Prepare formaldehído al 4% en PBS a temperatura ambiente para volver a fijarlo. Use formaldehído para este paso, incluso si se usó metanol para la fijación inicial. Retire el lavado final de PBS y vuelva a fijar las células durante 15 minutos con un balanceo suave.
2. Aspirar el fijador y desecharlo de acuerdo con las políticas institucionales.
3. Enjuague los cubreobjetos varias veces con PBS.
4. Deshidrate los cubreobjetos y séquelos al aire para prepararlos para la hibridación:
   1. Incubar en etanol al 70% durante 2 min.
   2. Incubar en etanol al 90% durante 2 min.
   3. Incubar en etanol al 100% durante 2 min.
   4. Después del etanol al 100%, coloque los cubreobjetos con la celda hacia arriba sobre papel de filtro etiquetado para mantener la orientación. Deje que se sequen al aire por completo mientras prepara la sonda FISH.

5. PESCADO (OPCIÓN 1): PESCADO DESNATURALIZANTE

1. Prepare dos soportes de aluminio (ver Figura 3F).
   1. Dobla un trozo de papel de aluminio en cuartos para crear cuatro capas. Asegúrese de que el lado opaco esté hacia afuera.
   2. Recorta el papel de aluminio doblado para que quepa dentro de la tapa de una placa de 12 pocillos. Con una toallita de laboratorio, frote el papel de aluminio contra el interior de la tapa para que las crestas de la tapa graben un patrón en el papel de aluminio. Esto creará crestas que evitarán que los cubreobjetos se deslicen entre sí durante los pasos posteriores.
   3. Prepare dos de estos soportes. Pueden limpiarse y reutilizarse en experimentos posteriores.
2. Diluir la sonda de 10 μM 1:50 en tampón de hibridación (formamida desionizada al 70%, Tris 10 mM, pH 7,4, 0,5% 10× solución bloqueante de Roche). Utilice 75 μl de esta sonda diluida por cubreobjetos y prepare un 10 % más para compensar la pérdida de pipeteo. La concentración final de la sonda debe ser de 200 nM.
3. Precaliente un bloque de calor a 90 °C y un termociclador a 85 °C.
4. Desnaturalizar los cubreobjetos: Coloque los cubreobjetos secados al aire con la celda hacia arriba sobre uno de los soportes de aluminio preparados. Coloque suavemente el papel de aluminio en el bloque del termociclador y cierre la tapa. Incubar durante 5 min para desnaturalizar.
5. Simultáneamente, caliente la sonda diluida en el bloque de calor a 90 °C durante 5 min.
6. Pipetear gotas de 75 μL de la sonda desnaturalizada sobre el segundo soporte de lámina preparado. Asegúrese de que el lado opaco de la lámina esté hacia arriba para permitir gotas bien formadas. Si el lado brillante está hacia arriba, la sonda se extenderá y perderá tensión superficial.
7. Invierta los cubreobjetos desnaturalizados en las gotas de la sonda, colocándolas con la celda hacia abajo.
8. Transfiera el soporte de aluminio con sonda y cubreobjetos al bloque del termociclador a 85 °C e incube durante 5 min. Use una espátula para ayudar con la transferencia. Muévase con precaución para evitar golpear o mover los cubreobjetos.
9. Mueva la lámina con cubreobjetos y la sonda a una cámara humidificada. Cubra con la tapa e incube durante la noche a temperatura ambiente.

6. PESCADO (OPCIÓN 2): PESCADO nativo

1. Diluir la sonda de 10 μM 1:200 en tampón de hibridación (formamida desionizada al 70%, Tris 10 mM, pH 7,4, 0,5% 10× solución bloqueante de Roche). La concentración final de la sonda es de 50 nM. Utilice 75 μl por cubreobjetos y prepare un 10 % más para evitar errores de pipeteo.
2. Aplique gotas de 75 μL de sonda diluida en los puntos designados en el soporte cubierto con película.
3. Invierta los cubreobjetos desnaturalizados en las gotas de 75 μL de la sonda, colocándolas con la celda hacia abajo.
4. Coloque el soporte en una cámara humidificada y cierre la tapa. Incubar durante al menos 45 min a temperatura ambiente. La incubación puede extenderse hasta la noche si se prefiere.

7. Lavado y montaje

NOTA: El medio de montaje óptimo depende de la apertura numérica del objetivo del microscopio. Consulte el centro de microscopía local para obtener recomendaciones. Una opción adecuada puede ser ProLong Glass con NucBlue, que tiene un índice de refracción de 1,52. Sin embargo, un medio de montaje alternativo puede ser más apropiado dependiendo del microscopio en cuestión.

1. Devuelva los cubreobjetos a la placa de 12 pocillos para lavarlos. Inviértelos para que queden con la celda hacia arriba.
2. Lavar 3× 10 min en formamida al 70%/10 mM Tris, pH 7,5.
   PRECAUCIÓN: La formamida es tóxica; Disponer de él de acuerdo con las políticas institucionales.
3. Lavar 3× 5 min en TNT (0,05 M Tris/0,15 M NaCl/0,05% Tween-20, pH 7,5).
4. Enjuague varias veces en PBS. Si no se incluye una tinción de ADN en el medio de montaje, considere agregar DAPI en el lavado final. Para teñir con DAPI, agregue DAPI de 300 nM a PBS, aplique a los cubreobjetos e incube durante 5 min. Deseche la solución DAPI de acuerdo con las pautas institucionales.
5. Monte los cubreobjetos en portaobjetos de vidrio con una gota de medio de montaje. Invierta los cubreobjetos en la caída: con la celda hacia abajo.
6. Deje que el medio de montaje se cure durante la noche antes de la obtención de imágenes.

Resultados

Los resultados típicos de este protocolo se muestran en la Figura 4. Si se ejecuta correctamente, la morfología celular se mantendrá bien y las señales fluorescentes serán brillantes. El FISH de los telómeros desnaturalizantes debería revelar un patrón de docenas de puntos en cada núcleo que representan cada telómero (ver Figura 4, Ejemplos 1 y 2). Los focos de telómeros deben estar presentes casi exclusivamente en el núcleo, aunque a veces se produce tinción de telómeros citoplasmáticos, especialmente en líneas celulares ALT. Las señales de telómeros resultantes tienden a ser extremadamente brillantes, tanto que se debe tener cuidado para evitar que la señal de los telómeros se filtre en otros canales de detección. En las líneas celulares ALT, los telómeros a menudo se agrupan en cuerpos PML¹⁴, lo que resulta en menos focos de lo que normalmente se esperaría. Esta agrupación se puede observar en la Figura 4, Ejemplo 2.

En las líneas celulares que usan ALT para el mantenimiento de los telómeros, el telómero nativo FISH detecta el ssDNA telomérico que es un sello distintivo de ALT^11,12. No se espera que todos los núcleos tengan ssDNA de telómeros, ni que haya más de un pequeño número de puntos en un solo núcleo (ver Figura 4, Ejemplos 3 y 4). La señal de FISH de telómeros nativos no será tan brillante como la de FISH de telómeros desnaturalizantes. La línea celular de osteosarcoma U2OS es un buen control positivo para la FISH nativa. No se espera que se observe ssDNA de telómeros en líneas celulares con telómeros mantenidos por telomerasa.

Tanto para la desnaturalización como para la FISH nativa, la fluorescencia nucleolar fuerte es artifactual. Si se observa una señal nucleolar excesiva, intente usar una solución nueva de ARNasa A o extender el tratamiento con ARNasa A¹⁵ (paso 3.8 del protocolo). Para los experimentos FISH de telómeros nativos que utilizan células con estado ALT desconocido, se utiliza una línea celular ALT positiva como U2OS para calibrar la configuración de detección.

Las observaciones de PF en experimentos IF-FP-FISH pueden compararse fácilmente con experimentos de imágenes de células vivas para su validación. Si se observan discrepancias, pruebe con diferentes condiciones de fijación. La fijación en el tampón CSB (Paso 3.1.2 del protocolo) puede ser beneficiosa para preservar las estructuras celulares, revelando una localización más precisa de FP¹³.

La tinción de inmunofluorescencia varía ampliamente según la proteína de interés. Los resultados del ayuno intermitente deben compararse con muestras preparadas sin FISH para evaluar el impacto del protocolo FISH en la localización e intensidad de la proteína de interés. En general, los experimentos IF-FP-FISH son adecuados para el recuento de focos, pero las intensidades pueden no ser cuantitativas⁶.

Figura 1: Ejemplo de flujo de trabajo con duraciones estimadas. Es posible que se requiera un día adicional si la incubación de anticuerpos primarios se realiza durante la noche. En el caso de FISH nativo, los días 2 y 3 a veces se combinan, aunque esto da como resultado un tiempo de banco prolongado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ejemplos de combinaciones experimentales exitosas utilizadas con imágenes de cuatro colores. Los ejemplos 1 y 2 demuestran la desnaturalización de los telómeros FISH, mientras que 3 y 4 utilizan FISH nativos. Tenga en cuenta que este protocolo es útil si se inmunotiñen dos proteínas diana (Ejemplo 1), combinando una tinción FP y una tinción IF (Ejemplos 2 y 4) o dos FP (Ejemplo 3). Los resultados representativos de estos experimentos se dan en la Figura 4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Equipo utilizado en este protocolo. (A) Pinzas de cubreobjetos. Si bien se pueden usar pinzas rectas para manejar cubreobjetos, los fórceps de cubreobjetos en ángulo facilitan mucho la tarea. (B) Cubreobjetos para lavar. Tenga en cuenta que, además de las estanterías en línea recta, los cubreobjetos también están inclinados entre las ranuras adyacentes para aumentar la capacidad. (C) Cuatro estantes de cubreobjetos en un plato para teñir. Un plato para teñir vidrio contiene docenas de cubreobjetos en gradillas y es impermeable al lavado ácido HCl. (D) Una cámara humidificada preparada. El exterior está cubierto con papel de aluminio para crear un ambiente oscuro, preservando los fluoróforos. Las toallas de papel húmedas en la parte inferior proporcionan humedad. (E) La cámara humidificada sellada. Una tapa hermética es esencial para evitar que se seque. (F) Hacer el soporte de papel de aluminio. El estampado de crestas en la lámina recortada ayuda a evitar que los cubreobjetos se deslicen entre sí durante el paso de desnaturalización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Resultados representativos de experimentos de imágenes de cuatro canales, incluidos IF, FISH y FP expresados. Los paneles representan los resultados reales de los experimentos descritos en la Figura 2. DAPI tiñe el ADN, nAC-GFP resalta la f-actina nuclear, TelFISH y TRF2-mCherry marcan los telómeros, la inmunotinción PML marca los cuerpos nucleares de PML y nTelFISH revela el ssDNA telomérico. Todas las células son células de osteosarcoma U2OS. Las imágenes se adquirieron en un microscopio confocal con capacidad de superresolución. Las imágenes del Ejemplo 1 se adquirieron con microscopía confocal de barrido láser; todas las demás imágenes se adquirieron con microscopía de iluminación estructurada. Todas las barras de escala representan 5 μM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Los experimentos con IF-FISH han sido durante mucho tiempo un pilar en el campo de los telómeros como ensayo para el estrés de los telómeros o la detección de ALT ^5,6,16. Aquí, el protocolo se amplía para incluir una proteína fluorescente. Además, la opción de FISH de telómeros nativos se ofrece como un ensayo ALT ortogonal¹¹. Este protocolo es sencillo de realizar y produce resultados satisfactorios de forma fiable.

Al operar en cubreobjetos con gotas de anticuerpos o sondas PNA, este protocolo está diseñado para ser ahorrativo. El uso de gotas conserva reactivos valiosos. Por el contrario, las alternativas como las correderas con cámara son caras y ofrecen menos flexibilidad. Si bien el manejo de cubreobjetos requiere práctica para desarrollar competencia, los ahorros de costos hacen que la inversión de tiempo valga la pena. Cabe señalar que no se recomiendan las gotas de reactivo de más de 75 μL. Las gotas más grandes simplemente hacen que los cubreobjetos se deslicen y no mejoran los resultados.

La expresión de nAC-GFP es una herramienta indispensable para la visualización de la f-actina⁸ nuclear, como se ve en la Figura 4. Existen muchos otros reactivos marcados que pueden ayudar a responder preguntas biológicas importantes. Por ejemplo, el sistema de plásmidos FUCCI se puede usar para visualizar el ciclo celular, y el uso de este protocolo podría combinarse con el telómero FISH¹⁷. Un enfoque diferente para analizar el ciclo celular podría usar el cromocuerpo PCNA para obtener información del ciclo celular¹⁸. Dependiendo de la pregunta que se haga, muchos reactivos etiquetados con FP están disponibles comercialmente.

Aquí, este protocolo se demuestra con el telómero FISH, pero también se han logrado resultados exitosos con el centrómero FISH, utilizando una sonda de PNA a la misma concentración. Es posible multiplexar una sonda de centrómero marcada con FAM con una sonda de telómero marcada con Cy3, por ejemplo. Es importante enfatizar que es poco probable que el protocolo funcione con FISH de ADN de un solo locus. Para sondear un solo locus, es necesaria la digestión de la proteasa de la muestra, y esta digestión es claramente incompatible con la detección de IF o FP¹⁹. Sin embargo, se ha logrado el éxito en la combinación de IF y mRNA FISH con un enfoque similar; obviamente, el paso de tratamiento de ARNasa debe omitirse en este escenario.

Finalmente, es evidente que los telómeros nativos FISH se están convirtiendo rápidamente en un ensayo esencial para el estado de ALT^20,21. A diferencia del ensayo de círculo C para ALT, que se basa en la población²², el telómero nativo FISH proporciona una lectura de ALT a nivel celular, lo que permite la detección sensible de cambios en la dinámica de ALT. Al unir los telómeros nativos FISH con la expresión de IF y FP, se pueden revelar importantes conocimientos sobre el mecanismo ALT. Con el tiempo, esperamos que estos conocimientos conduzcan a terapias dirigidas para tumores que dependen de ALT para el mantenimiento de los telómeros.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10 % Interpolación-20	Bio-Rad	1610781	Deséchelo si la solución está turbia.
10x PBS	Gibco	70011044	Para preparar fijadores y otros tampones, utilice la fijación posterior
Placas de cultivo celular de 12 pocillos	Nunc	150628
Formaldehído al 16% sin metanol	Termocientífico	28908
5 M de cloruro de sodio	Millipore Sigma	S6546
Células adherentes, por ejemplo, células de osteosarcoma U2OS	ATCC	HTB-96
Caja hermética para cámara humidificada	Mepal	106415032500	Cualquier caja hermética adecuada funcionará, pero tenga cuidado con las cajas con fondos irregulares.
Alconox	Millipore Sigma	Z742914
papel de aluminio	Fisher Scientific	01-213-100
Medio de cultivo celular adecuado, por ejemplo, 5A de McCoy	Gibco	16600082	para U2OS, agregue un 15% de FBS
Sonda de centrómero (FAM)	Biografía de PNA	F3001	Hay varios fluoróforos disponibles
Plásmido nuclear de actina-cromocuerpo ChromoTek (TagGFP)	Tecnología de proteínas	acg-n
Forzadores de cubreobjetos	Herramientas de ciencia fina	11251-33
Bastidores de cubreobjetos	Millipore Sigma	Z688568
DAPI	Invitrogen	D21490	Opcional, en caso de que el medio de montaje no contenga una tinción de ADN
Suero de burro	Inmunoinvestigación de Jackson	017-000-121
EGTA	Bio-Mundo	40520008	0,5 m de pH de la solución 8,0
etanol	Warner-Graham	Prueba de 200
Suero fetal bovino	Gibco	A5670801
Fibronectina	Millipore Sigma	F0635	Para el recubrimiento opcional de cubreobjetos
formamida	Millipore Sigma	47671-250ML-F
Cubreobjetos de vidrio alemanes	Instrumentos Warner	64-0714	CS-18R15 (#1.5 Espesor, confirme que esto es apropiado para su microscopio)
Refuerzo de GFP	Tecnología de proteínas	gb2AF488	reconoce GFP / mClover / YFP / Venus y otros. Consulte la información del producto para obtener una lista completa
Plato de tinción de vidrio con tapa	Millipore Sigma	900203
Limpiador ultrasónico calentado con temporizador digital	Branson	CPX-952-218R	Este modelo de sonicador de baño incluye calor pero no tiene potencia ni intensidad configurables.
Ácido clorhídrico	Millipore Sigma	258148	El HCl concentrado es de 12 N. Agregue 20 ml de HCl concentrado a 220 ml de agua desionizada para obtener 1 N HCl
Solución de cloruro de magnesio	Millipore Sigma	63069	Solución de 1 M
MES	Millipore Sigma	475893
metanol	Millipore Sigma	179337
Parafilm	USA Científico	3023-4526
Cloruro de potasio	Millipore Sigma	P9541
anticuerpo primario  anti-PML de ratón	Santa Cruz	SC-377390
anticuerpo primario  conejo anti-53BP1	Novus	NB100-904
anticuerpo primario  conejo anti-PML	ABclonal	A1184
Prolongar el vidrio con NucBlue	Invitrogen	P36981
Amplificador de RFP	Tecnología de proteínas	RB2AF568	reconoce mRFP/mCherry/mKate2/mPlum.  Consulte la información del producto para obtener una lista completa
ARNasa A	Millipore Sigma	ARNea-RO
Solución de bloqueo Roche	Millipore Sigma	11096176001
anticuerpo secundario, por ejemplo, anti-ratón AF488	Invitrogen	A-11001	O similar
anticuerpo secundario, por ejemplo, AF594 anti-conejo	Invitrogen	A-11012	O similar
anticuerpo secundario, por ejemplo, antiratón AF647	Invitrogen	A-21235	O similar
espátula	Fisher Scientific	10257402
PBS estéril	Gibco	14190144	Para preparar cubreobjetos
sacarosa	Millipore Sigma	S0389
Sonda TelC (Cy3)	Biografía de PNA	F1002	Hay varios fluoróforos disponibles
Sonda TelG (AF647)	Biografía de PNA	F1014	Hay varios fluoróforos disponibles
Tris Base	Millipore Sigma	648311	Preparar 1 M de solución en agua, ajustar el pH con HCl
tritón X-100	Millipore Sigma	X100
Tripsina-EDTA (0,25%), rojo de fenol	Gibco	25200072
Microscopio Zeiss Elyra	Zeiss		O similar